PLoS ONE: Overekspression af EMMPRIN Isoform to er forbundet med hoved- og halscancer Metastase

abstrakt

ekstracellulær matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN), har et plasmamembranprotein af immunoglobulin (Ig) superfamilien, blevet rapporteret at fremme cancercelleinvasion og metastase i adskillige humane maligniteter. Men rollerne for de forskellige EMMPRIN isoformer og deres tilknyttede mekanismer i hoved- og halscancer progression fortsat ukendt. Ved brug af kvantitativ real-time PCR, fandt vi, at EMMPRIN isoform 2 (EMMPRIN-2) var det eneste isoform, der blev overudtrykt i både hoved- og halscancer væv og cellelinier, og at den var forbundet med hoved- og halscancer metastase. For at bestemme virkningerne af EMMPRIN-2 på hoved og halscancer progression, vi transficeret hoved- og halscancer celler med en EMMPRIN-2 ekspressionsvektoren og EMMPRIN-2 siRNA til eksogent modulere EMMPRIN-2-ekspression og undersøgte den funktionelle betydning EMMPRIN-2 i hoved og halscancer invasion og metastase. Vi fandt, at EMMPRIN-2 fremmet hoved- og halscancer celleinvasion, migration og adhæsion in vitro og øget lunge metastase in vivo. Mekanistiske undersøgelser afslørede, at EMMPRIN-2 overekspression fremmet sekretionen af ​​ekstracellulære signalmolekyler, herunder matrixmetalloproteinaser-2 (MMP-2), urokinase-plasminogenaktivator (uPA) og Cathepsin B, i hoved- og halscancer celler. Mens MMP-2 og uPA har vist sig at være vigtige mediatorer af EMMPRIN signalering, ikke er godtgjort rolle Cathepsin B i EMMPRIN-medierede molekylære kaskader og tumorigenese. Vi fandt, at EMMPRIN-2 overekspression og Cathepsin B nedregulering signifikant hæmmet invasionen, migrationen og adhæsion af Tca8133 celler, hvilket antyder, at Cathepsin B kræves for EMMPRIN-2 forstærket cellemigration og invasion i hoved- og halscancer. Resultaterne af vores undersøgelse demonstrerer den vigtige rolle, EMMPRIN-2 i hoved- og halscancer progression for første gang, og afslører, at øget ekstracellulær sekretion af Cathepsin B kan være en ny mekanisme bag EMMPRIN-2 forstærket tumor progression i hoved og halscancer.

Henvisning: Huang Z, Tan N, Guo W, Wang L, Li H, Zhang T, et al. (2014) Overekspression af EMMPRIN Isoform to er forbundet med hoved- og halscancer Metastase. PLoS ONE 9 (4): e91596. doi: 10,1371 /journal.pone.0091596

Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: November 4, 2013; Accepteret: 12. februar 2014 Udgivet: April 4, 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (# 81.101.592, til Z. Huang) og Guangdong-provinsen Natural Science Foundation (# S2013010014794, til Z. Huang), og ved prisuddelingen fra Flight Attendant Medical Research Institute (# 062.545, til Z. Guo) og ved tilskud fra National Natural Science Foundation of China (# 81.272.951, til J.Li). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved- og halskræft (HNC) er den sjette mest almindelige kræftform i verden [1], og er blevet mere udbredt i udviklingslandene i det seneste årti [2]. Mere end 650.000 nye tilfælde af HNC diagnosticeres hvert år på verdensplan [3], [4]. Alene i Europa cirka 143.000 nye tilfælde og større end 68.000 dødsfald på grund af sygdommen hvert år [4]. Kirurgi kombineret med kemoterapi og strålebehandling er nu accepteret som den mest effektive behandling af patienter med hoved- og hals pladecellekarcinom. Imidlertid har dødeligheden på grund af hoved- og halscancer ikke ændret sig væsentligt i de sidste 30 år, og 5-års overlevelsesraten fortsat mere end 50% [2]. Behandlingssvigt er hovedsagelig blevet tilskrevet lokalt recidiv og fjernmetastaser [5]. I øjeblikket er terapeutiske afgørelser træffes på baggrund af clinicopathologic parametre, herunder alder, tumor node metastase fase, og histologiske. Selvom nyttige, disse faktorer ofte undlader at give præcise oplysninger om de biologiske funktioner i tumorer [3]. Derfor vil indsigt i de molekylære ændringer, der er forbundet med hoved- og halscancer metastaser give kritiske indsigt i de grundlæggende mekanismer bag hoved og halscancer progression og yderligere bidrage til forbedringer i den kliniske behandling af patienter med hoved- og halscancer.

