PLoS ONE: Specifik målretning af Caspase-9 /PP2A Interaktion som potentiel ny Anti-Cancer Therapy

Abstrakt

Formål

PP2A er en serin /threonin-phosphatase afgørende for fysiologiske processer, herunder apoptose . Cell gennemtrængende peptider er molekyler, der kan translokere ind i celler uden at forårsage skade membran. Vores mål var at udvikle celle-gennemtrængende fusionspeptider specielt designet til at forstyrre caspase-9 /PP2A interaktion og evaluere deres terapeutiske potentiale

in vitro

in vivo

.

Eksperimentel design

Vi genererede et peptid, der indeholder en gennemtrængende sekvens forbundet til interaktionen motivet mellem human caspase-9 og PP2A (DPT-C9h), med henblik på at målrette deres forening. Brug af tumorcellelinier, primære humane celler og primære humane brystcancer (BC) xenotransplantater, undersøgte vi kapaciteten af ​​DPT-C9h at provokere apoptose in vitro og inhibering af tumorvækst (TGI)

in vivo

. DPT-C9h blev intraperitonealt administreret i doser fra 1 til 25 mg /kg /dag i 5 uger. Relativ Tumor Volume (RTV) blev beregnet.

Resultater

Vi viste, at DPT-C9h specifikt at målrette caspase-9 /PP2A interaktion

in vitro

in vivo

og induceret caspase-9-afhængig apoptose i cancercellelinier. DPT-C9h også fremkaldt betydelig TGI i BC xenografter modeller. Muse-specifikt peptid DPT-C9 inducerede også TGI i lunge (K-Ras-model) og brystcancer (PyMT) modeller. DPT-C9h har en specifik virkning på transformerede B-celler isoleret fra kronisk lymfatisk leukæmi patienter uden nogen effekt på primære sunde celler. Endelig blev observeret hverken toksicitet eller immunogene responser.

Konklusion

Brug af celle-gennemtrængende peptider blokerende caspase-9 /PP2A interaktioner, har vi vist, at DPT-C9h havde en stærk terapeutisk virkning

In vitro

in vivo

i musemodeller af tumor progression

Henvisning:. Arrouss i, Nemati F, Roncal F, Wislez M, Dorgham K, Vallerand D, et al. (2013) Specifik målretning af Caspase-9 /PP2A Interaktion som potentiel ny Anti-Cancer Therapy. PLoS ONE 8 (4): e60816. doi: 10,1371 /journal.pone.0060816

Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA

Modtaget: 12. oktober 2012; Accepteret: 3 marts 2013; Udgivet 23. april, 2013 |

Copyright: © 2013 Arrouss et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne takker Inserm og Institut Curie for finansieringen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Apoptose er et genetisk programmeret celledød og dens deregulering er forbundet, blandt andre patologier, med cancere. Adskillige phosphataser er for nylig blevet attraktive mål for behandling af en række sygdomme, herunder cancere [1], [2], [3], [4]. Men de eneste kliniske lægemidler rettet mod en fosfatase er immunosuppresssive cyclosporin A og FK506, som hæmmer serin /threonin fosfatase 2B (calcineurin) og NFAT aktivering [5], [6], [7], [8], [9]. Men langvarig brug af disse stoffer kan føre til uønskede bivirkninger [10].

Ser /Thr phosphataser PP1 og PP2A har været impliceret både i induktionen af ​​celledød gennem 1) dephosphorylering af Bad [11 ] og caspase-9 [12] 2) stimulering af cytochrom

c

frigivelse [13], og 3) dephosphorylering af retinoblastomaproteinet [14], [15]. Men disse phosphataser meste styre phosphorylering niveau af Bcl-2 og caspase-9, som bestemmer deres funktionelle egenskaber [16], [17], [18]. Omvendt inhibering af PP1 [19], PP2A [20], eller PP2C [21] udløser celledød, hvilket indikerer også en potentiel anti-apoptotiske funktion af disse phosphataser, og peger på et komplekst samspil af phosphatase aktioner. Vi har tidligere vist en interaktion mellem caspase-9 og PP1a. I dette kompleks, aktiveres PP1a inducerer caspase-9 dephosphorylering, og som følge heraf dets aktivering fører til apoptose [12]. Vi har påvist i dette kompleks, ud over PP1αactivity, anden okadainsyre-sensitive enzymatisk aktivitet forenelig med en PP2A-aktivitet, hvilket antyder en mulig interaktion mellem caspase-9 og PP2A, der kan være involveret i celledød regulering.

