PLoS ONE: lysophosphatidsyre Forhøjer karendotelvækstfaktor-C-ekspression i human prostatacancer PC-3 Cells

abstrakt

Klinisk tyder på, at lymphangiogenese og lymfe metastase er vigtige processer i udviklingen af ​​prostatacancer. Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) -C blev vist at være en vigtig regulator i disse processer. Vores tidligere undersøgelser viste, at lysophosphatidsyre (LPA), en lav-molekylvægt lipid vækstfaktor, forbedrer VEGF-C-ekspression i humane endotelceller. Vi har tidligere vist, at LPA-receptoren spiller en vigtig rolle i lymfe udvikling i zebrafisk embryoer. Imidlertid er virkningerne af LPA på VEGF-C-ekspression i prostatacancer ikke kendt. Heri, viser vi, at LPA opreguleret VEGF-C-ekspression i tre forskellige human prostatacancer-cellelinier. I PC-3 humane prostatacancerceller blev de forbedrer virkningerne af LPA medieres gennem både LPA1 og LpA3. Desuden blev reaktive oxygenarter (ROS) produktion og linsen epitel-afledt vækstfaktor (LEDGF) ekspression involveret i LPA

1/3-afhængig VEGF-C-ekspression. Endvidere autotaxin (ATX), et enzym ansvarligt for LPA syntese, deltager også i regulering af VEGF-C-ekspression. Ved at afbryde LPA

1/3 af PC-3, konditioneret medium (CM) -induceret humane navlevene endotelceller (HUVEC) lymfatiske markører ekspression blev også blokeret. Sammenfattende fandt vi, at LPA øger VEGF-C udtryk gennem aktivering LPA

1/3, ROS-, og LEDGF-afhængige veje. Disse nye fund kan potentielt belyse udvikle nye strategier til forebyggelse lymfatiske metastase af prostatacancer

Henvisning:. Lin C-E, Chen S-U, Lin C-C, Chang C-H, Lin Y-C, Tai Y-L, et al. (2012) lysophosphatidsyre Forhøjer karendotelvækstfaktor-C ekspression i humane prostatacancer PC-3-celler. PLoS ONE 7 (7): e41096. doi: 10,1371 /journal.pone.0041096

Redaktør: Masuko Ushio-Fukai, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: April 9, 2011; Accepteret: 21 Juni 2012; Udgivet: 20 juli 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev støttet af tilskud (NSC97-2311-B-002-002-MY3, NSC 99-2120-M-002 til 004 og NHRI 101-EX101-10130BI) fra National Science Rådet og de nationale Health Research Institutes i Republikken Kina . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er en af ​​de hyppigst forekommende kræftformer hos mænd. Progressionen af ​​højt metastatisk prostatacancer involverer processer såsom tab af celleadhæsion, forøget lokal invasion, angiogenese, og lymfangiogenese [1]. Lymfangiogenese blev for nylig vist sig at spille en vigtig rolle i prostatacancer metastaser, og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) -C er en stor lymfangiogene regulator. VEGF-C binder til VEGF-receptor (VEGFR) -3 og aktiverer lymfangiogenese-associeret signalveje [2]. Meget klinisk evidens viste en korrelation mellem VEGF-C-ekspression og regionale lymfeknudemetastaser i prostatacancer [3], [4]. Over-udtrykkende VEGF-C i LAPC-9 prostatacancerceller forbedret tumor lymfatisk metastase [5]. I CWR22Rv-1 prostatacancer-cellelinie, celler overudtrykker VEGF-C hyppigere metastaseret til lymfeknuder og lunger. Imidlertid blev hastigheden af ​​tumorvækst og angiogen adfærd ikke påvirket af overekspression af VEGF-C [6]. Wu et al. i 2008 viste også, at en VEGF-C ligand fælde og VEGFR-3-antistof signifikant reduceret prostatakræft lymfangiogenese og metastase til lymfeknuder og distale organer. Alle disse resultater antyder, at lymfangiogenese medierer prostatakræft metastase.