ekstracellulær matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN), også kendt som CD147 eller basigin, er et plasmamembranprotein af immunoglobulin (Ig) superfamilien og blev navngivet baseret på dets funktion til at inducere produktion af ekstracellulære matrix-metalloproteinaser (MMP’er), de vigtigste enzymer, er involveret i at bevare integriteten og omsætning af den ekstracellulære matrix (ECM) [6]. EMMPRIN deltager i en række forskellige normale celler fysiologier, herunder lymfocytrespons, kvindelige reproduktive processer, og intracellulær transport [7] – [9]. Forhøjet EMMPRIN ekspression er blevet korreleret med tumorprogression i gliomer, giant celletumorer i knoglen, larynx pladecellecarcinom, serøs ovariecarcinom og melanomer [10]. EMMPRIN fremmer udviklingen af ​​kræft ved at øge cancercelleinvasion og metastase. Den funktionelle betydning af EMMPRIN under tumorprogression er primært blevet tilskrevet dens evne til at stimulere produktionen af ​​MMP’er [8] – [10]. I tumorceller, EMMPRIN fremmer produktionen af ​​MMP-1, MMP-2, og MMP-9 og letter syntesen af ​​MT1-MMP og MT2-MMP [11] – [13]. Ud over at mediere nedbrydningen af ​​ECM, EMMPRIN spiller multifunktionelle roller i udviklingen af ​​kræft. Med op-regulering af ekspressionen af ​​VEGF og dens vigtigste receptor, VEGFR-2, i både tumorceller og endotelceller, kan EMMPRIN fremme angiogenese, som er en kritisk hændelse ikke kun under tumorvækst, men også under cancercelle metastase [14], [15]. EMMPRIN kan også fungere som en adhæsionsmolekyle og interagere med β1-integrin [16], [17]. Mange andre molekyler er blevet rapporteret at interagere med EMMPRIN, herunder caveolin-1, uPA, monocarboxylat transportører (MCT), og de CYP450-isoenzymer [18].

På grund af alternativ splejsning, mindst 4 forskellige varianter af EMMPRIN mRNA kodende forskellige EMMPRIN proteinisoformer (EMMPRIN-1 til -4) er blevet identificeret. Blandt disse fire varianter, EMMPRIN-2 er den mest rigelige isoform udtrykt i tumorceller [19]. EMMPRIN-1 koder den længste, retina-specifik isoform, som udmærker sig ved en yderligere Ig-lignende domæne (tre Ig-lignende domæner i alt) i den ekstracellulære del [20]. De to andre varianter, EMMPRIN-3 og EMMPRIN-4, blev først identificeret i humane endometriske stromale celler og cervical carcinoma cellelinier [19]. EMMPRIN-3 er den korteste isoform, der kun består af ét Ig-lignende domæne i sin ekstracellulære del [21], og den interagerer med den internaliseres EMMPRIN receptor-ligand-kompleks [19].

Vores tidligere undersøgelse identificeret EMMPRIN som et effektivt mål for immunterapi til tungen pladecellecarcinom [22]. Men de nøjagtige egenskaber ved de EMMPRIN isoformer og deres roller i initiering og progression af hoved- og halscancer fortsat ukendt. Mens EMMPRIN isoform 3 er en påvist negativ regulator i proliferation og invasion af cancerceller [23], EMMPRIN isoformer 1, 2 og 4 er blevet foreslået at spille en onkogen rolle i humane maligniteter indbefatter oral cancer. I denne undersøgelse undersøgte vi de fundamentale roller EMMPRIN isoformer i hoved- og halscancer progression. Vores resultater viser den vigtige rolle, EMMPRIN-2 og dens tilhørende mekanismer i hoved og halscancer invasion og metastase for første gang.

