PLoS ONE: Den Mycoplasma hyorhinis p37 Protein hurtigt Fremkalde Gener i fibroblaster associeret med inflammation og Cancer

Abstrakt

p37 protein på overfladen af ​​

Mycoplasma hyorhinis

celler indgår i en høj- transportsystem og affinitet er blevet fundet i forbindelse med dyrs og humane cancere. Her viser vi i NIH3T3-fibroblaster, P37 hurtigt inducerer ekspressionen af ​​gener involveret i inflammation og cancer progression. Dette gen-aktivering var hovedsagelig via TLR4 receptoren. Aktiviteten blev tabt fra p37 når de C-terminale 20 aminosyrer blev fjernet eller de fire aminosyrer specifikke for hydrogenbinding af thiaminpyrophosphat var blevet erstattet af valin. Blokering af IL6-receptoren eller inhibere STAT3 signalering resulterede i øget p37-induceret genekspression. . Da cancerassocierede fibroblaster understøtter vækst, invasion og metastase via deres evne til at regulere tumor-relaterede inflammation, kan hurtig induktion i fibroblaster af proinflammatoriske gener ved p37 forventes at påvirke udviklingen af ​​kræft

Henvisning: Gomersall AC , Phan HA, Iacuone S, Li SF, Parish RW (2015)

Mycoplasma hyorhinis

p37 Protein hurtigt Fremkalde Gener i fibroblaster associeret med inflammation og kræft. PLoS ONE 10 (10): e0140753. doi: 10,1371 /journal.pone.0140753

Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institut for Biokemi og Bioteknologi, TAIWAN

Modtaget: Juni 25, 2015; Accepteret: September 30, 2015; Udgivet: 29 oktober 2015

Copyright: © 2015 Gomersall et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Den oprindelige CEL filer til microarray analyse og andre understøttende data er nu blevet deponeret i Figshare på https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1574136

Finansiering:. ACG var en modtager af en australsk Postgraduate Award .

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

p37 protein blev først opdaget på overfladen af ​​musen sarkom FS9 celler [1] . Monoklonale antistoffer rettet mod P37-proteinet inhiberede invasive opførsel af FS9 celler konfronteret med kylling heart fibroblaster [2]. Den p37 protein blev fundet at være fra

Mycoplasma hyorhinis

og indgår i en tre protein høj affinitet transportsystem [3]. Disse proteiner er næsten identisk med periplasmatiske bindende høj affinitet transportsystemer af gram negative bakterier. Den p37 N-terminus besidder den C-S-N aminosyresekvens nødvendig for en N-terminal glycerid-cystein lipid forlængelse, som indsættes i den mycoplasma membran [4]. Når

M

.

hyorhinis

var til stede, Rat-1-celler og FS9, L929 og NIH3T3 musefibroblaster alle invaderet kylling hjerte fibroblaster i konfronteret eksplantatet assay [5]. Hvis P37-specifikke monoklonale antistoffer blev tilsat til assayet den invasive adfærd blev inhiberet.

Opdagelsen af ​​p37-induceret celle invasivitet foreslået, at

M

.

hyorhinis

infektion kan spille en rolle i udviklingen af ​​cancer.

M

.

hyorhinis

infektion har efterfølgende vist sig at være forbundet med mennesker og dyr kræftformer herunder forskellige carcinomer [6], samt kræft i æggestokkene og lymfeknude metastaser [7].

M

.

hyorhinis

infektion er korreleret med metastaser og forudser dårlig overlevelse mavecancerpatienter [8]. Fareed et al. analyserede immunrespons af patienter immuniseret intralymfatisk med tumorceller og fandt patienter, der udviser tumorregression havde en målbar titer af antistoffer mod et 38 kDa protein [9]. Ilantzis et al. bekræftet, at proteinet være p37 [10]. Den p37 protein er blevet fundet i forbindelse med humane gastriske carcinomer og prostata tumorer [11, 12]. Anvendelse af et antistof rettet mod N-terminalen af ​​p37, blev proteinet identificeret i gastriske, colon, esophageal, lunge, bryst og gliom carcinomer samt på cirkulerende tumorceller fra patienter med hepatocellulært carcinom [6, 13].