Cell gennemtrængende peptider (CPP) er molekyler, som kan translokere i celler uden at forårsage skader membran, der fører til deres foreslåede anvendelse som vektorer for at levere terapeutisk gods [22]. Disse peptider kan krydse membranen og nå cytoplasmaet og /eller kernen [23]. Ved hjælp af CPP, har vi også tidligere rapporteret eksperimentelle beviser som bevis for princippet for stoffet fosfatase teknologi (DPT), [24], [25].

På dette grundlag, besluttede vi at analysere, om modulation af PP2A og caspase-9 interaktion kan have en indvirkning på induktion af tumorceller deathing uden at påvirke raske celler, og demonstrerede DPT-C9h og DPT-C9 svarende til de bindingssteder mellem mennesker og mus caspase-9 og PP2A henholdsvis har en specifik anti -tumour virkning.

Materialer og metoder

Celler og kultur

Humant Daudi, Jurkat, og HeLa-cellelinjer blev dyrket i RPMI suppleret med 10% FCS. LKR10 og LKR13 er tidligere blevet beskrevet [26] og blev dyrket i RPMI suppleret med 10% FCS. Menneskelig brystkræft (BC), uveal melanom (UM), ikke småcellet lungecancer, og små-cellet lungekræft-cellelinjer er blevet isoleret fra primære humane cancer xenografter [27], [28], [29]. De tre UM cellelinier er direkte opnået fra patienter «. BC-cellelinier blev dyrket i DMEM eller RPMI-medium suppleret med 10% til 20% af FCS, bortset HBCx-15, som blev suppleret med 10% hesteserum. UM og lungekræft cellelinier blev dyrket i RPMI suppleret med 10% eller 20% af FCS hhv. BC og UM cellelinier blev direkte isoleret fra den tilsvarende tumor. De Daudi, HeLa og Jurkat cellelinjer blev opnået fra samlingen af ​​afdelingen.

Immunopræcipitation og western blot

immunopræcipitation og western blot blev udført som beskrevet tidligere [12]. Anti caspase-9 og anti-PP2A-antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz, cellesignalering, Sigma eller Abcam. Den anti-Tim 23 og anti Cyt c blev opnået fra Transduction Laboratories.

Peptidsyntese og sekvens

Peptider blev syntetiseret som tidligere beskrevet [30].

Påvisning af apoptose ved Annexin farvning

Apoptose blev påvist ved Annexin V-FITC-farvning ifølge producentens protokol (BD Bioscience).

Caspase-9-aktivitet

Caspase-9-aktivitet blev påvist ved anvendelse af Caspase-Glo 9 kit (Promega) og ved at følge producentens protokol.

serum enzymkoblet immunosorbentassay (serum ELISA)

ELISA-test blev udført som tidligere beskrevet [31], [ ,,,0],32].

Miochondrial membranpotentiale assay

til påvisning af ændringer i mitochondriemembranpotential, vi brugte Cell Meter JC-10 assay kit efter fremstiller anbefalinger.

Cell cyklus analyse

i alt 1 × 10

6 celler blev fikseret i ethanol 70% i 1 time ved 4 ° C. Celler blev centrifugeret og vasket med farvning puffer (DPBS /2% FCS). Efter vask blev cellerne behandlet med 50 pi RNAse (1 mg /ml stamopløsning) og inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C. Celler blev farvet med 5 ug propodim iodid i 30 minutter ved stuetemperatur. Cellulær DNA-indhold blev analyseret ved FACS.

Isolering af mitokondrier fraktion

I alt 40 × 10

6 celler blev vasket med afkølet PBS. Cellepelleten blev resuspenderet i 5 volumener iskold puffer A (20 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF , 250 mM saccharose) tilsat proteaseinhibitorer. Cellerne blev sprængt i en Dounce homogenisator, blev kernerne centrifugeret (1.000 xg, 10 min, 4 ° C), og supernatanten centrifugeres yderligere (10.000 x, 10 min, 4 ° C), mitokondrie pellet blev resuspenderet i buffer A og opbevaret ved -80 ° C.