Materialer og metoder

1. Humane væv og cellelinier

I alt 51 par af hoved- og halscancer væv og tilsvarende tilstødende nontumorous væv blev indsamlet 2009-2011 ved Institut for Kæbekirurgi, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou, Kina. Vævsprøverne blev straks snap-frosset i flydende nitrogen efter resektion og opbevaret ved -80 ° C. Både tumorform og tilstødende nontumorous væv blev histologisk undersøgt. Skriftligt informeret samtykke blev opnået for indsamling af alle menneskelige materialer, og undersøgelsen blev godkendt af Medical Ethics Committee of Sun Yat-sen Memorial Hospital på Zhongshan University. Alle prøver blev indsamlet fra patienter forud for klinisk behandling. Kliniske funktioner i patienter blev opsummeret i tabel 1.

Tca8113 og ACCM hoved- og halscancer cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af College of Stomatologi, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina) [24 ], [25]. TSCCA celler blev venligst stillet til rådighed af Sun Yat-Sen University Cancer Center [26] og kilden til SCC25 celler blev beskrevet i vores tidligere publikation [27]. De Tca8113 og ACCM cellelinier blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), medens TSCCA3 og SCC25 cellelinier blev dyrket i DMEM (Invitrogen Carlsbad, CA). Alle medier blev suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco), blev 100 IE /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycinsulfat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og cellerne dyrkes i 37 ° C inkubatorer, der indeholder 5% CO

2 og en fugtig atmosfære.

2. Revers transkription og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra væv eller celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens anbefalede protokol. Komplementær DNA blev syntetiseret med Prime-Script RT Reagent Kit (Takara, Dalian, Kina). Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) analyser blev udført med SYBR Premix Ex-Taq (Takara). De anvendte primere er vist i tabel S1.

3. Western blotting

Cellerne blev lyseret i NP-40 lysispuffer indeholdende en proteaseinhibitor cocktail og en phosphatase-cocktail (Roche, Rotkreuz, Schweiz). Efter separation ved anvendelse af SDS-PAGE, blev proteinerne overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, USA). Efterfølgende blev membranerne blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 0,1% Tween-20 i 1 time ved stuetemperatur. Blottene blev probet med de relevante primære antistoffer natten over ved 4 ° C, vasket og probet med en artsspecifik peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Cell Signaling, Beverly, USA). En forøget kemiluminescens påvisningsmetoden (Pierce ECL Western Blotting Substrate, thermol, Beverly, MA, USA) blev anvendt til at visualisere blots. De primære antistoffer blev anvendt, var anti-EMMPRIN, anti-MMP-2, anti-uPA, anti-Cathepsin B (Santa Cruz Biotechnology, USA), og anti-β-actin (Sigma-Aldrich, MO, USA).

4. EMMPRIN-2 plasmidkonstrukter, transfektion, lentivirus produktion og etablering af stabilt udtrykke cellelinjer

EMMPRIN-2 lentiviral ekspressionsvektoren pWPXL-EMMPRIN-2 blev konstrueret ved at erstatte GFP fragment af pWPXL vektor (Addgene plasmid 12257 Didier Trono) med den kodende sekvens af EMMPRIN-2 (accession nummer NM_198589), som blev amplificeret fra den humane lever-cDNA-bibliotek under anvendelse EcoRI og BamHI kloning enzymer. Oligonukleotider blev syntetiseret til at generere annealing shRNAs at målrettet sekvensen af ​​EMMPRIN-2 fra position +430 til 449 (5′-GTCGTCAGAACACATCAAC-3 ‘) og sekvensen af ​​Cathepsin B fra position +670 til +689 (5’-GTGGCCTCTATGAATCCCA- 3 ‘). Sekvenserne af oligonukleotiderne for plasmidkonstruktionerne er anført i tabel S2. Fragmenterne blev klonet separat i pLVTHM vektoren (Addgene plasmid 12247, Didier Trono) under anvendelse Mlul- og Clal restriktionssites. Lentivirale partikler blev høstet 48 timer efter co-transfektion af pWPXL-EMMPRIN-2 eller pLVTH-shRNA med psPAX2 og pMD2.G i HEK-293T-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen). Målceller (Tca8113 og ACCM) blev transduceret med rekombinant lentivirus plus 6 ug /ml polybren (Sigma-Aldrich). Efter 2 ugers dyrkning i en 37 ° C inkubator indeholdende 5% CO

2 og en fugtig atmosfære, total RNA og proteiner blev ekstraheret, og ekspressionen af ​​EMMPRIN-2 eller Cathepsin B blev yderligere bekræftet ved hjælp af Western blot og kvantitativ RT- PCR [28].