lysophosphatidsyre (LPA) er en lav molekylvægt lipid vækstfaktor, som binder til Edg familie G-protein-koblede receptorer (GPCR’er) og regulerer multiple cellulære funktioner [7], [8]. LPA syntetiseres ved enzymatisk spaltning af membran phosphatidinsyre. Når et inflammatorisk respons udløses, LPA frigives fra blodplader og inducerer multiple cellulære reaktioner såsom cellemigration, proliferation og sårheling [9]. Desuden kræftceller-udtrykkende LPA-receptorer også udviste øget tumorinvasion og metastase [10]. Omskiftningen ekspression af LPA

1 og LPA

3 receptorer findes at være associeret med prostatacancer udvikling [11]. I prostatacancer-cellelinie, LPA stimulerer PC-3-celler motilitet gennem LPA

1 [12]. Desuden LPA beskytter PC-3 af sult-afledte apoptose gennem en nuklear faktor (NF) -κB-afhængige vej [13]. Alle disse resultater antyder, at LPA spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer.

autotaxin (ATX) er et 125 kDa glycoprotein, som hører til ectonucleotide pyrophosphatase /phosphodiesterase (ENPP) -familien, som har evnen at hydrolysere phosphodiesterbindinger

in vitro

. Desuden blev ATX også rapporteret at besidde lysophospholipase D (LysoPLD) enzymatisk funktion, hvilket hydrolyserer lysophosphatidylcholin (LPC) for at generere LPA [14], [15]. I ATX-over-udtrykkende transgene mus, brystepitel er tilstrækkelig til at initiere tumorigenese og generere meget metastatisk cancer [16]. Derudover i kliniske undersøgelser prostatacancer, høje ekspressionsniveauer af ATX blev forbundet med både maligne potentialer og dårlige resultater [17].

Det blev rapporteret, at efter serum deprivation, VEGF-C messenger (m) RNA-ekspression af cancerceller blev styrket ved behandling med 10% serum. Disse resultater antyder, at der er et serum faktor regulering af ekspressionen af ​​VEGF-C [18]. Hertil kommer, efter at vælte zLPA

1 i zebrafisk, embryonale thorax kanal udvikling var defekt [19]. I humane navleveneendotelceller (HUVEC’er), kan LPA fremkalde rør dannelse og lymfe markør udtryk gennem LPA

1/3 [20], [21]

. Disse resultater antyder, at LPA-afledte signaler er nødvendige for lymfatiske udvikling fartøj. Men roller LPA i lymfangiogenese induceret af kræftceller fortsat usikre.

I vores aktuelle resultater, viser vi, at LPA opreguleret VEGF-C mRNA i forskellige humane prostata cancer cellelinjer. Ved at bruge en LPA

1/3 antagonist, viste vi, at disse forbedrer effekter i PC-3 celler var LPA

1 og LPA

3 afhængige. Desuden ROS-generering og transkriptionsfaktoren, linse epitel-afledt vækstfaktor (LEDGF), var involveret i LPA regulering af VEGF-C-ekspression. ATX, et enzym ansvarligt for LPA generation, også reguleret VEGF-C-ekspression og sekretion. Brug af HUVEC’er, viser vi, at konditionerede medier (CM) fra PC-3-celler forøgede ekspression af lymfatiske markører, såsom Prox-1 og Lyve-1. Desuden forbehandling med Ki16425, LPA

1/3 antagonist blokerede forbedrer virkninger af disse CM. Vores resultater antyder, at LPA og ATX regulere VEGF-C-ekspression i prostatacancerceller og det kan føre til lymfatiske metastaser. Derfor kan blokaden af ​​LPA og VEGF-C-signalering være en effektiv strategi for prostatakræft behandling.