Isolering af cellepopulationer

Frisk blod fra raske donorer blev indsamlet af Etablissement Francais du Sang. Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) prøver blev opnået fra Hematology Tjeneste Pitié Salpêtrière hospitalet. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) isoleret fra patienter eller raske donorer blev opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10% FCS, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% Hepes, 1% natriumpyruvat og 1% glutamin. B-celler blev isoleret ved anvendelse af Dynal negativ isolation kit (Invitrogene). Renheden af ​​de isolerede celler nåede op til 98%. Humane lymfocytter isoleret blev farvet med anti-hCD19-AP og tidlige apoptose begivenheder blev bestemt ved hjælp af Annexin-V-FITC.

In vivo

modeller af primære humane tumorxenografter

de primære human brystcancer (BC) xenotransplantater blev opnået som tidligere beskrevet [27], [28] Mouse brystkræft tumorer blev opnået ved anvendelse af transgene

Polyoma Middle-T

Mouse PyMT model [33]. Spontant voksende mammatumorer forekommer i transgene mus blev xenotransplanteret i

nøgne

immunsvækkede mus til at tillade farmakologiske vurderinger, og vedligeholdes fra

nøgen

musen til

nøgen

mus serielt passager.

mus model af primær pulmonal adenocarcinom muteret til

K-ras

K-ras

LA1 mus blev leveret af de NCI Mouse modeller af humane cancerformer Consortium (MMHCC) (NCI Mouse Repository /NIH, Rockville, MD). De bærer en latent

K-ras

allel med to kopier af exon 1: ene var vild-type og den anden G12D mutant (Tyler Jacks). Den latente allel er stokastisk aktiveres i celler gennem homolog rekombination, hvilket resulterer i deletion af vildtype-kopi af exon 1 og ekspressionen af ​​et onkogent form af det

K-ras

gen. Multifocal lunge adenokarcinomer udvikler spontant i 100% af disse mus.

Terapeutiske analyser

For terapeutiske eksperimentelle analyser i subkutane transplanterede xenotransplantater (primære humane tumorer og PyMT tumorer), 5- til 8 uger gamle schweiziske nu /nu hunmus modtog en subkutan transplantat af tumor fragmenter med et volumen på ca. 15 mm

3 som beskrevet tidligere [29].

for terapeutiske eksperimentelle analyser i K-ras

LA1 mus blev 16-uger gamle mus randomiseret mellem kontrol (n = 17) eller behandling (n = 16) i 4 uger. Mus blev vejet en gang om ugen. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev autopsi udført for placebo eller behandlingsgrupperne og lungetumorer blev talt. Resultater udtrykkes som tumor nummer /mus, gennemsnit ± SEM.

Tumor volumen blev beregnet ved måling af to vinkelrette diametre med passere. Hver tumor volumen (v) blev beregnet efter følgende formel: V = axb

2/2, hvor a og b er de største og de mindste vinkelrette tumor diametre. Relative tumorvolumen (RTV) blev beregnet ud fra følgende formel: RTV = (Vx /V1), hvor Vx er tumorvolumen på dag X og V1 er tumorvolumen ved initiering af behandlingen (dag 1) .Growth kurverne blev fundet ved at plotte det gennemsnitlige RTV på Y-aksen mod tiden (X-aksen, udtrykt som dage efter start af behandling), Antitumoraktivitet blev vurderet i henhold til tumorvækst-hæmning (TGI), beregnes efter følgende formler: procent GI = 100 -. (RTVt /RTVc) × 100, hvor RTVt er det medium RTV af behandlede mus og RTVc er medianen RTV af kontrollen, både på et givet tidspunkt, hvor den anti-tumor effekt var optimal

DPT- C9h og DPT-C9-peptider fortyndet i vand /glucose (1 til 25 mg /kg) blev givet ved intraperitonealt rute 5 til 7 dage om ugen, i henhold til de modeller og de terapeutiske tidsplaner.

bioluminescens analyser

HBCx-12A cellelinie blev etableret fra HBCx-12A xenograft og opretholdt i RPMI suppleret med 20% føtalt kalveserum og penicillin /streptomycin. Cellerne blev transduceret med lentivirale supernatant indeholdende luciferase [19] og Ds-rød og i alt 1,9 x 10

6 celler, der udtrykker Ds-RED-Luc blev implanteret subkutant i

nøgen

mus. Vækst tumor blev måling af caliper og ved optisk billeddannelse.