5. In vitro migration og invasion assays

I Transwell migration assays, 2 × 10

4-celler blev udpladet på den øverste kammer af hver indsats (BD Biosciences, NJ). For invasionen assays, 1 x 10

5-celler blev udpladet på det øvre kammer af hver indsats, som var blevet overtrukket med 150 ug Matrigel (BD Biosciences, MA). Cellerne i begge assays blev trypsinbehandlet og resuspenderet i DMEM, og 700-900 pi medium, der var blevet suppleret med 10% føtalt bovint serum blev tilsat til de nedre kamre i hver brønd. Efter 12 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne tilbage i de øverste kamre eller på de øverste membraner af indsatsene forsigtigt fjernet, og de celler, der var migreret eller invaderet i de nedre kamre blev fikseret og farvet med en farveopløsning indeholdende 0,1% krystalviolet og 20% ​​methanol. De migrerende og invaderende celler blev afbildet og talt ved hjælp af en IX71 omvendt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). De samme forsøg blev udført mindst tre gange.

6. Celleadhæsionsassay

En celle adhæsion assay blev udført ifølge protokollen, der blev beskrevet i en tidligere publikation [29]. Til dette assay blev 96-brønds fladbundede dyrkningsplader overtrukket med 30 ug Matrigel (BD Biosciences, MA) i DMEM i 3 timer ved 37 ° C. Plader, der var blevet coatet med 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i 2 timer ved stuetemperatur tjente som negative kontroller. Cellerne blev høstet under anvendelse af trypsin /EDTA, vasket to gange med PBS og resuspenderet i DMEM. Celler (2,5 x 10

4) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Pladerne blev rystet ved 1.000 rpm i 30 sekunder og vasket tre gange med DMEM for at fjerne ubundne celler. De celler, der forblev bundet til pladerne blev kvantificeret ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ifølge producentens anbefalede instruktioner. Efter subtraktion af baggrund cellebindende fra BSA-coatede brønde, blev procentdelen af ​​adhærerende celler beregnes ved at dividere den optiske densitet af de adhærente celler ved den for den oprindelige celle input. Endelig blev celler, der var blevet fikseret og farvet i en farveopløsning indeholdende 0,1% krystalviolet og 20% ​​methanol afbildes under anvendelse af et IX71 omvendt mikroskop (Olympus). Alle de vedhæftning eksperimenter blev udført i tredobbelte brønde og gentaget mindst tre gange.

7. Musemodeller til in vivo-analyser af metastase

For

in vivo

analyserne af de metastatiske kapacitet af cellelinjer, hver nøgen mus (ti pr gruppe, mandlige BALB /c-nu /nu ) blev hale-intravenøst ​​injiceret med 1 x 10

6 Tca8113 celler der stabilt udtrykker EMMPRIN-2 eller Tca8113 celler, der udtrykker den tomme vektor. Musene blev aflivet efter 6 uger, og lungerne blev dissekeret, fikseret med phosphatbufret neutralt formalin og paraffin indlejret. Metastatiske foci i lungerne blev talt mikroskopisk på H 0,05 blev sat som den grad af statistisk signifikans. Alle de statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 17.0.