Tilsætning af p37 for menneskers gastrisk karcinom (AGS) celler øget migration i en transwell (Matrigel) assay [11]. Behandling af prostatacancer linjer PC-3 og DU 145 med p37 steg også deres invasivitet gennem Matrigel [14]. Inddragelse af en P37-specifikt monoklonalt antistof hæmmede denne invasion. Niveauet for metalloproteinase 2 (MMP2) steg i medierne af P37-behandlede og

p37

transficerede AGS celler [11]. Goodison et al. foreslår den forøgede invasivitet kan repræsentere en større vandringshastighed efter p37 behandling snarere end øget kapacitet til nedbrydning af Matrigel [15]. P37 behandling viste sig også at øge

tumornekrosefaktor α

(

TNFa)

gentransskription og TNFa-niveauer i medierne af humane perifere mononukleære blodceller [16].

forskellige mycoplasma infektioner er blevet associeret med cancer og arthritis hos dyr og mennesker. For eksempel, infektion af 32D hæmatopoietiske celler med

M

.

fermentans

eller

M

.

penetrans

i 4-5 uger inducerede malign transformation, og når injiceret i nøgne mus cellerne hurtigt dannede tumorer [17].

M

.

hyorhinis

,

M

.

pneumoniae

,

M

.

hominis

,

M

.

fermentans

,

M

.

penetrans

og

M

.

arthritidas

har alle været impliceret i human artritis [18-21].

M

.

fermentans

producerer akut gigt i kaniner [21].

M

.

hyorhinis

infektion er også forbundet med polyserositis og gigt af svin [22].

Formålet med arbejdet rapporteres her var at identificere gener, hvis udtryk er hurtigt aktiveres efter p37 behandling af NIH3T3 fibroblaster

in vitro

. NIH3T3-celler blev valgt som de er en standard fibroblast linje, har vist sig værdifuld i studiet af sygdomme hos mennesker, herunder cancer.The membran receptor (er) med ansvar for genaktivering var også at blive identificeret.

Metoder

Plasmidkonstruktion

Plasmid konstruktion blev udført ved anvendelse af standard restriktionsenzym kloning.

p37

genet blev indsat i

Bam

HI skåret site af pUC-afledte pRSET En ekspressionsvektor. (Invitrogen; Cat # V351-20) (S1A Fig)

Afkortet p37 blev bygget ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) for at indføre den

Bam

HI og

NCO

jeg begrænsning afskårne flankerer den

P37

gen. De reverse primere (S1 Table) indført en

Nco

I restriktion kløvningspunkt på flere punkter, der var med produktionen af ​​DNA-sekvenser, som reducerede størrelsen af ​​P37 proteinet ved 20, 60, 80 eller 105 aminosyrer. PCR-produkterne blev fordøjet med

Bam

HI og

NCO

I restriktionsenzymer og ligeret ind i pUC-afledte pRSET A ekspressionsvektor (Invitrogen; Cat # V351-20) (S2 Fig) .

stedorienteret mutagenese

mutagenese af genet, der koder P37 blev udført under anvendelse af MutaGene fagmid

in vitro

mutagenese kit (Bio-Rad; Cat # 170-3581) . Oligonukleotiderne leveres i S2 Tabel

De fire aminosyrer S255, F256, S257 og K258 i p37 blev ændret til valin ved hjælp af QuikChange II XL stedorienteret mutagenese kit (Agilent Technologies, Cat # 200.521). Og primeren design metode udviklet af Zheng et al. [23]. To polymerasekædereaktioner blev anvendt til at udføre de mutationer; den respektive fremad- og revers-primere er listet i tabel S3 og sekvensanalyse i S3 Fig. Den optimale primerannealing temperatur blev etableret som 56,4 ° C.

Proteinekspression og afklaring

Ekspression af P37 protein, trunkerede P37 proteiner (p37-20, p37-60, p37-80 og p37-105) og det muterede p37-protein blev afsluttet i OneShot®BL21 (DE3) -celler (Invitrogen; Cat # C6000-03). Celler blev dyrket i Luria-Bertani (LB) bouillon indeholdende 100 ug ml

-1 ampicillin og induceret med IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid) til en slutkoncentration på 1 mM i 4 timer ved 37 ° C med omrøring . Inducerede celler blev høstet og resuspenderes i Lysis buffer (50 mM NaH

2PO

4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 1 mg ml

-1 Lysozym, pH 8,0), der indeholder en komplet, Mini Protease Inhibitor cocktail Tablet (Roche; Cat # 11836153001). Rå lysater blev opnået ved sonikering (6 cyklusser, 30 sekunders intervaller) efterfulgt af omrøring i 30 minutter ved 4 ° C. Lysatet blev klaret ved centrifugering ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 ° C og samles via filtrering gennem et 25 um filter.

