PLoS ONE: identifikation og validering af Housekeeping gener for Gene Expression Analyse af Cancer Stamceller

abstrakt

Karakteriseringen af ​​cancer stamceller (CSC) subpopulation, gennem sammenligning af genekspression signatur i forhold til de native cancerceller, er særlig vigtig for identifikation af nye og mere effektive anticancer strategier . Men CSC har særlige karakteristika i form af friktion, vækst og metabolisme, der muligvis indebærer en anden modulering af ekspressionen af ​​de mest almindeligt anvendte husholdning gener (HKG), ligesom b-actin (ACTB). Selv om det er vigtigt at identificere, hvilke er de mest stabile HKG gener at normalisere data fra kvantitativ realtids-PCR-analyse for at få robuste og konsistente resultater, er en udtømmende validering af reference- gener i CSC stadig mangler. Her har vi isoleret CSC kugler fra forskellige muskuloskeletale sarkomer og carcinomer som model til at undersøge på stabiliteten af ​​mRNA ekspression af 15 almindeligt brugte HKG, i forhold til de native celler. De udvalgte gener blev analyseret for variationen koefficient og sammenlignet ved hjælp af den populære algoritmer NormFinder og geNorm at evaluere stabilitet ranking. Som et resultat heraf fandt vi, at: 1) TATA-bindende protein (TBP), Tyrosin 3-monooxygenase /tryptophan 5-monooxygenase aktiverede protein zeta polypeptid (YWHAZ), Peptidylprolyl isomerase A (PPIA), og Hydroxymethylbilane syntase (HMBS) er de mest stabil HKG til sammenligning mellem CSC og indfødte celler; 2) mindst fire referencepunkter gener bør overvejes for robuste resultater; 3) Der bør ikke anbefales brug af ACTB, 4) specifikke HKG bør overvejes til undersøgelser, der er fokuseret kun på en bestemt tumortype, ligesom sarkom eller karcinom. bør tages Vores resultater i betragtning for alle studier af genekspression analyse af CSC, og vil bidrage væsentligt til fremtidige undersøgelser, der tager sigte på at identificere nye anticancer terapi baseret på CSC målretning

Henvisning:. Lemma S, Avnet S, Salerno M, Chano T, Baldini N (2016) identifikation og validering af Housekeeping Gener for Gene Expression Analyse af cancer stamceller. PLoS ONE 11 (2): e0149481. doi: 10,1371 /journal.pone.0149481

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: Oktober 20, 2015; Accepteret: 1. februar, 2016 Publiceret: 19 feb 2016

Copyright: © 2016 Lemma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud (FIRB RBAP10447J til NB) fra det italienske undervisningsministerium, universiteter og forskning, af den italienske forening for Cancer Research ( AIRC IG11426 til NB), og af det italienske ministerium for sundhed, Finansiel støtte til videnskabelig forskning “5 promille 2012” (til NB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forskellige populationer af celler danner maligne tumorer. Inden en given normale væv, bor en subpopulation af stamceller med evner selvfornyelse og differentiering til specialiserede celler. Tilsvarende er en tumor sammensat af en heterogen population af maligne celler med tydelig rang af differentiering, proliferation og tumorigene potentiale. Blandt sådanne heterogene maligne celler, er cancer stamceller (CSC) nævnt som en lille, men tydelig population af element i tumormassen, der er den primære involveret i trinnene initiering, transformation og efterfølgende progression af tumoren [1]. CSC-modellen hævder, at, ligesom stamceller fra normalt væv, tumorceller følger hierarkiske organisationer, hvor CSC ligger på toppunktet holder kapacitet til tumorigenese [2], metastaser forfremmelse [3-5], og resistens over for kemoterapi eller strålebehandling [6 -8]. Denne tumorfremkaldende cellepopulation blev isoleret og karakteriseret for første gang i human myeloid leukæmi [9,10], og efterfølgende også i andre faste tumorer [11-13]. Det mest anvendte assay til isoleringen af ​​CSC er sfæren-dannende assay og er baseret på evnen hos CSC til at vokse i forankringsuafhængige betingelser og til at danne flydende kolonier [12], de såkaldte “kugler”. Vi har tidligere isoleret CSC kugler fra humane muskuloskeletale sarkomer [14-16], og i denne undersøgelse vi også isoleret CSC fra forskellige carcinoma. Ud fra følgende betragtninger karcinomer er fælles voksne maligniteter, der viser høj metastatisk indeks på diagnose og omfattende sygelighed [7, 12], muskuloskeletale sarkomer er heterogene, relativt sjældne, og meget aggressive maligniteter af knogle og blødt væv, der ofte opstår hos børn og unge voksne [17] . Den høje tilbagefald typisk for disse neoplasmer dramatisk påvirker det kliniske resultat og trods kirurgi kan være helbredende, tumor prognose forbliver fattige. Derfor nuværende terapeutiske metoder ikke er tilstrækkelige til at forbedre det kliniske resultat, og yderligere forbedringer kan stamme kun fra en bedre forståelse af molekylære mekanismer i disse sygdomme, og fra identifikation af specifikke markører, der definitivt skelne CSC fra andre tumorceller. Således under den forbindelse