Resultater

LPA Stimulerer VEGF-C Expression i forskellige Prostata Cancer Cell Lines

for at undersøge om LPA er en stimulator for VEGF-C-ekspression i prostatacancer, valgte vi LNCaP, DU145, og PC-3 human prostatacancer-cellelinier til at teste muligheden. LNCaP er en androgen-afhængig og lav metastatisk prostatacancer-cellelinie. I modsætning hertil DU145 og PC-3 er begge androgen-uafhængig og stærkt metastatisk. Alle tre cellelinjer blev behandlet med forskellige koncentrationer af LPA, og RNA-prøver blev indsamlet. Fra det realtids-PCR-analyse, fandt vi, at LPA stimuleret VEGF-C transkription på en dosis-afhængig måde i alle tre prostatacancercellelinjer (Fig. 1A-C). Vi brugte PC-3 celler til yderligere at analysere, om LPA øger VEGF-C protein-ekspression og efterfølgende sekretion. For at bestemme det translationelle niveau af VEGF-C blev PC-3-celler behandlet med LPA, og cellelysater blev opsamlet ved anvendelse af RIPA buffer. Cellelysater blev opløst med SDS-PAGE og påvist med et VEGF-C-antistof. Intracellulære VEGF-C-protein-niveauer blev styrket ved 1 og 5 uM LPA behandlinger (fig. 1d). Til bestemmelse VEGF-C-sekretion, blev PC-3-celler behandlet med 5 pM LPA i 12 timer, og konditionerede medier blev opsamlet. Det konditionerede medium blev analyseret ved et VEGF-C ELISA-kit. Vi fandt, at LPA også stimulerer VEGF-C-sekretion (fig. 1E).

LPA-forstærket VEGF-C Expression medieres gennem LPA

1 og LPA

3 i PC-3 celler

I prostatacancerceller, LPA-receptorer 1-3 ekspressionsprofiler er godt undersøgt og menes at associere med prostatacancer udvikling og progression. Men i forskellige prostatacancer-cellelinier, profiler af forskellige LPA-receptorer er forskellige. PC-3 celler udtrykker den højeste LPA

1-ekspression niveau og det laveste LPA

3 udtryk niveau, mens forhold til LNCaP og DU145. I modsætning hertil LNCaP-celler udtrykker det højeste niveau af LPA

3 og det laveste niveau af LPA

1 blandt de tre prostata cancercellelinier [11]. I vores tidligere undersøgelse, LPA

1/3 er ansvarlig for LPA forbedret VEGF-C-ekspression i HUVEC-celler [20]. Således har vi først brugt Ki16425, en antagonist for LPA

1 og LPA

3, for at bestemme om disse to lysophosphatidic receptorer er ansvarlige for LPA effekt på VEGF-C-ekspression i prostatacancerceller. I tidligere undersøgelse har Ki16425 allerede vist sig at være i stand til at blokere ATX induceret motilitet i PC-3 celler [12]. Efter Ki16425 behandling blev forstærkende virkning af LPA på VEGF-C-ekspression faldt betydeligt i LNCaP, DU145 og PC-3-celler (fig. 2A). For yderligere at bekræfte observationen blev PC-3-celler transient transficeret med enten LPA

1 eller LPA

3 siRNA. LPA1-3 udtryk profil blev testet i LPA1 og LpA3 forbigående knockdown celler. Vores resultater foreslog siRNA sekvens vi valgte kunne specifikt mål LPA

1 og LPA

3-receptoren uden at afbryde de to andre receptorer (fig. 2B). Under 10% FBS i RPMI kultur, basale mRNA-niveauer af VEGF-C i LPA

1 eller LPA

3 Knockdown celler blev begge reduceret med 51% og 37% separat. I RPMI kun kultur, basale mRNA-niveauer af VEGF-C i LPA

1 eller LPA

3 Knockdown celler blev begge reduceret med 58% og 36% sammenlignet med scrambled siRNA transfektion kontrolceller (fig. 2C). Dette indebærer, at LPA er en vigtig inducer af VEGF-C i serum. Endvidere kan celleafledt LPA også være en regulator for VEGF-C i PC-3-celler. Ved direkte behandling med LPA, vi også observeret, at LPA-forstærket VEGF-C ekspression blev formindsket i PC-3-celler transient transficeret med enten LPA