Arginin sættetid protein afklaring

Højere koncentrationer af P37 trunkerede peptider var placeret i den uopløselige brøkdel af

E

.

coli

lysat og så for at øge udbyttet af opløselig p37 en arginin sættetid (argSOAK) metode blev anvendt. Trunkerede peptider blev solubiliseret med en 1 M arginin sættetid før oprensning ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet af Tsumoto et al. [24]. Native p37 blev også oprenset ved anvendelse af 1 M arginin suge at sikre metode imidlertid ikke inaktivere proteinet

Protein oprensning

Protein oprensning blev opnået ved anvendelse Profinity

TM IMAC Resin (BioRad.; Cat # 156-0123) med afvigelser fra fremstillingen protokol.

To ml af Profinity

TM IMAC Resin blev tilføjet for hver 25 ml forberedt ryddet lysat. Til at muliggøre binding af proteinet harpiks /lysat blanding blev inkuberet i 1 time ved 4 ° C under omrøring. Blandingen blev derefter centrifugeret i 1 minut ved 3000 g til pelletering harpiksen. Harpiksen blev vasket med 10 ml vaskebuffer (50 mM NaH

2PO

4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) ved omrøring i 5 minutter ved 4 ° C. Harpiksen /vask blanding blev centrifugeret i 1 minut ved 3000 g til pelletering harpiks. Protein absorbanslæsninger ved 280 nm (A

280) blev taget af vask supernatanter. Harpiksen blev vasket gentagne gange, indtil vaskevæsken supernatanter A

280 var mindre end 0,01.

Eluering blev opnået ved tilsætning af 7 ml elueringspuffer (50 mM NaH

2PO

4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8,0) i hver 2 ml harpiks, med 1 times inkubation, omrøring ved 4 ° C. Blandingen blev centrifugeret i 1 minut ved 3.000 g for at pelletere harpiks og for hver 7 ml, blev fem 1 ml aliquoter af supernatanten indeholdende det eluerede protein opsamlet. Det eluerede protein blev opbevaret ved -80 ° C

Proteinkoncentrationer blev anslået efter Pierce® BCA Protein Assay Kit. (ThermoScientific; Cat # 23227) og BCA program Eppendorf BioPhotometer 6131. ​​

SDS-PAGE, Coomassie Blue-farvning og Western blotting

proteinprøver blev denatureret ved en 95 ° C varmebehandling i 10 minutter og separeret på 12% acrylamid adskiller geler med en 4% acrylamid stacking gel. Gelerne blev konstrueret efter Mini-PROTEAN

® 3 Cell (BioRad; Cat # 165-3301 /165-3302) producentens instruktioner. Mini-PROTEAN 3 Cell Mini Tank (BioRad; Cat # 165-3302) blev samlet i overensstemmelse med producentens anvisninger og geler løb i 60 minutter, 200 volt ved 4 ° C (Bio-RAD PowerPac

TM Basic power Supply ).

For at bestemme rensningseffektivitet SDS-PAGE geler blev farvet med 0,1% Coomassie Blue Stain (0,1% Coomassie Blue R-250, 40% methanol, 10% eddikesyre) natten over ved stuetemperatur under forsigtig omrøring. SDS-PAGE-geler blev fikseret før Coomassie Blue farvning med fikseringsopløsning (50% methanol, 10% eddikesyre) ved stuetemperatur i 10 minutter med forsigtig omrøring. Følgende Coomassie blåfarvning geler blev affarvet under anvendelse af en 40% methanol, 10% eddikesyre Affarvningsopløsningen i 2 timer ved stuetemperatur under forsigtig omrøring.