in vitro

isolering af kugler giver et uvurderligt redskab.

Kvantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR) er den mest følsomme og nøjagtige metode til at kvantificere mRNA-ekspression af et enkelt gen i forskellige eksperimentelle betingelser, og kræver normalisering af data mod en reference-gen, som typisk skal have en yderst stabil ekspression under de forskellige betragtes som eksperimentelle procedurer [18]. Identifikationen af ​​specifikke housekeeping-gener (HKG) er en central forudsætning for at studere den relative ændring i mRNA-ekspression af et målgen. Den valgte HKG bør ikke være co-reguleret med målgenet eller påvirket af den eksperimentelle procedure. Det bør også udtrykkes i overflod og har minimal variation. Den mest almindelige metode til normalisering genekspressionsniveauer er at sammenligne mRNA niveauer af genet af interesse til det endogene kontrol genet. Normalisering af QRT-PCR data mod tilfældig HKG kan resultere i fejlagtig beregning af normaliseringsfaktor anvendes til at sammenligne de eksperimentelle betingelser, og derfor skjule biologiske forskelle blandt prøver [19]. Blandt forskellige referencepunkter gener, beta-Actin, glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase, eller beta-tubulin er de mest almindeligt anvendte, da de er stærkt udtrykt, nødvendigt for overlevelse, ikke-reguleret af signalveje, og syntetiseres i alle nukleerede celletyper . de seneste resultater viste imidlertid, at selv beta-Actin, en af ​​de mest almindeligt anvendte HKG, kunne være en uegnet intern kontrol [20,21].

QRT-PCR-analyser af CSC er allerede blevet udført, men for vores viden, ingen begrundelse for valget af HKG er stadig tilgængelig. I denne undersøgelse valgte vi 15 af de mest anvendte HKG at vurdere deres stabilitet i både CSC og adhærente native celler isoleret fra human rhabdomyosarcom (RS), osteosarkom (OS), Ewings sarkom (ES), brystcarcinom (BC) og renal carcinoma (RC). Gennem sammenligning af variation og brugen af ​​geNorm [22] og NormFinder [23] software vi udførte et gyldigt, reproducerbar og sammenlignende analyse af stabiliteten af ​​den valgte HKG.

Materialer og metoder

Native tumorcellelinjer og CSC kulturer Salg

RS cellelinje (RD), OS cellelinier (MG-63, HOS, Saos-2), ES-cellelinie (A-673), BC-celle line (MDA-MB-231) og RC-cellelinie (ACHN), blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og dyrket i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM, Gibco) plus 20 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) (komplet IMDM) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Et humant primær ES kultur (ES4540) blev også anvendt, og blev opnået fra en frisk biopsi af humane ES, og karakteriseret som tidligere beskrevet [16]. Den ES4540 prøve blev opsamlet efter en underskrevet informeret samtykke og efter godkendelse af Istituto Ortopedico Rizzoli etiske udvalg (0.033.626, 9 nov 2011), i henhold til Helsinki-deklarationen. Kort fortalt blev vævsprøver underkastet mekanisk hakning, efterfulgt af enzymatisk fordøjelse, for at opnå enkelte celler, der blev udsået i komplet IMDM, indtil dannelsen af ​​et monolag.