Resultater

1. EMMPRIN-2 er overudtrykt i hoved og hals kræft og er forbundet med hoved- og halscancer metastaser

Selvom ændret ekspression af forskellige EMMPRIN isoformer har været impliceret at spille en rolle i HNC tumorigenese, de enkelte bidrag i de forskellige EMMPRIN isoformer til initiering og progression af HNC fortsat uklare. For yderligere at belyse de roller EMMPRIN isoformer i HNC, undersøgte vi ekspressionen af ​​forskellige EMMPRIN isoformer i HNC væv og cellelinier. Ekspressionen af ​​alle 4 EMMPRIN isoformer blev først undersøgt i 12 tilfælde af orale cancer væv under anvendelse kvantitativ real-time PCR. Mens EMMPRIN isoformer 1, 2 og 4 viste relativt rigelige udtryk, EMMPRIN isoform 3 var næppe påvises i de testede orale kræft væv (Figur S1). Derfor er vores fortsatte undersøgelse fokuserede på roller EMMPRIN isoformer 1, 2 og 4 i hoved- og halscancer progression. Ekspressionen af ​​EMMPRIN isoformer 1, 2 og 4 blev yderligere analyseret i 51 HNC tumorer og deres matchede normale orale væv under anvendelse kvantitativ RT-PCR. Som vist i figur 1A, EMMPRIN-2 og EMMPRIN-4 viste sig at være de vigtigste isoformer, der blev givet udtryk for i hoved og hals væv, mens EMMPRIN-1 vises kun meget lave niveauer af udtryk. Vi observerede, EMMPRIN-2 var den eneste EMMPRIN isoform, hvor mRNA ekspressionsniveauer blev signifikant forøget i tumorerne sammenlignet med de matchede hosliggende ikke-kræft væv (Fig. 1A). Omtrentlige 2 gange stigninger (C /A, 1,90) i den gennemsnitlige EMMPRIN-2 ekspressionsniveauer blev fundet i tumorvæv i de tilstødende normale kontroller. Der blev ikke påvist signifikante forskelle i EMMPRIN-1 og EMMPRIN-4 mRNA-ekspression mellem tumorer og de tilstødende ikke-cancervæv (fig. 1A).

(A) EMMPRIN mRNA-ekspression i 51 hoved og halscancer væv og de tilstødende ikke-cancervæv blev analyseret ved anvendelse qPCR. EMMPRIN-2 mRNA-ekspression i hoved og hals tumorvæv er højere end i tilstødende ikke-kræft væv (

s

0,01). Ingen signifikante forskelle blev observeret i EMMPRIN-1 og EMMPRIN-4 mRNA-ekspression mellem tumorvæv og de tilstødende ikke-kræft væv (

s

0,05). (B) Sammenligning af EMMPRIN-2 mRNA-ekspression mellem 26 tilfælde af metastatiske tumorer og 25 tilfælde af tumorer uden nogen tegn på lokale og fjerne metastaser. EMMPRIN-2 mRNA-ekspression blev øget betydeligt i metastatiske hoved- og halscancer væv sammenlignet med ikke-metastatisk cancer hoved og hals væv (

s

0,05). (C) qPCR påvisning af EMMPRIN mRNA-ekspression i hoved og hals kræft cellelinjer. (D) Påvisning af EMMPRIN ekspression i hoved- og halscancer cellelinjer under anvendelse af Western blot. blev påvist Høje niveauer af protein kodet af EMMPRIN-2-genet i alle 4 af kræft cellelinjer.

For yderligere at bestemme sammenhængen mellem EMMPRIN-2 ekspression og progression og metastase af HNC, vi sammenlignet EMMPRIN-2 mRNA-ekspression i 26 tilfælde af metastatiske tumorer og 25 tilfælde af tumorer uden nogen tegn på lokal og fjernmetastaser. Mens marginalt forøget EMMPRIN-2-ekspression blev påvist i tumorer i forhold til de tilstødende normale væv fra patienter med ikke-metastatiske tumorer (fig. 1B), markante forskelle i EMMPRIN-2-ekspression blev observeret mellem tumorer og de normale kontrolprocedurer væv fra patienter med metastatisk tumorer (fig. 1B). Desuden EMMPRIN-2-ekspression var betydeligt højere i metastatiske tumorer end i ikke-metastatiske tumorer (fig. 1B). Ingen signifikante forskelle i køn eller alder af patienter med metastatisk og ikke-metastatiske tumorer blev fundet.