1 eller LPA

3 siRNA (fig. 2D). Resultaterne antydede, at både LPA

1 og LPA

3 er involveret og kritisk i at kontrollere VEGF-C-ekspression

. Desuden er der betydelige forskelle mellem væksten i LPA

1, LPA

3 Knockdown celler og kontrol celler under LPA og serum behandling (fig. S1).

(A, B og C ) The LNCaP, DU145 og PC-3 human prostatacancer-cellelinier blev behandlet med forskellige LPA doseringer i 2 timer. mRNA blev revers-transkriberet og analyseret ved en real-time PCR. Det relative niveau af VEGF-C normaliseret til GAPDH vises. (D) PC-3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af LPA i 4 timer. Cellelysater blev opløst ved 12% SDS-PAGE og analyseret med Western blotting under anvendelse af et anti-VEGF-C-antistof. GAPDH tjente som lastning kontrol. (E) PC-3-celler blev behandlet med 5 pM LPA i 12 timer. Det konditionerede medium blev opsamlet og målt med en VEGF-C ELISA-kit. * Statistisk forskellig i forhold til køretøjet-inkuberet prøve behandlet med LPA (*

p

0,05).

(A) LNCaP, DU-145 og PC-3 celler behandlet med 10 pM Ki16425, en antagonist af LPA

1 og LPA

3, efterfulgt af 5 uM LPA i 2 timer (L5: 5 uM LPA). Relative VEGF-C mRNA-niveauer blev målt. (B) PC-3-celler blev forbigående transficeret med LPA

1 og LPA

3 siRNA. (C) Det basale VEGF-C mRNA-ekspression af PC-3-celler transficeret med LPA

1 eller LPA

3 siRNA blev målt i en 10% FBS og ingen serum konditioneret cellekultur. (D) PC-3-celler transficeret med LPA

1 og LPA

3 siRNA blev behandlet med LPA, og VEGF-C-mRNA blev målt. mRNA blev revers-transkriberet og analyseret ved en real-time PCR. De relative niveauer af VEGF-C normaliseret til GAPDH og β-actin er vist. * Statistisk forskellig i forhold til køretøjet-inkuberet prøve behandlet med LPA (*

s

0,05; **

s

0,01; ***

s

0,05)

LPA medierer

1/3 VEGF-C Expression gennem præparaterne. LEDGF

Lens epitel-afledt vækstfaktor (LEDGF /p75) blev identificeret som en stress-respons protein induceret af serum-berøvet sult, termisk belastning, og oxidativ stress [24], [25]. I prostatacancer, blev LEDGF yderligere identificeret som et lægemiddel-resistent gen til svækkelse Docetaxel-induceret caspase og lysosomale pathways [26]. For nylig blev oxidative- og termisk stress-induceret VEGF-C transkription fundet at være medieret af LEDGF i lungecarcinom [22]. Desuden er gonadotropin-reguleret lymfangiogenese også medieret af LEDGF-induceret VEGF-C-ekspression i ovariecancer [27]. Så vi den hypotese, at LPA-induceret VEGF-C-ekspression medieres gennem LEDGF. Vores resultater viste, at LPA-induceret LEDGF mRNA og proteinekspression (fig. 4A, 4B). Desuden vores resultater viste, at LPA-induceret LEDGF mRNA er forbigående og hurtigt faldt. Resultaterne kraftigt antydet, at et post-transskription mekanisme også kan være involveret i opretholdelse LPA-induceret LEDGF proteinekspression niveau. Forbehandling med Ki16425 og NAC fuldstændigt blokeret de forbedrer virkningerne af LPA på LEDGF udtryk (fig. 4C, 4D), hvilket tyder på inddragelsen af ​​LPA

1/3 receptorer og ROS. Desuden blev LEDGF siRNA transficeret i PC-3-celler for at bekræfte, om LEDGF er involveret i LPA-induceret VEGF-C-ekspression (fig. 4E). Resultater viste klart, at LEDGF kræves der skal øge effekten af ​​LPA på VEGF-C-ekspression (fig. 4F).