CSC celler blev opnået som tidligere beskrevet [16]. Kort beskrevet blev alle native tumor cellekulturer opretholdt i forankringsuafhængige betingelser i DMEM: F12-medium med progesteron (20 nM), putrescin (10 mg /ml), natriumselenit (30 nM), apo-transferrin (100 ug /ml) , og insulin (25 pg /ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i lav-vedhæftede kolber (Nunc, Penfield, NY) (kugle-dannende assay). Vi opnåede CSC kultur ved at opretholde sfæroid i forankringsuafhængige forhold i specifik celle medier, tilsætning vækstfaktorerne EGF og bFGF hver 3-4 dage (to gange i uge). Frisk human EGF (20 ng /ml) og bFGF (10 ng /mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ) blev tilsat to gange om ugen, indtil cellerne begyndte at vokse som flydende aggregater (kugler). Sfæroide kulturer blev amplificeret ved behandling af primær CSC kultur med trypsin efterfulgt af forsigtig mekanisk dissociation, og ved re-plating enkelt-cellesuspension for at opnå den anden klumpformet kultur. Levedygtighed blev verificeret ved erythrosin farvning. Procentdelen af ​​døde celler var lav (10-15% af døde celler). Kun de kulturer, der var i stand til at danne sfærer og som udtrykte stamcelle-relaterede markører blev anset.

Illumina genom analysator sekventering og analyse af data

En dyb sekventering analyse af MG-63, HOS, og Saos-2 OS cellemodeller blev udført for at sammenligne den globale transkriptionelle ekspression af CSC til de respektive native celler, med henblik på at vælge et panel af stabil HKG for QRT-PCR-analyse. Kort beskrevet blev totalt RNA indsamlet fra cellelysatet i syreguanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform [24]. Den totale RNA blev kvantificeret ved Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) ifølge producentens instruktioner. RIN (RNA Integrity Number) og A260 /A280-forholdet af den fremstillede total RNA blev alle 10, og over 1,8, hhv. Biblioteket af template-molekyler til high throughput DNA-sekventering blev konverteret fra den totale RNA ved anvendelse TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (Illumina, San Diego, CA) ifølge fabrikantens protokol. Biblioteket blev også kvantificeret med Bioanalyzer (Agilent), efter producentens anvisninger. Biblioteket (7 pm) blev underkastet klynge amplifikation på en enkelt læser Flow Cell v4 med en klynge generation instrument (Illumina). Sekventering blev udført på en Genome Analyzer GAIIx i 70 cykler under anvendelse Cycle Sequencing v4 Regents (Illumina). Humane genom build 19 (hg19) blev hentet fra University of California, Santa Cruz genom browser (https://genome.ucsc.edu/). Billedanalyse og base kald blev udført ved hjælp af off-line Basecaller Software 1.6 (Illumina). Læser blev justeret ved hjælp eland v2 af casava Software 1.7 med sekvens datasæt. Transcript dækning for hver genlocus blev beregnet ud fra det totale antal passerer filter læser at kortlagt ved Eland-RNA, til exoner. Disse analyser blev udført ved anvendelse af default-parametre. Dataene blev vist ved hjælp af Genome Studio Software (Illumina). Den avancerede analyse til kvantificering med fraktilestime normalisering algoritme blev udført ved hjælp af Avadis NGS software (version1.5, Strand Scientific Intelligence Inc., San Francisco, CA).

RNA isolering og cDNA-syntese

I alt RNA blev ekstraheret fra CSC og indfødte celler fra alle de forskellige histotypes indgår i undersøgelsen ved hjælp af NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland). On-kolonne DNase-fordøjelse udførtes ifølge producentens instruktioner. Det totale RNA renhed blev kvantificeret ved anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop Technologies). Totalt RNA (0,5 ug) blev revers-transkriberet til cDNA i 20 pi slutvolumen under anvendelse MuLV revers transkriptase og RNase inhibitor (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Første-streng cDNA blev syntetiseret under anvendelse vilkårlige hexamerer. For hver prøve blev 3 biologiske replikater behandlet.