Resultater fra HNC væv blev yderligere bekræftet af analyserne i HNSCC cellelinier (ACCM, Tca8113, TSCCA og SCC25). EMMPRIN-2 og EMMPRIN-4 var de store isoformer, der blev udtrykt i alle 4 cellelinjer, og de relative ekspressionsniveauer af EMMPRIN-2 var meget højere i cancercellelinier (området fra 0,05 til 0,15, fig. 1C) end i de ikke-kræft HNC væv (der i gennemsnit ca. 0,01, fig. 1A). Høje niveauer af protein, der blev kodet af EMMPRIN-2-genet blev også påvist i alle fire kræftceller ved hjælp af western blot (fig. 1D).

2. EMMPRIN-2 fremmer hoved- og halscancer celle invasion, migration og vedhæftning in vitro, og metastase in vivo

For at bestemme de funktionelle roller EMMPRIN-2 overekspression i invasionen, migration og vedhæftning af HNC celler vi eksperimentelt overudtrykt og nedreguleret EMMPRIN-2-ekspression ved hjælp af en eksogen EMMPRIN-2 ekspressionsvektoren og siRNA (siEMMPRIN-2) i hoved og hals cellelinjer, ACCM og Tca8113. Som vist i figur 2, forøget ekspression af EMMPRIN-2 fremmet hoved- og halscancer celleinvasion, adhæsion og migration i både ACCM og Tca8113 cellelinier. I modsætning hertil eksperimentel nedregulering af EMMPRIN-2 ved anvendelse af siRNA svækket celleinvasion, migration og adhæsion i de testede cellelinjer (fig. 2A, B og C).

Eksogen overekspression af EMMPRIN-2 under anvendelse af et udtryk konstruere forbedret hoved- og halscancer celleinvasion (A), migration (B) og adhæsion (C), hvorimod nedregulering af EMMPRIN-2 ved anvendelse af siRNA (siEMMPRIN-2) undertrykt hoved- og halscancer celleinvasion (A), migration ( B) og adhæsion (C). Forskellene i celle invasion, migration og adhæsion mellem de construct- eller siRNA-transficerede grupper og mock kontroller var statistisk signifikant (

s

0,05). Virkningerne af EMMPRIN-2-ekspression på tumormetastaser in vivo blev yderligere undersøgt i nøgen musemodeller. (D) Tca8113 hoved og hals kræft cellelinjer med stabilt udtrykt EMMPRIN-2 eller en mock vektor kontrol blev intravenøst ​​injiceret i nøgne mus. Metastatiske foci i lungerne hos nøgne mus blev beregnet ved uge 6 efter injektion. Det gennemsnitlige antal metastatiske foci i lungerne fra musene med EMMPRIN-2 udtrykkende celler var 28,4 sammenlignet med 6,4 i lungerne fra musene injiceret med celler der bærer kontrolvektoren (

s Restaurant 0,01).

Vi yderligere udvidet vores in vitro-observationer til at undersøge virkningerne af EMMPRIN-2 på HNC celle metastase in vivo. Tca8113 celler stabilt overudtrykker EMMPRIN-2 eller kontrolvektoren blev intravenøst ​​injiceret i nøgne mus via halevenen. Musene blev aflivet 6 uger efter injektionerne, og lungerne blev dissekeret, fikseret med phosphatbufret neutralt formalin og indstøbt i paraffin. Metastatiske foci i lungerne hos de nøgne mus blev talt mikroskopisk på H 0,05). (B) Den mRNA-ekspression resultater blev bekræftet ved at analysere proteinekspression under anvendelse western blot. (C) Påvisning af ekstracellulær MMP-2, Cathepsin B og uPA ved anvendelse af ELISA. MMP-2, Cathepsin B og uPA sekretion i dyrkningsmediet blev forøget i celler, der var blevet transficeret med EMMPRIN-2-ekspressionsvektor, medens sekretion blev reduceret i EMMPRIN-2 siRNA transficerede celler (

s Restaurant 0,05). (D) Analyse af ekstracellulært MMP-2-aktivitet ved anvendelse af et gelatinezymografi assay. Ekstracellulær MMP-2-aktivitet blev forøget efter EMMPRIN-2-ekspression blev forbedret, mens MMP-2 aktivitet blev reduceret efter EMMPRIN-2-ekspression knockdown.