PC-3-celler blev behandlet med LPA og mRNA (A) og protein (B) ekspressionsniveauer af LEDGF blev bestemt. LEDGF proteinm blev opsamlet efter 2 timer LPA behandling. Forbehandling med 10 pM Ki16425 og 10 mM NAC i 1 time undertrykkes virkningerne af LPA (L5: 5 uM LPA) på LEDGF ekspression (C og D). LEDGF siRNA blev transficeret i PC-3 celler (E) og undertrykte LPA virkninger på VEGF-C-ekspression (F). mRNA blev revers-transkriberet og analyseret ved en real-time PCR. De relative niveauer af LEDGF og VEGF-C normaliseret til GAPDH er vist. * Statistisk anderledes i forhold til køretøjets-rugede prøver behandlet med LPA (*

s

0,05; **

s

0,01; ***

s

0,001).

Blokering af LPA

1/3 Receptor og Knockdown af ATX Expression Reducer VEGF-C Transskription og sekretion af PC-3 Celler

LPA er stærkt beriget med serum og blodplader; imidlertid mange rapporter vist, at brystcancer, gliom, og prostatakræft kan selv syntetisere LPA og fremme tumorprogression [28], [29], [30]. ATX er en lysoPLD-hydrolyserende LPC som genererer LPA. LPA udskilles af ATX øger invasionsevne og progression af brystcancer. I gliomer, lysoPLD aktivitet af ATX fremmer også kræft celleadhæsion og invasionsevne. Baseret på disse tidligere rapporter, blev vi forsøger også at afgøre, om prostatacancerceller syntetiseret ATX kunne selv at regulere VEGF-C-ekspression. Derfor blev PC-3-celler dyrket i RPMI-1640-medium kun at undgå et serum effekt. Ved at blokere LPA

1/3 med Ki16425 blev basal VEGF-C-mRNA (fig. 5A) og udskillelse (fig. 5B) i PC-3-celler reduceres betydeligt. Disse resultater antydede, at LPA udskilt af PC-3-celler aktiveret LPA

1/3 og derfor reguleret VEGF-C-ekspression. Endvidere ATX siRNA og dets inhibitor, S32826 [31] (fig. 5C, 5D), blev anvendt til at bestemme, hvorvidt ATX er involveret i reguleringen af ​​VEGF-C. Resultaterne viste, at nedregulering af ATX genekspression og aktiviteter faldt VEGF-C-mRNA (fig. 5C, 5D) og udskillelse (fig. 5E). Resultaterne antyder, at ATX er involveret i selvregulerende VEGF-C-ekspression i prostatacancerceller.

Efter 16 timers sult blev PC-3-celler behandlet med 10 pM Ki16425 i RPMI1640 med 0,005% fedtsyre BSA til 8, 12, 24 og 48 timer. Det relative niveau (A) og sekretion koncentrationen af ​​VEGF-C-mRNA (B) i prøverne blev bestemt. Desuden blev PC-3-celler transficeret med ATX siRNA i 24 timer til at vælte ATX-genet. PC-3-celler blev dyrket i RPMI-1640 med 0,005% fedtsyrefrit BSA i yderligere 24 timer, og prøve-RNA blev opsamlet. Desuden inhibitoren, S32826, blev også anvendt til at inaktivere ATX aktivitet i 12 timer. ATX og VEGF-C mRNA udtryk (C og D) blev målt. Efter samme protokol blev PC-3-celler transficeret med ATX siRNA og behandlet med S32826 udsultet og dyrket i RPMI-1640 med 0,005% fedtsyrefrit BSA i 48 timer. VEGF-C sekretion koncentrationer (E) af prøverne blev bestemt. Prøve-mRNA blev revers-transkriberet og analyseret ved en real-time PCR. Relative niveauer af gener normaliseret til p-actin er vist. VEGF-C sekretionssignaler koncentrationer blev målt ved en ELISA. * Statistisk forskellig i forhold til køretøjet-inkuberes prøve behandlet og transficeret med Ki16425 og ATX siRNA (*

s

0,05; **

s

0,01; ***

p

. 0,001)

ved at afbryde LPA

1/3 af PC-3, konditioneret medium (CM) -induceret HUVEC Lymfe Marker Expression blev Blokeret