QRT-PCR

QRT-PCR blev udført ved hjælp af en Light Cycler instrument og Universal Probe Bibliotek systemet (Roche Applied Science, Monza, Italien ). Probe og primere blev udvalgt ved hjælp af en web-baseret assay design software (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com), og blev yderligere styres ved hjælp af Oligo Primer Analysis Software. Kun Primere spænder en exon-exon junction og producerer et PCR amplifikerede med en længde mellem 70 og 150 basepar blev udvalgt. Alle primere designet blev analyseret af BLAST at verificere deres specificitet (National Center for Biotechnology Information). Alle cDNA blev fortyndet 1:10, og 10 pi blev anvendt som skabelon og indeholdt i en 20 ul totalvolumen på QRT-PCR-reaktion. Protokollen for amplifikation var: 95 ° C i 10 min; 95 ° C i 10 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 sek i 45 cyklusser; 40 ° C i 30 s. Hvert assay inkluderede en blank. Tabel 1 giver en oversigt over alle de HKG, primer sekvenser og sonder indgår i denne undersøgelse. Til vurdering af ekspressionen af ​​c-Myc (NM_002467.4), KLF4 (NM_004235.4), Nanog (NM_0248695.2) og OCT3 /4 (NM_002701.4), de følgende primere blev anvendt: c-Myc-F 5′-gctgcttagacgctggattt-3 ‘, c-Myc-R 5′-taacgttgaggggcatcg-3′, probe 66; KLF4-F 5’-ccatctttctccacgttcg-3 ‘, KLF4-R 5′-agtcgcttcatgtgggagag-3′, probe 7 ;. Nanog-F 5’-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ‘, Nanog-R 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3 sonden 69; OCT3 /4-F 5’-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3 ‘, OCT3 /4-R 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3’, probe 60. Med henblik på normalisering, den relative ekspression af KLF4, c-Myc, Nanog og OCT3 /4 blev normaliseret ved reference gen ACTB eller til det geometriske gennemsnit af YWHAZ og GAPDH for CSC og indfødte celler fra MG-63, eller til det geometriske gennemsnit af PPIA og HMBS for CSC og indfødte celler fra ACHN og MDA-MB-231. Den relative udtryk for de stamceller markører blev beregnet ved hjælp af ΔΔCt modellen [25].

NormFinder analyse

NormFinder program er en VBA applet [23] baseret på en varians estimering tilgang , der rangerer kandidaten HKG baseret på deres stabilitet evaluering, og tildeler en stabilitet værdi hver kandidat gen ved anvendelse af en modelbaseret tilgang. Efter aftale med NormFinder krav blev Ct-værdierne omdannet i relativ mængde, ved hjælp af den laveste Ct værdi som kalibrator. Ifølge analysen, blev den laveste stabilitet værdi højest rangerede. Vi grupperet alle data i 3 forskellige klynger: 1) alle data fra CSC forskellige tumorer; 2) alle data fra native celler af forskellige tumorer; 3) alle data fra forskellige tumorer med CSC og indfødte celler samles sammen. For tredje gruppe af data, foruden CSC og native celler opnået fra alle tumorer poolede sammen, vi også overvejet CSC og medfødte celler opnået fra enkelt tumortype, fra sarkom eller fra carcinom. Alle resultater blev opnået fra 3 sæt replikater

GeNorm analyse

GeNorm v 3.0 [22] findes i qbase + [26] (Biogazelle, Ghent Universitet, Belgien, http:.. //Www .qbaseplus.com) blev anvendt til at evaluere stabiliteten af ​​kandidat HKG. GeNorm beregner alle mulige gennemsnitlige parvise variation mellem kandidatgener og giver et mål for udtrykket stabilitet (M) af hvert gen. En M-værdi under 1,5 indikerer stabil HKG. Den kandidat henvisning genet med den laveste M værdi blev anset for at have den mest stabil ekspression. GeNorm rangerer kandidat reference- gener på grundlag af deres stabilitet af ekspression, og udføre trinvis udelukkelse af genet med den højeste M-værdi (den mindst stabile udtrykt gen), og genberegner M-værdier for de resterende gener. Vi bruger også GeNorm at kontrollere, om en enkelt HKG er tilstrækkelig til en passende normalisering. Faktisk GeNorm giver det optimale antal referencepunkter gener, der er nødvendige for nøjagtig normalisering. V værdier under cut-off værdien 0,15 indikerede optimale antal gener, der er nødvendige for data normalisering. I lighed med analysen udført med NormFinder, grupperet vi alle data og resultaterne i 3 forskellige klynger. Alle resultater blev opnået fra 3 sæt gentagelser.

Variationskoefficient analyse

Genekspression stabilitet evalueret af variationskoefficienten (CV) blev beregnet ved at dividere standardafvigelsen (SD) af tærsklen cykler (CT) af middelværdien Ct-værdi. Som i analysen udført med NormFinder og GeNorm, grupperet vi alle data i 3 forskellige klynger, og resultaterne blev opnået fra 3 sæt gentagelser.