Bioluminescens billeddannelse blev udført med IVIS billeddannende system (IVIS100, Caliper Life Sciences, USA). Bedøvede mus blev injiceret i.p. med luciferin ved 150 mg /kg. erhvervelse afbildningstiden var fra 1 s til 1 min, afhængigt af bioluminescens signal. Analyse blev udført ved hjælp af software Living Billede V. 2,50 (Caliper Life Sciences).

Statistiske tests

For

in vivo

eksperimenter ‘analyser, Statistisk signifikans af forskelle observeret mellem individ RTVs svarende til gruppen af ​​behandlede mus og kontrolgruppen, hvor 9-10 mus per gruppe er medtaget, blev beregnet ved en parret Students t-test [29]. For K-ras

L1 mus model bruger vi Mann Whithney test

peptider sekvens

DPT-SH1:. VKKKKIKREIKI

C9: YIETLDGILEQWARSEDL

C9h: YVETLDDIFEQWAHSEDL

DPT-C9h: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQWAHSEDL

DPC-C9: VKKKKIKREIKI YIETLDGILEQWARSEDL

DPT-C9h Mut: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQAAHSEDL

Alle peptider blev opløst på sterilt vand.

den eksperimentelle protokol og stalde var i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer som foreslået af den franske etiske komité (aftale B75-05-18, Frankrig). var nødvendig nr samtykke til denne undersøgelse. Alle operation blev udført under total zylazine /ketamin anæstesi og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Alle patienter havde tidligere givet deres informerede samtykke til eksperimentel forskning på residual tumorvæv tilgængelige efter histophatologic og cytogenetiske analyser. De CLL prøver tumorale rester og patienterne givet deres informerede samtykke. Denne forskning blev ikke udført uden for vores land. De etiske komitéer godkender denne procedure.

The finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet.

Resultater

DPT -C9h peptid blokerer caspase-9 /PP2Ac interaktion i brystcancercellelinier

Vi har tidligere fastslået bindingsstedet for mennesker og mus caspase-9 til PP2A (patent PCT-EP2010 /054.134, web site: Espacenet com eller worlwide.espacenet.com, for peptidsekvensen, se Materialer og fremgangsmåder) og tilhørende denne interaktion motiv til en celle permeabel shuttle [24], [25]. For at målrette caspase-9 /PP2Ac interaktion, besluttede vi at bruge den patenterede peptid, der indeholder den tidligere offentliggjorte gennemtrængende sekvens forbundet til stedet for interaktionen af ​​mus (DPT-C9) eller humant (DPT-C9h) caspase-9. Som kontroller genererede vi shuttle DPT-SH1 alene, peptiderne C9 og C9h, som ikke indeholdt shuttle og peptidet DPT-C9h mut, med en mutation i caspase-9 /PP2A bindende sekvens og der ikke binder PP2A (data ikke vist).

Vi var først interesseret i at bekræfte, at det specifikke mål i DPT-C9h peptid var den komplekse caspase-9 /PP2A. Til det formål har vi analyseret, om det humane peptid DPT-C9h wasable at målrette

in vivo

in vitro

caspase-9 /PP2A interaktion. For

in vivo

konkurrence, lysater fra kontrol- ubehandlede eller DPT-C9h-behandlede HBCx-12A-celler blev immunfældet med anti-caspase-9 antistof, og tilstedeværelsen af ​​den caspase-9 /PP2A kompleks blev analyseret ved western blot . Figur 1A viser, at mængden af ​​kompleks påvist i DPT-C9h-behandlede celler var stærkt reduceret i forhold til ikke-behandlede kontrolceller. På

in vitro

konkurrence-assay, lysater fra HBCx-8 celler blev immunfældet med et anti-caspase-9-antistof, og interaktionen med PP2A konkurrerede med DPT-C9h peptid (Fig 1A). PP2Ac blev påvist i kontrol-caspase-9 immunpræcipitater, mens det var næsten upåviselig efter konkurrence med 1,5 mM DPT-C9h peptid. I begge, (

in vitro

in vivo

konkurrencer), blev caspase-9 /PP2A komplekset ikke ændret af rumfærgen DPT-SH1 (figur 1B). Dette tyder stærkt på, at DPT-C9h peptid specifikt retter sig mod samspillet mellem menneskets caspase-9 og PP2Ac.