for at efterligne mikromiljø mellem prostata kræftceller og endotelceller, vi brugte HUVEC’er som model til at undersøge de mekanismer, som prostata kræftceller fremkalde lymfangiogenese. HUVEC’er blev behandlet med fortyndinger af PC-3 CM. Ekspressionsniveauerne af lymfatiske markører, herunder Prox-1 og Lyve-1 blev opreguleret i HUVEC’er (fig. 6A) efter CM-behandling. For at bestemme om VEGF-C udskilt af prostatacancerceller er nødvendig for at stimulere lymfatiske markører, PC-3-celler stabilt transficeret med VEGF-C shRNA blev udvalgt (fig. 6B). Brug af CM fra VEGF-C Knockdown PC-3-celler til behandling af HUVEC’er blev lymfe markør ekspression i HUVEC’er signifikant reduceret sammenlignet med vektor kontrolgruppen CM (fig. 6C). Dette resultat indikerer, at VEGF-C er afgørende for udløsning lymfe markør ekspression af PC-3-celler. Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere resultater, at VEGF-C spiller en central rolle i prostatakræft-induceret lymfangiogenese. Desuden vi forbehandlet PC-3 celler med Ki16425 før indsamlingen CM (fig. 6D). Resultaterne viste, at kapaciteten af ​​PC-3 CM ved at afbryde LPA

1/3, for at inducere lymfatisk markør-ekspression blev reduceret med 32% sammenlignet med kontrolgruppen. Men forbehandling af HUVEC’er med Ki16425 ikke påvirke induktionen af ​​lymfatisk markør ekspression (fig. 6D), hvilket antyder, at det inducerende evne i CM skyldes sandsynligvis VEGF-C. For yderligere at tydeliggøre rollerne for LPA

1 og LPA

3 i PC-3

, vi indsamlet konditioneret medium fra LPA

1 eller LPA

3 forbigående knockdown celle til at behandle HUVEC celler. I vores resultater, konditioneret medier fra LPA

1 eller LPA

3 Knockdown celler havde begrænset kapacitet til at fremkalde lymfe markør-ekspression i HUVEC (fig. 6E).

(A) PC-3 celler dyrket i RPMI-medium kun i 24 timer efter 16 timers udsultning. 24 h CM blev opsamlet og fortyndet til behandling HUVEC’er i 4 timer. Efter behandling blev HUVEC lymfe markør udtryk observeret. (B) PC-3-celler stabilt transficeret med VEGF-C shRNA blev testet for VEGF-C-mRNA og sekretion ekspression. (C) VEGF-C knockdown PC-3 CM blev anvendt til behandling HUVEC’er efter den ovenfor beskrevne fremgangsmåde. (D) PC-3-celler blev behandlet med 10 pM Ki16425 samtidig være dyrket i RPMI-medium kun i 24 timer før CM blev anvendt til behandling HUVEC’er. Ki16425 blev også anvendt til at teste, om LPA eksisterende i PC-3 CM er afgørende for HUVEC lymfe markør regulering. Ki16425 (10 uM) blev forbehandlet i 1 time, før PC-3 CM behandling af HUVEC’er. (E) CM fra PC-3-celler transficeret med LPA

1 eller LPA

3 siRNA blev anvendt til behandling HUVEC-celler som ovenfor beskrevne procedurer. Prøve-mRNA blev revers-transkriberet og analyseret ved en real-time PCR. Relative niveauer af gener normaliseret til GAPDH og β-actin er vist. * Statistisk anderledes i forhold til køretøjets-rugede prøver og prøver behandlet med PC-3 CM (*

s

0,05; **

s

0,01; ***

s

. 0,001)

diskussion

i denne undersøgelse undersøgte vi roller LPA i regulering VEGF-C-ekspression i prostatakræft. Vores resultater viste klart, at LPA-induceret VEGF-C-ekspression i forskellige prostatacancercellelinjer. LPA

1 og LPA

3 blev begge identificeres som værende involveret i LPA-inducerede VEGF-C signalvejen. For downstream signaler blev LPA-induceret ROS produktion og LEDGF udtryk identificeret som deltager i reguleringen af ​​VEGF-C. Endvidere ATX gen knockdown reduceret basal VEGF-C-ekspression. Dette indikerer, at LPA og ATX er både afgørende for regulering af VEGF-C-ekspression i prostatacancerceller.