I proteinidentifikation, efter separation på 12% acrylamid adskille geler, proteiner overført til polyvinylidenfluoridmembran efter BIO-RAD Mini Trans-Blot

® Elektroforetisk protokol (Cat # 170-3930 /170-3935). BIO-RAD Mini Trans-Blot

® Elektroforetisk systemet kørte i 2 timer ved 200 volt

Membraner blev blokeret i 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand med Tween-20 (TBST-buffer.: 137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20), inkuberet igen i 1 time med T7-Tag monoklonalt antistof (Novagen; Cat # 69.522) fortyndet 1: 10.000 i 5% fedtfri tørmælk, efterfulgt af en 1 times inkubation med gede-anti-muse-IgG Peberrod Peroxide (HRP) konjugat (Invitrogen; Cat # G-21040) fortyndet 1: 10.000 i 5% fedtfri tørmælk

Western blots blev fremkaldt under anvendelse af alkalisk phosphatase. Conjugate Substrate Kit (BioRad; Cat # 170-6432). Membranen blev udsat for lys i 10 minutter under omrøring og vaskes med Hedeselskabet

2O for at stoppe reaktionen før scanning

PageRuler Prestained Protein Ladder. (Fermentas, Cat # SM0671) blev anvendt til at analysere protein størrelse.

microarray analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra NIH3T3 fibroblaster behandlet med 15 ug ml

-1 oprenset p37-protein i 24 timer eller ikke-behandlede NIH3T3 fibroblaster ved hjælp af RNeasy® Mini Kit ( Qiagen; Cat # 74.104). Tre biologiske replikater blev taget af hver behandling. Genomisk forurening blev screenet ved PCR og elimineres ved hjælp Deoxyribonuclease I, Amplification Grade (Invitrogen; Cat # 18.068-015) pr producentens anvisninger. RNA integritet og kvalitet blev kontrolleret ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Californien, USA).

RNA blev forstærket og cDNA syntetiseret i henhold til vejledningen i GeneChip® 3 ‘IVT Express Kit Brugervejledning ( Affymetrix; Cat # P /N702646 Rev.8). Efter biotin mærkning af cDNA og fragmentering blev prøver hybridiseret til Affymetrix Mouse Genome 430 2,0 Arrays, vaskes ved hjælp af en GeneChip® Fluidik Station og scannet med GeneChip® Scanner 3000. Microarray data blev behandlet ved hjælp af Affymetrix® Expression Console ™ Software 1.2 (Affymetrix ; Cat # P /N 702.387 Rev. 2) og CLC Genomics Workbench 4.7 (CLC bio, https://www.clcbio.com;. Vat # DK28305087)

RT

2 Profiler ™ PCR Array System

Totalt RNA blev ekstraheret fra NIH3T3 fibroblaster, som var blevet behandlet med P37, P37 og S31-201, S31-201 alene eller ikke-behandlede NIH3T3 fibroblaster ved hjælp af RNeasy® Mini Kit (Qiagen; Cat # 74.104) . Tre biologiske replikater blev taget af hver behandling. Genomisk forurening blev screenet ved PCR og elimineres ved hjælp Deoxyribonuclease I, Amplification Grade (Invitrogen; Cat # 18.068-015) pr producentens anvisninger. RNA integritet og kvalitet blev kontrolleret ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Californien, USA)

RNA Reverse Transcription og RT

2 Profiler

TM inflammatorisk respons Autoimmunitet PCR arrays (SABioscience; Cat # PAMM-077A-12) blev udført efter fremstillingen instruktion (SABiosciences; Part # 1022A). Stærke positive korrelationer tærskelcyklus (Ct) værdier mellem PCR-array biologiske replikater af hver behandling indiceret pålidelige qPCR påvisning af genekspression (S4 Fig).

En ANOVA-analyse blev udført sammenligning gen Ct-værdier på det behandlede prøver til den ubehandlede kontrol

Kvantitativ PCR (qPCR)

RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy® Mini Kit. (Qiagen; Cat # 74.104) fra tre biologiske replikater af behandlede og ikke-behandlede NIH3T3 fibroblaster. RNA blev DNAse-behandlet (Invitrogen; Cat # 18.068-015) før komplementært DNA konvertering (SuperScript

TM III, Invitrogen; Cat # 18.080-044). Kvantitativ amplifikation af cDNA blev udført i tre eksemplarer af hver biologisk replikat hjælp iQ

TM SYBR

® Green Supermix (BioRad; Cat # 170-3884) og qPCR oligonukleotider (S4 tabel) ved hjælp af en iCycler iQ

TM Fast -Tid PCR Detection System (Biorad, 170-8740). De samme amplificeringsbetingelser blev anvendt til alle primersæt; indledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter; amplifikationsprocessen cykluser 40x gennem denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, primerannealing 60

° C i 30 sekunder og derefter en forlængelse ved 72 ° C i 30 sekunder. Udsendes fluorescens blev målt under cyklet udvidelse fase. En endelig ekstension på 95 ° C i 1 minut blev afsluttet før dissociationskurven. Den dissociationskurve begyndte ved 55 ° C med en stigning på 0,5 ° C, indtil den endelige temperatur på 95 ° C var nået.