Rank sammenlægning

Analyserne udføres af tre beskrevne metoder viste nogle forskelle i stabilitet rang af HKG. Derfor har vi identificeret de mest stabile gener ved at overveje den laveste værdi af den matematiske gennemsnit af NormFinder, geNorm og CV metoden rangerer for hver enkelt gen.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med StatView ™ 5.0.1 software (SAS Institute Inc., Cary, NC). Til karakterisering af CSC og medfødte celler fra MG-63, MDA-MB-231 og ACHN blev data betragtes som ikke normalt fordelt, og ikke-parametrisk Mann-Whitney U test blev anvendt. Resultater blev rapporteret som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM). Standardafvigelse (SD) af delta Cycle tærskel (ACt) værdier blev beregnet som puljede standardafvigelse (SDpooled). HKG udtryk variation i CSC og indfødte celler blev evalueret med den parrede Wilcoxon-test. For alle analyserne, blev forskelle betragtes som signifikante med en

p-

værdier ≤ 0,05.

Resultater

RNA kvalitetskontrol og karakterisering af CSC

Vi etableret sfære kulturer fra kommercielt tilgængelige cellelinjer fra 3 forskellige sarkom og 2 carcinom histotypes (MG-63 til OS, RD for RS, a-673 for ES, MDA-MB-23 til BC, og ACHN for RC), og fra en frisk ES biopsi (ES4540). Den spektrofotometrisk analyse bekræftede renheden af ​​prøverne, med en A

260 /

280-forhold på 2,08 ± 0,06, hvilket indikerer protein-fri rene RNA, og en A

260/230 ratio på 1,98 ± 0,21, hvilket indikerer, at det totale RNA blev phenol og ethanol fri.

stemness-lignende funktioner til alle CSC kulturer indgår i denne undersøgelse tidligere blev karakteriseret [16,27], med undtagelse af cscMG-63, cscMDA- MB-231, og cscACHN for hvilke evnen til vækst som flydende aggregater (fig 1), og mRNA-ekspression for KLF4, c-Myc, Nanog, og OCT3 /4 stemness markører [28] blev her bekræftet.

Repræsentative billeder af adhærente native celler og CSC flydende kugler observeret af inverteret optisk mikroskop for de forskellige cellelinier (skala bar 100 pm, venstre panel), og genekspression af stamcellemarkører ved QRT-PCR (højre panel). Normalisering til ACTB. For cscMG-63, c-myc ** p = 0,0019, KLF4 p = ns, Nanog ** p = 0,0010, OCT3 /4 * p = 0,0265. For cscMDA-MB-231, c-Myc ** p = 0,0011, KLF4 * p = 0,0130, Nanog ** p = 0,0011, OCT3 /4 * p = 0,0325. For cscACHN, c-myc p = ns, KLF4 * p = 0,0130, Nanog * p = 0,0130. For vedhængende ACHN, OCT3 /4 * p = 0,0130. (N = 6-12)

Især i cscMG-63 fandt vi en tendens til øget ekspression af KLF4. (Figur 1; n = 12; p = NS), og en signifikant højere ekspression af c-Myc (** p = 0,0019), Nanog (** p = 0,0010), og OCT3 /4 (* p = 0,0265). CSC fra MDA-MB-231 stærkt udtrykke alle stamness markører end det vedhængende kultur (figur 1; n = 6; KLF4 * p = 0,0130, c-Myc ** p = 0,0011; Nanog ** p = 0,0011; OCT3 /4 * p = 0,0325), mens kugle kulturer fra ACHN udtrykte ensartede niveauer for mRNA for KLF4 og Nanog (figur 1, n = 6; KLF4 * p = 0,0130; Nanog * p = 0,0130), og ikke anderledes udtryk for c-myc . I cscACHN, ekspressionen af ​​OCT3 /4 markør er lavere end det vedhængende indfødte kultur (figur 1; * p = 0,0130). De stemness gener blev normaliseret ved ACTB, en af ​​de mest almindeligt anvendte HKG.

Expression profil af kandidaten HKG gener

Femten kandidat reference- gener (Tabel 1) blev udvalgt gennem en analyse af litteratur undersøgelse om undersøgelser af normale stamceller og tumorceller med QRT-PCR-analyse.

Vi valgte de gener, der tilhører forskellige funktionelle klasser eller veje for at reducere sandsynligheden for at indgå i analysen, co-regulerede gener. Udskriften profilering af de udvalgte gener blev foreløbig analyseret af Illumina Genome Analyzer sekventering. Den dybe sekventering viste, at de formodede reference- gener stabilt blev udtrykt, med undtagelse af G6PD (tabel 2, fig 2A).