A)

In vivo

konkurrence af caspase-9 /PP2Ainteraction. Den HBCx-12A brystcancercellelinje var dyrket i 24 timer i nærvær eller fravær (kontrol) af DPT-C9h (100 uM); Cellerne blev lyseret og cytoplasmiske ekstrakter immunfældet med anti-caspase-9-antistof og immunblottet med anti-PP2Ac og anti-caspase-9-antistoffer.

In vitro

konkurrence af caspase-9 /PP2A interaktion. Cytoplasmatiske lysater fra HBCx-12A-celler blev immunfældet med anti-caspase-9-antistof; caspase-9 /PP2Ac interaktion blev konkurreret

in vitro

med 1,5 mM DPT-C9h peptid i 30 minutter ved stuetemperatur; immunpræcipitater blev vasket og immunblottet med anti-PP2Ac og anti-caspase-9, sidstnævnte som intern kontrol af protein loading. B) Den HBCx-12A-cellelinje blev dyrket i nærvær eller fravær (kontrol) af rumfærgen DPT-SH1 (100 uM) i 24 timer og

in vitro

in vivo

konkurrence af caspase-9 /PP2A interaktion blev analyseret som ovenfor.

de gennemtrængende peptider DPT-C9 og DPT-C9h fremkalde artsspecifikke apoptose

Vi analyserede evne til to gennemtrængende peptider DPT-C9h og DPT-C9, såvel som den negative kontrol peptider C9, C9h og DPT-SH1 til at fremkalde apoptose. Som vist i figur 2A, DPT-C9h induceret apoptose, som påvist ved Annexin-V farvning i humane Daudi, Jurkat, og HeLa-cellelinjer upon 20 timer af behandlingen, mens C9 og C9h peptider uden shuttle og rumfærgen alene, ikke inducere apoptose i humane cellelinier. Tilsvarende havde DPT-C9h peptid, som ikke har nogen apoptotisk virkning på muselunge cancercellelinier LKR10 og LKR13, mens peptidet DPT-C9, specifik for muse caspase-9, induceret apoptose i begge cellelinier efter 24 timers behandling ( fig 2B). Desuden har vi ikke observere nogen apoptotisk virkning på behandling af cellelinjer med rumfærgen (Fig 2B). Det basale niveau af apoptose i ikke-behandlede kontrolceller er også vist. Disse resultater understøtter kraftigt artens specificitet for både DPT-C9 og DPT-C9h peptider.

A) Daudi, Jurkat, og HeLa-cellelinjer blev dyrket i nærværelse af DPT-C9h, DPT-SH1, C9h, eller C9-peptider i 20 timer ved 100 uM og apoptose blev estimeret ved Annexin-V-farvning. B) Mouse lungecancer cellelinier LKR10 og LKR13 blev dyrket i nærvær af DPT-C9h, DPT-C9 eller DPT-SH1 ved 100 uM. Efter 24 timers inkubation blev apoptose estimeret ved Annexin farvning. Det basale niveau af apoptose af kontrol ikke-behandlede celler er vist. P-værdier er også vist (* 0,05; ** 0,001; *** 0,0001). C) Breast, uveal melanom og lungekræft cellelinier isoleret fra primære humane xenografs blev dyrket i nærvær eller fravær af DPT-C9h peptid (100 uM) i 24 timer og apoptose blev estimeret ved Annexin V-FITC. Basalniveau af apoptose uden peptid tilsætning vises (grå farve) p-værdier er vist. D). Brystcancercellelinier afledt fra primære humane xenotransplantater, blev inkuberet med C9h i dyrkningsmedium ved 150 uM og apoptose induktion blev anslået til forskellige tidspunkter. E) brystcancercellelinier isoleret fra primære humane xenotransplantater BcX-3 og BcX-12 blev dyrket i nærvær eller fravær (kontrol) af peptidet DPT-C9h i 24 timer og apoptose blev estimeret.