Negative kontroller blev kontrolleret for at eliminere forurening og kun en enkelt top blev accepteret i dissociationskurven enhver testet gen. Alle amplificerede produkter blev sekventeret for at indikere specificitet qPCR oligonukleotider.

Fold Skift

For at normalisere de forskellige fusioner og prøver alle gener af interesse (GOI) Ct-værdier blev trukket fra de gennemsnitlige Ct-værdier af de to endogene reference- gener

βactin

og

GAPDH

(

Glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase

); ACt (ligning 1). Alle Ct-værdierne blev opnået fra tre biologiske gentagelser og tre tekniske replikater af hver biologisk replikat (N = 9)

ligning 1

Forskellen mellem genet af interesse ACt af en behandlet prøve og en kontrolprøve blev beregnet.; ΔΔCt (ligning 2). Amplificeringseffektiviteten af ​​den eksponentielle ændring per cyklus pr gen (E) af hver primer blev beregnet ud fra procent effektivitet (E%); E (ligning 3). Procent virkningsgrad på 100 ± 10% og R

2≥0.985 blev fundet acceptable. Alle primerpar effektiviteter kan findes i S4 tabel.

Equation 2Equation 3

ΔΔCt blev anvendt med det respektive gen primer E værdi at beregne den relative gange ændring af genekspression som følge af en behandling (Eq 4). En normaliseret ΔΔCt 1 angiver opregulering og 1 angiver nedregulering.

Ligning 4

Fejllinjer

Standardafvigelsen (

σ

) blev beregnet på grundlag af ΔΔCt (ligning 5). Standardfejlen (SE) blev beregnet ud fra standardafvigelsen (ligning 6) og den øverste (ligning 7) og nedre (EQ 8) fejlsøjler blev beregnet under anvendelse standardfejlen, E-værdi og fold ændring. N er antallet af prøven size = 9.

Ligning 5Equation 6Equation 7Equation 8

Fejl bar værdier for alle grafer leveres i S5 tabel.

variansanalyse (ANOVA)

En ANOVA analyse blev udført på alle qPCR data, der sammenligner den normaliserede tærskelcyklus (ACt) af behandlede prøver til kontrollerne eller behandlede kontrolprøver. Alle forsøg bestod af tre biologiske gentagelser og tre tekniske gentagelser af hver biologisk gentagelse (N = 9).

Pattedyrceller

Mus embryonale (NIH3T3) fibroblaster, der er etableret fra NIH schweiziske museembryoer, blev opnået fra The Peter MacCallum Cancer Center, East Melbourne.

Cell dyrkningsbetingelser

NIH3T3 fibroblaster blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM). Mediet blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), NaHCO

3 og penicillin-streptomycin. Plasmocin

TM (Invivogen) blev sat til alle dyrkningsmedier ved en koncentration på 5 mg ml

-1. Cellelinien og medium blev testet for forurening med mycoplasma under anvendelse Mycoplasma primere beskrevet af Uphoff og Drexler [25]. PCR-amplifikation betingelser involverede en initial denaturering ved 95

° C i 3 minutter og efterfølgende opformering proces cykluser 32x gennem denaturering ved 95

° C i 10 sekunder, primerannealing 65

° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72

° C i 30 sekunder. En endelig ekstension af 95

° C i 1 minut blev afsluttet. Cellelinien og alle forsøg celle medier blev fundet negative for forurening med mycoplasma.