(A) Heat kort, der viser den relative ekspression af de udvalgte gener i native celler og CSC fra MG-63, HOS, og Saos-2-. (B). Transkriptionel profil Cycle tærskel (Ct) værdier af kandidat HKG gener i CSC og indfødte cellelinjer. Kasser repræsenterer nedre og øvre kvartil af cyklus tærskel sortiment med medianen angivet, lodrette streger repræsenterer 10

th og 90

th percentiler. I både CSC og vedhængende cellelinier, 18S rRNA var den mest udtrykte gen (lavere Ct-værdi), mens G6PD var den mindste udtrykte gen (højeste Ct-værdi).

Vi brugte kun MG-63 som repræsentant for OS histotype for den følgende QRT-PCR-analyse for at bekræfte data opnået ved dyb sekventering. For at sammenligne forskellige mRNA transskription niveauer, vi brugte de tærskelværdier cykler (Ct) værdier. Ct-værdi er skæringspunktet mellem en forstærkning kurve og en tærskel linje, og er omvendt korreleret med mængden af ​​mål-genet til stede i PCR-reaktionen [29]. De 15 kandidat reference- gener udstillet en bred vifte af udtryk niveau. Fordelingen af ​​median Ct-værdier og percentil for hvert gen er vist i blox plot af fig 2B. Reference gener blev mindre udtrykt i CSC i forhold til native celler. De mindste forskelle i genekspression mellem CSC og native cellelinier udtrykt som ACt, blev påvist for B2M, TBP og SDHA, hvorimod den største ACt blev beregnet for ACTB, tubb og PGK1 (tabel 3). Ved at udføre den parrede Wilcoxon-test for hvert gen til at vurdere forskellen mellem CSC og indfødte celler opnået fra de samme celler oprindelsesbetegnelser, fandt vi en signifikant forskel i HKG udtryk mellem CSC og indfødte celler til omkring halvdelen af ​​HKG undersøgte ( tabel 3).

Bestemmelse af housekeeping genekspression stabilitet

HKG udtryk stabilitet blev evalueret ved hjælp af NormFinder VBA applet, den GeNorm software og ved at beregne og sammenligne variationskoefficienten ( CV) i tre forskellige grupper: i (1) CSC eller (2) native celler, med det formål at finde frem til de mest stabile gener inden for en bestemt celle undertyper, og (3) i de samlede CSC og indfødte celler, med det formål at identificere de mest stabile gener, der skal betragtes som referenceniveauer gener til sammenligning af genekspression mellem CSC og medfødte celler.

stabilitetsværdier for NormFinder og M værdier for GeNorm er parametre til stabilitet, der er omvendt korreleret med ekspressionen stabilitet HKG. Alle de 15 ansøgerlande reference- gener havde en M-værdi lavere end den tærskelværdi på 1,5 (tabel 4), som viste, at alle kan betragtes som acceptable med hensyn til stabilitet [22].

1) Den mest stabile HKG i CSC. Brug af NormFinder VBA Applet, de 3 mest stabile HKG resulterede GAPDH, PGK1 og HMBS (fra den første til den tredje stabile), mens den mindre stabile var RPL13a, B2M og GUSB. Brug GeNorm software, identificerede vi YWHAZ, GAPDH og TBP som den mest stabile HKG, mens de mindre stabile gener var ACTB, GUSB og B2M. CV-metoden understregede også, at bør undgås brugen af ​​ACTB, mens, som for GeNorm og NormFinder analyser, anbefales brug af PGK1 og YWHAZ. En sammenligning af den prioriterede produceret af de tre metoder afslørede forskel afhængigt af typen af ​​algoritmen anvendt. Den minimale antal referencepunkter gener, der kræves for normalisering blev bestemt ved GeNorm beregning af parvise variation (variationskoefficient, V) mellem et givet antal gener og optagelsen af ​​et ekstra gen, og det optimale antal henvisning gen blev beregnet som 3 (V3 /4 0,114, fig 3A). Afslutningsvis for genekspression analyser af mRNA isoleret fra CSC, den optimale normalisering faktor skal beregnes som det geometriske gennemsnit af referencemål YWHAZ, GAPDH og PGK1.