Brug de menneskelige bryst, uveal melanom, ikke-småcellet lungekræft og småcellet lungecancer cellelinier opnået fra primære humane xenograftmodeller, testede vi apoptotiske effekt af både DPT-C9h og C9h peptider. Apoptose blev også analyseret i kommercielle brystcancercellelinier. I alle analyserede cellelinier, DPT-C9h induceret apoptose, mellem 20 og 75% efter 24 timers dyrkning (fig 2C), mens ingen virkning blev observeret efter C9h behandling af brystkræft cellelinier (fig 2D). Den apoptose af kontrol- ikke-behandlede celler varierede fra 3 til 8%. Supplerende tilsætning af DPT-C9h peptid 27T efter den indledende behandling kraftigt øget niveau af apoptose (data ikke vist). Figur 2E viser to repræsentative apoptose histogram plots af to cellelinier isoleret fra human brystcancer xenograft HBCx-3 og HBCx-12A modeller behandlet 24 timer med eller uden (kontrol) DPT-C9h peptid. Tilsammen viser disse resultater en stærk

in vitro

antitumorale virkning af DPT-C9h peptid i forskellige humane cellelinjer.

Hæmning af caspase aktivitet blokerer apoptotiske virkning af DPT-C9h

Eftersom initiator caspase-9 er en vigtig mediator af apoptose, analyserede vi evnen hos DPT-C9h at aktivere caspase-9 i human brystcancer cellelinje HBCx5. Celler blev inkuberet med peptidet og caspase-9-aktivitet blev estimeret på forskellige tidspunkter. Vi har observeret en stigning i caspase-9-aktivitet i DPT-C9h behandlet cellelinje (figur 3A). Lignende resultater blev opnået under anvendelse af cellelinjer af uveal melanom og ikke-småcellet lungecancer (data ikke vist). Endvidere betyder anvendelsen af ​​caspaseinhibitoren Z-VAD observerede vi et fald i caspase-9-aktivitet. Salg

A) HBCx-3-celler blev dyrket i 3 eller 6 timer med medium (kontrol), 100 uM af DPT- C9h eller 10 uM caspaseinhibitoren Z-VAD (præ inkubering af 1h) og 100 uM af DPT-C9h. Caspase-9-aktivitet blev estimeret ved anvendelse af en luminogent substrat. Resultater er repræsenteret i forhold til kontrol ikke-behandlede celler som arbitrære enheder. P-værdier er vist. B) HBCx-3-celler blev dyrket i 24 timer med medium (kontrol), DPT-SH1 (100 uM), DPT-C9h (100 uM) eller Z-VAD (10 uM, præ inkubering af 1h) og DPT-C9h ( 100 uM). Apoptose blev vurderet ved Annexin-V-FITC-binding. C) HBCx-3-celler blev behandlet i forskellige tidsrum med DPT-C9h (100 uM) og derefter inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C beskyttet mod lys med fluorescerende probe JC-10. Grøn og rød fluorescens blev målt. Data er repræsenteret i forhold til kontrollen ikke-behandlede celler. P-værdier er vist. D) HBCx-12A og HBCx-3 cellelinier blev behandlet i 24 timer med 100 uM af DPT-C9 h. Mitochondriefraktionen blev separeret fra helcellelysater og immunoblottedes for cytochrom

c

. Den WB blev også hybridiseret med mitokondrie markør Tim23 som intern kontrol af protein lastning. E) HBCx-3-celler var ikke-behandlede (kontrol) eller behandlet med 10 eller 25 uM DPT-C9h i 24 eller 48 timer, og cellecyklussen blev analyseret ved FACS.

For at bestemme om aktiverede caspase-9 er involveret i den apoptotiske virkning af DPT-C9h analyserede vi effekten af ​​caspaser inhibitor Z-VAD cell apoptose detekteret ved annexin-V-FITC-binding. Som vist i fig 3B, caspaseinhibitoren reducerer markant apoptose induceret af peptidet. Behandling af cellerne med rumfærgen eller alene inhibitoren ikke inducere apoptose (Fig 3B).