Alle kultur plader blev inkuberet i en vandkappe Incubator (Forma Scientific). Inkubatoren blev automatisk reguleret på 37

° C med 5% CO

2

Inhibitors

Følgende hæmmere blev anvendt:. IL6R hæmmer LEAF

TM renset anti- mus /rotte CD126 monoklonalt antistof (IL6R

i

) (Biolegend; Cat # 115.809) (AB_2127939) ved en slutkoncentration på 0,1 ug ml

-1. Den endelige koncentration blev bestemt under anvendelse af RT-PCR som viste, at koncentrationer af IL6R

i

området fra 0,1 til 0,5 ug ml

-1 inhiberede p37-induceret

serumamyloid A3

(

Saa3

) udtryk. Den kemiske probe STAT3 Inhibitor VI (S31-201) (Santa Cruz Biotechnology; Cat # sc-204.304) blev anvendt i en slutkoncentration på 100 uM [26]. Den Viral Inhibitor peptid af TLR4 (VIPER) og VIPER kontrol peptid CP7 blev ansat i en endelig koncentration på 0,5 uM (IMGENEX; Cat # IMG-2011set). Viper inhibering koncentration 0,5 uM blev bestemt ved behandling af NIH3T3-celler med 1 ug ml

-1 lipopolysaccharid (LPS) (InvivoGen; Cat # tlrl-3pelps) inhibering med 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10 og 25 um VIPER. Slutkoncentrationen af ​​0,5 uM VIPER viste sig at reducere ekspression af

Saa3

fra 12-fold til 5-fold. CP7 blev også fundet at hæmme LPS-induceret

Saa3

udtryk ved højere koncentrationer dog på 0,5 uM CP7,

Saa3

udtryk ikke var signifikant hæmmet.

Cell behandling

NIH3T3 fibroblaster til behandling blev passeret ind det nødvendige antal vævskulturplader at muliggøre tre biologiske replikater pr behandling. Alle NIH3T3 linjer stammede fra samme fryse ned batch ved passage 10; behandling fandt sted før passage 15. Før behandling blev DMEM10% FCS-medium aspireret og cellekulturer vasket to gange med 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4.2H

2O, 2 mM KH

2PO

4, pH 7,4), medmindre andet er angivet.

i p37 behandling den krævede koncentration af oprenset p37 blev tilsat til DMEM10% FCS medium dækker cellerne og kulturerne inkuberes i det nødvendige tidsrum. I tilfælde af tidskørsler blev celle behandlinger indledt på tidspunkter, der er tilladt for alle behandlingsforløb, der skal synkroniseres og klar til RNA-ekstraktion ved T

0.

NIH3T3 fibroblaster blev behandlet med inhibitorer før 24 timer behandling med eller uden P37. Forbehandling inkubationstid varieres afhængigt af inhibitor; 1 time for IL6R

jeg

, 2 timer til VIPER og CP7 og 24 timer for S31-201.

Behandlinger blev afsluttet ved vask og lyse af celler til øjeblikkelig RNA ekstraktion. Celler blev observeret efter behandling for toksicitet niveauer, hvis der var en observerbar toksisk virkning forsøget blev afsluttet.

Migration assays

Cellemigrering stimuleret i et monolag ved hjælp af en

i vitro

ridse sår assay. NIH3T3-fibroblaster blev dyrket til en 100% sammenflydende monolag og ridset under anvendelse af en steril pipettespids, der danner et sår på ca. 300 um i diameter. Cellerester blev vasket væk med 1x PBS og DMEM10% FCS blev sat med 25 pg ml

-1 p37 for behandlede NIH3T3 fibroblaster. Kulturer, der ikke havde nået en sammenflydende monolag efter 24 timer behandling og sår, der var større eller mindre end 300 um blev udelukket fra analysen. Billeder blev taget til fange ved 0, 14, 19, 24 og 38 timer. Seks billeder blev taget til fange pr tidspunkt per plade. Tredobbelte plader blev gennemført ved hvert tidspunkt (N = 18). Sats for celle migration blev udtrykt som areal (um

2) omfattet af migrerende celler divideret med tid (timer). At etablere området, hvori cellerne havde migreret ved hvert tidspunkt, blev området af såret ved hvert tidspunkt trækkes fra det oprindelige areal af såret. ImageJ blev anvendt til at bestemme det område af såret.