Derudover undersøgte vi de ekstracellulære niveauer af alle tre proteiner anvendelse af ELISA. De ekstracellulære niveauer af MMP-2, uPA og Cathepsin B i cellekulturmediet blev forhøjet med EMMPRIN-2 ekspressionsvektoren transfektion og blev nedsat med henholdsvis EMMPRIN-2 siRNA transfektion i både ACCM og Tca8113 celler (fig. 3C). Disse resultater antyder, at EMMPRIN-2 specifikt fremmer ekstracellulær udskillelse, snarere end udtrykket, af uPA, MMP-2 og cathepsin B i hoved- og halscancer celler. Virkningerne af EMMPRIN-2 på MMP-2 ekstracellulær sekretion blev yderligere bekræftet ved anvendelse af en gelatinezymografi assay. Som vist i figur 3D, ekstracellulær MMP-2-aktivitet steg i både ACCM og Tca8113 celler, som var blevet transficeret med EMMPRIN-2 ekspressionsvektoren, hvorimod ekstracellulær MMP-2-aktivitet faldt i de cellelinier, som var blevet transficeret med EMMPRIN-2 siRNA (fig. 3D).

4. Cathepsin B er en vigtig mediator af virkningerne af EMMPRIN-2 på invasionen, migration og vedhæftning af hoved- og halscancer celler

For at bestemme den funktionelle rolle af Cathepsin B i EMMPRIN-2-induceret invasion, migration og vedhæftning, vi nedreguleret Cathepsin B-ekspression i Tca8113 celler, der overudtrykker EMMPRIN-2 ved hjælp af Cathepsin B siRNA. Behandling med Cathepsin B siRNA resulterede i tilsvarende reduktioner i Cathepsin B mRNA og protein niveauer i både de parentale og EMMPRIN-2 overudtrykker Tca8113 celler, medens EMMPRIN-2 og MMP-2 ikke blev påvirket af Cathepsin B transfektion (fig. 4A og B). Ekstracellulær udskillelse af Cathepsin B blev også reduceret med siRNA behandling i Tca8113 celler, både i nærvær og fravær af EMMPRIN-2-overekspression (fig. 4C). Som observeret i eksperimenterne ovenfor skitserede, Tca8113 celler overudtrykker EMMPRIN-2 viste øget celleinvasion, migration og adhæsion sammenlignet med de parentale Tca8113 celler (figur 4D). I modsætning hertil nedregulering af Cathepsin B vha siRNA inhiberede signifikant invasion, migration og adhæsion af Tca8113 celler overudtrykker EMMPRIN-2 (fig. 4D), implicerer den funktionelle betydning af Cathepsin B i EMMPRIN-2-medieret signalering for tumorinvasion og . metastaser

(A) Behandling med Cathepsin B siRNA resulterede i tilsvarende reduktioner i Cathepsin B mRNA-niveauer i både EMMPRIN-2 overekspression og forældrenes Tca8113 celler (

s

0,05), mens EMMPRIN -2 og MMP-2 var upåvirket af Cathepsin B siRNA transfektion (

s

0,05). (B) Virkningerne på Cathepsin B, EMMPRIN-2 og MMP-2-ekspression efter Cathepsin B siRNA transfektion i EMMPRIN-2 overekspression og forældrenes Tca8113 celler blev yderligere bekræftet ved hjælp af western blot analyser. (C) Den ekstracellulære sekretion af Cathepsin B blev også reduceret med siRNA behandling i Tca8113 celler både i nærvær og fravær af EMMPRIN-2 overekspression (

s Restaurant 0,05). (D) Som observeret i ovennævnte forsøg, Tca8113 celler overudtrykker EMMPRIN-2 Vises øget celle invasion, migration og vedhæftning i forhold til forældrenes Tca8113 celler. I modsætning hertil nedregulering af Cathepsin B hjælp siRNA hæmmede markant invasionen, migration og vedhæftning af Tca8113 celler overudtrykker EMMPRIN-2.

Diskussion

På trods af fremskridt, der er gjort i behandlingen af ​​lokalt fremskreden hoved- og halscancer, prognosen er stadig dystre, og 5-års overlevelsen ikke overstiger 40% [34]. Lokalt recidiv og metastase er ansvarlige for størstedelen af ​​dødsfald som følge af hoved- og halscancer.