lysophospholipider blev foreslået at fremme prostatakræft progression. LPA inducerer PC3 cellevandring gennem LPA

1, p42 og p38 alfa veje og også fremmer Matrigel invasion [32]. For nylig er det også indikere, at CD97 heterodimeriseres og funktionelt synergieffekt med LPA

1 implicere i kræft progression [33]. Desuden LPA-induceret prostatakræft overlevelse og invasion er blevet vist at associere med calpain-medieret proteolyse af FAK [34]. Desuden er VEGF-ekspression aktiveres af LPA gennem aktivering hypoxi-inducerende faktor (HIF) -1α ekspression i PC-3-celler [35]. Imidlertid er den rolle, LPA i prostatacancer-induceret lymfangiogenese stadig dårligt forstået.

VEGF-C betragtes som en central lymfangiogene faktor i at indlede lymphangiogenese og lymfe metastaser i prostatakræft. I LNCaP-celler, blev VEGF-C identificeret til at være negativt reguleret af androgen gennem insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF-IR) og FOXO pathway [36]. Desuden med androgen ablation, Rala stimulerer VEGF-C-syntese ved at forøge ROS-generering [23]. Da Rala aktivering udløses af LPA

1 i HEK293 celler [37], forholdet mellem LPA receptor-aktivering og androgen virkning på reguleringen af ​​VEGF-C er værdig til yderligere undersøgelse. Vores resultater tydede på, at både LPA

1 og LPA

3 er ansvarlige for LPA-induceret VEGF-C-ekspression. Desuden er der i LPA

1 og LPA

3 stabilt bankede-down PC-3 celler, basal VEGF-C genekspression blev vist at være faldet. I vores nyligt offentliggjorte undersøgelse, LPA-induceret VEGF-C og lymfangiogenese i HUVEC’er var også LPA

1 og LPA

3 afhængig [38]. Disse resultater antyder, at aktivering af LPA

1 og LPA regulerer

3 VEGF-C-ekspression i både kræft og endotelceller.

I prostatacancer, VEGF-C opregulering blev vist at være associeret med ROS-generering [22], [23]. Resultaterne antydede en rolle for ROS i LPA-induceret VEGF-C-ekspression. Vores resultater viste, at ROS-generering blev induceret ved LPA og deltager i LPA-induceret VEGF-C transkription. Desuden er LEDGF, en transskriptionsfaktor aktiveret af ROS, involveret i LPA-induceret VEGF-C-ekspression. I klinisk forskning, blev LEDGF udtryk forhøjet i 93% af kliniske prostata tumor prøver, og det svækkede docetaxal celledød [39]. Heri viste vi, at LEDGF ekspression blev induceret af LPA behandling i en LPA

1/3-afhængig måde. Disse resultater yderligere støtte LPA er en vigtig regulator i prostatakræft progression.

Ekspressionsniveauer af ATX, en LPA-producerende enzym, er højere i androgen-uafhængige prostatacancerceller [40]. Desuden afslørede kliniske data, at omkring 50% af prostata cancer patienter viste stærk udtryk for ATX. Desuden blev ATX ekspressionsniveauet signifikant korreleret med det primære Gleason kvalitet af kræft foci og tilstedeværelsen af ​​prostata kapsel-invasion [17]. Vores resultater antyder, at VEGF-C reguleres af ATX ekspression i PC-3-celler. Derfor kan prostatakræft-syntese LPA danne en autokrin sløjfe for at stimulere VEGF-C-ekspression og yderligere fremme udviklingen af ​​kræft. Baseret på disse resultater, kan en ATX-inhibitor være en potentiel kandidat til at forhindre lymfangiogenese-induceret metastase af prostatacancer.