Resultater

Gen-ekspression profilering af P37 behandlede NIH3T3 fibroblaster

Rekombinant

p37

genekspression blev induceret i

Escherichia coli

og proteinet oprenses under anvendelse af Ni-affinitetskromatografi (figur 1). Oprindeligt blev virkningen af ​​den oprensede p37 på NIH3T3 fibroblast migration bestemmes. I en sårhelende assay 25 ug ml

-1 P37 behandlede fibroblaster udstillet øget migration satser (S5B Fig) og hurtigere sårlukning end kontrollerne (S5A Fig). p37 påvirkede ikke spredning på NIH3T3 celler. Der er en rapport af p37 behandling forårsager en lille stigning i proliferation af DU145 prostata celler (ikke fremlagt data), dog PC3 prostataceller var upåvirket (15).

Oprenset p37 blev separeret ved 12% SDS- PAGE og farvet med Coomassie blue (A). Det oprensede protein blev overført til polyvinylidenfluorid membraner og undersøgt med T7-Tag monoklonale antistof og gede-anti-muse-IgG Peberrod Peroxide (HRP) konjugat (B). Molekylvægtstandarderne (MW) er i kilo Daltons (kDa) og vist til venstre i figuren. Det rensede p37 protein løb hen til positionen på ca. 52 kDa. Den p37-proteinet forventes at være 43,5 kDa med yderligere 8,5 kDa som følge af 6x His tag og Xpress epitop af pRSET A læseramme. Identiteten af ​​det oprensede p37-protein blev yderligere bekræftet ved anvendelse proteinsekventering.

NIH3T3 fibroblaster blev inkuberet med 15 ug ml

-1 p37 i 24 timer og en microarray analyse af det oprensede total RNA angivet udtryk for 537 gener påvirkes væsentligt (p≤0.001); 288 af disse gener blev opreguleret (fold ændring ≥ 3) (S6 tabel). De gen ontologi opgaver for de 288 gener markant opreguleres leveres i S6 Fig. De ti mest kraftigt opregulerede gener (9- til 64-fold) er alle blevet rapporteret at påvirke udviklingen af ​​kræft og /eller inflammation (se Diskussion). Vi udvalgt til analyse i yderligere otte gener (opreguleres 3- til 9-fold), som også påvirker inflammation /cancer. De microarray data for de atten gener blev valideret ved anvendelse af kvantitativ PCR (qPCR) (S7 Fig). Opregulering som respons på p37 behandlingen blev bekræftet for fjorten af ​​generne. De fold ændringer været forholdsvis konstant mellem de forskellige (nyere) eksperimenter. Vi efterfølgende anvendes 25 ug ml

-1 p37 og 24 timers behandlinger; fold ændringer var sammenlignelige mellem eksperimenter.

Haptoglobin Hotel (

Hp

) var en undtagelse.

microarray analyse identificerede 249 gener stærkt nedreguleret (fold ændring ≥ 3) (S7 tabel). Nedregulering af fem af disse gener er blevet forbundet med tumorudvikling og aktiveringen af ​​akutfaseprotein (APP) gener (S8 tabel).

Virkning af forskellige P37 koncentrationer og behandlingstider Salg

NIH3T3 fibroblaster blev inkuberet med 0,5, 1, 5 og 25 ug ml

-1 p37 i 24 timer. De lavere koncentrationer P37 var mindre effektive til at stimulere genekspression selvom

Supplere komponent 3

(

C3

) og

Lipocalin 2

(

Lcn2

) var stadig betydeligt aktiveret af 5 mg ml

-1 p37 (tabel 1).

for at bestemme ændringer i genekspression over tid NIH3T3 fibroblaster blev behandlet med 5 mg ml

-1 p37 for 2 , 4, 8, 12 og 24 timer.

angiopoietin ligesom-4

(

ANGPTL4

),

serumamyloid A3 Hotel (

Saa3

),

Vaskulær celleadhæsionsmolekyle 1

(

VCAM1

) og

Interleukin 6

(

IL6

) udtryk steget kraftigt i løbet af de første 4 timers behandling, men aktiveringen var faldet til et lavt niveau eller var fraværende ved 24 timer (tabel 2). Den store stigning i

Lcn2

C3

udtryk fandt sted mellem 12 og 24 timer.

decorin Hotel (

DCN

) og

leukæmi hæmmende faktor

(

LIF

) udtryk steget i løbet af de første 4 timer, derefter faldt og steg derefter lidt igen efter 24 timer.