DPT-C9h inducerer mitochondriemembran depolarisering og cytochrom

c

frigivelse uden at påvirke cellecyklus

for at karakterisere DPT-C9h-induceret apoptose, undersøgte vi inddragelse af mitokondrier. I en fluorescens-baseret assay, at eksponeringen af ​​HBCx-5 celler-peptid inducerede et markant fald af mitokondriemembranen potentiale (fig 3C). For at bekræfte rolle mitokondrier i DPT-C9h-induceret apoptose, vi analyseret, om DPT-C9h behandling induceret cytokrom

c

frigivelse. Brug af mitokondrielle proteiner fra kontrol ikke-behandlede eller peptid-behandlede celler, vi observerede frigivelse af cytochrom

c

fra mitokondrierne i DPT-C9h behandlede celler, mens i ikke-behandlede kontrolceller, cytochrom

c

tilbageholdes i den mitokondriske fraktion (fig 3D). Forholdet mellem cytochrom

c

/Tim 23 anvendes som intern kontrol for normalisering og kvantificering af mængden af ​​frigivet Cyt

c.

Disse resultater bekræfter mitokondrie konsekvenser i DPT-C9h-induceret apoptose .

Endelig har vi analyseret, om DPT-C9h peptid kunne blande sig i cellecyklus sekvens. Celler var ikke-behandlede (kontrol) eller behandlet med forskellige doser af peptid for forskellige tidsperioder og cellecyklusfordeling blev analyseret (fig 3E). Brug

in vitro

sub-apoptotiske dosis af peptid, viste vi, at DPT-C9h ikke inducerede akkumulering af tumorceller i enhver fase af cellecyklus, uanset anvendte koncentration og tid analyseret (figur 3E).

DPT-C9h har effekt på tumorale celler, men ikke på raske celler

Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) er karakteriseret ved ophobning af monoklonale B-celler CD5 + i bloddannende organer, hvilket afspejler en defekt i apoptose. For at evaluere den apoptotiske virkning af DPT-C9h peptid i primære raske og tumorceller af lignende oprindelse, anvendte vi mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) fra raske donorer og kronisk lymfatisk leukæmi patienter (CLL). PBMC fra raske donorer eller CLL-patienter blev behandlet i 3 timer med DPT-C9h peptid, vasket, resuspenderet i komplet medium uden peptid i 6 timer og derefter analyseret for apoptose. Figur 4A viser, at DPT-C9h har en apoptotisk effekt på B-celler fra CLL-patienter, men ikke på B-celler fra raske donorer i forhold til at styre ikke behandlede celler. DPT-C9h har ingen effekt på T, NK og monocytter fra raske donorer eller CLL-patienter. Shuttle DPT-SH1 eller C9h peptider alene havde ingen virkning (data ikke vist). Endelig blev observeret en lignende pro-apoptotiske effekt af DPT-C9h peptid, når B-celler blev isoleret fra knoglemarv fra CLL-patienter (fig 4B). Dette resultat tyder stærkt på, at kun tumor B-celler påvirkes af DPT-C9h behandling uden nogen effekt på celler fra raske donorer, hvilket understreger den specifikke tumor-effekt af DPT-C9h.

A) Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra raske donorer eller CLL-patienter blev dyrket i nærvær af DPT-C9h (150 pM) i 3 timer, derefter vasket, overført til komplet medium og apoptose blev estimeret 6h senere. Udvælgelse af B-celler blev udført ved anti-CD19-antistof før Annexin V-FITC-farvning. Ikke-behandlede celler blev anvendt som kontrol. B) Celler isoleret fra knoglemarv fra CLL-patienter og raske donorer blev behandlet som i A og analyseret for apoptose. P-værdier er vist.

Mangel på immunogen aktivitet og

in vivo

toksicitet DPT-C9h og DPT-C9-peptider

I betragtning af at vores endelige interesse er at bevise en anti-tumor effekt af DPT-C9h på humane kræftformer, besluttede vi at analysere

in vivo

immunogen aktivitet af peptidet.

Nude

immundefekte T-celle mus blev behandlet fem dage om ugen i 6 uger ved intraperitoneal injektioner af DPT-C9h. Sera blev opsamlet på forskellige tidspunkter og produktionen af ​​antistoffer rettet mod DPT-C9h eller DPT-SH1 blev analyseret. Ved hjælp af ELISA-test, vi ikke registrere nogen i antistoffer mod DPT-C9h eller DPT-SH1 hele analyseret på to forskellige doser af peptid (Fig 5A) kinetisk. Tilsvarende blev antistofresponset også analyseret under anvendelse immunkompetente mus, hvilket igen viser manglende produktion af antistoffer hverken mod DPT-C9h eller DPT-SH1 peptider (Fig 5B). Dette resultat tyder kraftigt, at DPT-C9h peptid er immunogen selv efter forlænget

in vivo

administration i immunkompetente eller immunodefficient musemodeller.