Konditioneret medium opsamlet fra cancerceller er almindeligt anvendt til at efterligne lokale microenvironmental interaktioner mellem værter og tumorer. Ved hjælp af en HUVEC in vitro model blev cancerceller vist til hemmelig interleukin (IL) -1a at stimulere IL-8-sekretion af endotelceller [41]. Desuden konditionerede medium af A549 lungekræft cellelinien regulerer endotelceller blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) udtryk, der er VEGF afhængig [42]. Alle disse resultater antyder, at HUVEC celle er en ordentlig

in vitro

model til at undersøge aktive komponenter i konditioneret medium af cancer cellekulturer. PC-3-konditioneret medium-induceret lymfatiske endotelceller (LEC) proliferation, dannelse rør, og sårheling. Desuden blev VEGFR-2 signalering også identificeret til at spille en kritisk rolle i LEC ‘respons på behandling med PC-3-medium [43]. Heri demonstrerede vi, at VEGF-C er en vigtig inducer af ekspressionen af ​​HUVEC lymfatiske markører i PC-3-konditioneret medium. Vore resultater stemmer overens med tidligere undersøgelser, at PC-3-celler, der stabilt udtrykker VEGF-C siRNA reducerede intratumoral lymfangiogenese [44]. Desuden er vores forskning yderligere demonstreret, at aktivering af LPA regulerer

1/3 PC-3 VEGF-C-ekspression, og konditioneret medium af PC-3 var i stand til at inducere ekspressionen af ​​endotheliale celle lymfatiske markører.

sammenfattende viser vi, at den forstærkende virkning af LPA og ATX-aksen på VEGF-C-ekspression i prostatacancerceller. Derfor antagonister af LPA

1/3 og ATX kan være mulige terapeutiske strategier for at hæmme prostatakræft-induceret lymphangiogenese og dermed forhindre metastase-relaterede kræftdødsfald.

Materialer og metoder

Cell kultur

PC-3, DU145, og LNCaP human prostatacancer-cellelinier opnået fra ATCC blev dyrket i RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin ( 100 U /ml) og streptomycin (100 U /ml) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2. Humane navlestrenge blev venligst stillet til rådighed af National Taiwan University Hospital (Institutional Review Board godkendelse nr. 9561709146). HUVEC’er blev dyrket på 1% gelatine-belagte (Sigma, St. Louis, MO, USA) 10-cm plader i 60% M199 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) medium suppleret med 100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin, 20% FBS, og 20% ​​endotel-vækstmedium (EGM). Celler undergik en passage ugentligt. Celler blev subdyrket efter trypsinisering og anvendt i eksperimenterne, indtil passagen 4. PC-3 stabilt transficeret med VEGF-C small-hårnålen (sh) RNA blev vedligeholdt og amplificeret i komplet medium suppleret med puromycin (0,25 ug /ml) i 6 uger før forsøgene blev udført.

LPA Stimulation

LPA (Sigma, St. Louis, MO, USA) blev fremstillet i chloroform og methanol (01:09) og opbevaret ved -20 ° C. Et hundrede tusinde celler blev dyrket i plader med 3,5 cm diameter med komplet medium. Efter 24 timers implantation blev PC-3-celler udsultet med serum-frit RPMI-1640 i 16 timer. Efter sult blev LPA tilsat til serumfrit RPMI med 0,005% fedtsyre-frit bovint serumalbumin (BSA) som bærer. Den LPA

1/3 antagonist, Ki16425 (Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA) og ATX-hæmmer, S32826 (Echelon, Salt Lake City, UT, USA) blev begge opløst i DMSO. Koncentrationen bearbejdning for Ki16425 og S32826 var 10 uM og 200 nM.

Western blot-analyse

Efter behandling blev cellerne vasket med iskold phosphatbufret saltvand (PBS) og lyseret på is med RIPA-buffer (50 mM Tris ved pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat og 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS)). Lysater blev centrifugeret ved 4 ° C og 14.000 rpm i 15 minutter, og klarede supernatanter blev opsamlet. Lige store mængder prøver blev separeret ved 12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og derefter overført til polyvinyliden fluorid membraner (Millipore, Bellerica, MA, USA). Følgende antistoffer blev anvendt til blotting: ged monoklonalt anti-hVEGF-C-antistof (AF752, R Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,