Selv om nogle variation i fold ændring fandt sted, da NIH3T3 fibroblaster blev behandlet med 25 pg ml

-1 p37 i 24 timer (tabel 1 og senere eksperimenter), fem gener

ANGPTL4

,

Saa3

,

DCN

,

C3

og

Lcn2

blev konsekvent aktiveret mere end 10 gange. Tre gener

hyaluronansyntase 2

(

HAS2

),

Hp

LIF

med mindst 5 gange.

P37 aktiverer genekspression via TLR4 receptor

de hurtige stigninger i

ANGPTL4

,

LIF

,

Saa3

,

IL6

VCAM1

udtryk i P37 behandlede fibroblaster foreslog P37 protein signalering via toll-like receptor 4 (TLR4). NIH3T3 fibroblaster besidder TLR4 siden 1 pg ml

-1 lipopolysaccharid (LPS) behandling i 6 timer resulterede i en 28 gange stigning i

IL6

udtryk i NIH3T3 fibroblaster [27]. Vi behandlede NIH3T3 fibroblaster med 1 pg ml

-1 LPS i 24 timer og fandt en 2-fold og en 12 gange stigning i

IL6

Saa3

udtryk, henholdsvis (data ikke vist). Den Viral Inhibitor peptid af TLR4 (VIPER) og dens kontrol peptid (CP7) [28] blev anvendt til at bestemme, om P37 signaler via TLR4. NIH3T3-fibroblaster blev inkuberet i 24 timer med p37 (25 ug ml

-1) eller forbehandlet i 2 timer med VIPER eller CP7 peptider (0,5 uM) før tilsætningen af ​​P37. Virkningen af ​​peptiderne på ekspressionsniveauerne af de syv gener stærkest induceret af p37 blev bestemt (figur 2). Den p37-induceret ekspression af alle syv gener var signifikant inhiberet af Viper. Selv om nogle CP7-induceret inhibering forekom, i de fleste tilfælde var dette signifikant mindre end inhiberingen forårsaget af Viper. Behandling af NIH3T3 fibroblaster med 0,5 uM VIPER eller CP7 alene havde ingen virkning på de testede gener, med undtagelse af

Saa3

som blev nedreguleret med 0,5 gange (S8A Fig).

Kvantitativ PCR ( qPCR) analyse af NIH3T3 fibroblaster behandlet med 25 mg ml

-1 p37 i 24 timer (sort) eller forbehandlet i 2 timer med VIPER (grå) eller kontrol peptid CP7 (hvide) før 25 pg ml

-1 p37-behandling i 24 timer. Væsentlige forskelle mellem CP7 eller VIPER + P37 behandlinger og p37 behandling blev beregnet ved hjælp af ANOVA-analyse (+ p ≤ 0,05, ++ p≤0.01, +++ p≤0.001).

Trunkering af p37 eller mutation af TPP bindingsstedet inhiberer genaktivering

Fire trunkerede P37 peptider blev fremstillet ud fra hvilket 20, 60, 80 eller 105 aminosyrer var fjernet fra C-terminalen. Opløselige peptider (25 ug ml

-1) oprenset ved anvendelse af argSOAK metode blev anvendt til at behandle NIH3T3 fibroblaster. Kapaciteten af ​​p37 til at inducere genekspression blev tabt, når de C-terminale 20 aminosyrer var fraværende (Fig 3). Undtagelsen var

ANGPTL4

hvis ekspression niveau induceret af 20 aminosyre afkortet peptid svarede til fuldlængde P37-peptid. Ekspressionsniveauerne for de andre testede gener (syv er vist) blev ikke signifikant påvirket af de trunkerede P37 peptider.

Kvantitativ PCR-analyse af NIH3T3 fibroblaster behandlet med 25 mg ml

-1 p37 eksklusive 20 aminosyrer (aa), 60aa, 80aa eller 105aa (mørkegrå til hvid) fra C-terminalen; i 24 timer. Arginin suge (argSOAK) renset p37 (mørkeste grå) svagt reducerer p37-induceret (sort) genekspression i NIH3T3 fibroblaster. Væsentlige forskelle mellem behandlede og ubehandlede fibroblaster blev beregnet ved hjælp af ANOVA-analyse (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)

Den krystallinske struktur p37 er blevet defineret til. 1.9 en beslutning [29]. P37 er en alpha /beta klasse protein bestående af to domæner adskilt af en spalte, som modellering indikerer binder thiaminpyrophosphat (TPP).