A) Serumantistoffer taget fra nøgne mus behandlet for forskellige perioder af tid blev detekteret ved ELISA ved to forskellige koncentrationer af DPT-C9h peptid (10 og 50 uM). B) Serum antistoffer fra vilde mus typen behandlet for forskellige perioder for tiden blev testet ved ELISA mod DPT-C9h og DPT-SH1 (50 uM). C) DPT-C9h blev administreret intraperitonealt i mus med tumorer HBCx-12A ved 1, 5 eller 25 mg /kg en gang dagligt i 5 uger; medianen vægt af mus for hver forsøgsgruppe er repræsenteret på forskellige tidspunkter. I alt 10 mus blev inkluderet per gruppe. Tilsvarende blev DPT-C9h administreret intraperitonealt i mus med tumorer HBCx-8 med 10 mg /kg to gange dagligt i 4 uger. DPT-C9 blev IP administreres ved musemodel PyMT model på dosis på 5 mg /kg. Median vægt af mus for hver forsøgsgruppe er repræsenteret på forskellige tidspunkter. Ti mus blev inkluderet per gruppe.

Før

in vivo

terapeutisk vurdering blev toksiciteten af ​​DPT-C9h evalueret i mus bærende HBCx-8 og HBCx-12A tumorer efter forskellige tidsplaner administration, dvs. intraperitoneale injektioner på 1, 5 eller 25, mg /kg en gang dagligt, eller 10 mg /kg to gange dagligt i 4 til 5 uger. Uanset dosen, vi ikke observeret nogen bivirkninger i alle behandlede mus, såvel som en komplet vægt stabilitet af behandlede mus (figur 5C). Desuden blev der ikke observeret nogen dødsfald under hele forsøget. Endelig, for at bekræfte fravær af toksicitet af musen specifikt peptid, vi evaluerede tolerabilitet af DPT-C9 peptid administreret ved 5 mg /kg én gang dagligt i den transgene

Polyoma Middle-T

Mus PyMT (Fig 5C) . I alle eksperimenter blev ingen bivirkninger, herunder vægttab observeret.

DPT-C9h og DPT-C9 fremkalde

in vivo

hæmning tumorvækst i lunge- og brystkræft modeller

for at først bekræfte

in vivo

induktion af artsspecifikke apoptose, vi vurderede effekten af ​​DPT-C9 peptid i K-ras

LA1 adenocarcinom musemodel og i transgene

Polyoma Mellemøsten -T

Mus (PyMT). Indgivet intraperitonealt i en dosis på 5 mg /kg i 5 dage /7 i 4 uger, DTC-C9 inducerede et signifikant fald i lunge tumorbelastning som antallet af tumorer per mus var 24,6 ± 2,8 (middelværdi ± SEM) i placebogruppen sammenlignet med 15,4 ± 1,9 i den behandlede gruppe (p = 0,01) (fig 6A). Figur 6B viser den histologiske analyse af lungevæv fra kontrol og DPT-C9h-behandlede repræsentative mus. Desuden

Nude Salg mus bærende xenotransplanterede mus PyMT brysttumorer blev behandlet intraperitonealt med musen-specifikke DPT-C9-peptid i en daglig dosis på 5 mg /kg. Trods en meget hurtig spontant tumorvækst, DPT-C9 inducerede betydelig TGI på 46% (p 0,03) (Fig 6C). Den relative tumorvolumen (RTV) blev beregnet som beskrevet detaljeret i Materialer og Metoder.

A) Peptidet DPT-C9 blev administreret IP ved 5 mg /kg en gang daglig, 5 dage om ugen i 4 uger i K-Ras

LA1 adenocarcinom musemodel, der viser et signifikant fald i lunge tumorbyrde sammenlignet med kontrol formulere vehikelbehandlede mus (p = 0,01). B) Histologisk analyse af lungetumorer kontrol behandlet kun med formulering køretøjet og DPT-C9-behandlede mus. C) DPT-C9 blev administreret IP som for K-Ras

LA1 model i mus, der bærer xenotransplanterede mus PyMT brysttumorer, med en betydelig TGI på 46% efter 11 dages behandling sammenlignet med kontrolmus behandlet med formulering køretøjet.