Den minimale antal gener, der er nødvendige for data normalisering blev evalueret ved parvise variation (Vn /n +1) i (A) CSC, (B) native celler, (C) i CSC og native cellelinjer fra alle tumorer, (D) fra sarkom og (C) fra carcinomer. En variationskoefficient (V) under 0,15 indikerer det optimale antal gener, der er nødvendige for data normalisering. V2 /3 0,15 indikerer, at 2 gener er nødvendige for data normalisering

2) Den mest stabile HKG i native vedhæftende celler.. NormFinder analyse viste, at 18S rRNA, TBP og PPIA var de tre bedste HKG, mens RPL13a, G6PD, og ​​ACTB var værre i udtryk stabilitet. Tilsvarende GeNorm identificeret PPIA og 18S rRNA som de to mest stabile HKG, efterfulgt af GAPDH, mens de mindre stabile gener, i rækkefølge fra den sidste rangeret, var G6PD, RPL13a, og ACTB. CV foreslåede metode HMBS, TBP og YWHAZ som de tre mest stabile gener. Den GeNorm beregning af variationskoefficienten V foreslået, at det optimale antal referencepunkter gener var 2 (V2 /3 0,146, Fig 3B), og tilføjelsen af ​​en tredje henvisning gen resulterede i en lille effekt på normalisering (under cut-off værdien på 0,15). Afslutningsvis for de indfødte celle, ifølge analyserne, den optimale normalisering faktor skal beregnes som det geometriske gennemsnit af PPIA og TBP.

3) Endelig udførte vi en analyse af CSC og indfødte samlede celler i alt tumorer (A), i sarkom (B) og carcinom (C).

(3A) i CSC og indfødte celler fra alle tumorer, NormFinder identificeret GAPDH, TBP, og PPIA som de tre mest stabile HKG, hvorimod ACTB, RPL13a og GUSB var den mindre stabile. PPIA og GAPDH blev også bekræftet af GeNorm analyse, sammen med 18S rRNA. Igen ACTB var den sidste gen i stabilitet for GeNorm analyse, sammen med B2M og G6PD. CV evaluering foreslog TBP, B2M, og SDHA (tabel 4), mens ACTB, Tubb og 18S rRNA var mindre stabile. GeNorm anbefales brug af fire HKG til præcis genekspression analyse (V 0,15, når man sammenligner en normalisering faktor baseret på de 4 eller 5 mest stabile mål, fig 3C). Derfor bør normalisering faktor beregnes som det geometriske gennemsnit af TBP, PPIA, HMBS, og YWHAZ eller GAPDH.

(3B) I CSC og indfødte celler fra sarkom, den NormFinder software identificeret GAPDH, YWHAZ og 18S rRNA som de mest stabile gener, i stedet G6PD, RPL13a og B2M var den mindre stabile. GAPDH og YWHAZ blev identificeret som den bedste HKG også af GeNorm analyse, mens ACTB og RPL13a var blandt de sidste klassificeret gener. CV-metoden viste, at HMBS, TBP, og SDHA havde den bedste rang position (tabel 5). Det optimale antal referencemål er 2 (V2 /3 0,143, Fig 3D). Som konklusion kan det optimale normalisering faktor beregnes som det geometriske gennemsnit af referencemål YWHAZ og GAPDH.

(3C) Analysen af ​​HKG stabilitet i karcinom afslørede, at PPIA, HMBS og RPL13a var den mest stabile HKG for NormFinder. GeNorm bekræftede også PPIA og RPL13a som mest stabile mål ved GeNorm, efterfulgt af 18S rRNA, mens CV foreslåede metode B2M, TBP og G6PD (tabel 5). Den GeNorm beregningen af ​​koefficienten V foreslog, at to HKG er tilstrækkelige til normalisering (V2 /3 0,084, Fig 3E). Afslutningsvis bør det optimale normalisering faktor i dette tilfælde beregnes som det geometriske gennemsnit af to af følgende gener, PPIA, HMBS eller RPL13a, som har den samme overordnede rang værdi.

Validering af den identificerede HKG i CSC model

i genekspression evaluering, kan brugen af ​​suboptimal HKG generere fejlagtige resultater eller kan skjule en forskel i genekspression. Dette er især vigtigt for gener, der ændrer lidt mellem to populationer af celler, som CSC og medfødte celler.

Vi analyserede ekspressionen af ​​stemness gener c-myc, KLF4, Nanog, og OCT3 /4, som tidligere normaliseret til ACTB (figur 1), med de identificerede top-ranking HKG for CSC og indfødte celler, i sarkom og carcinom, henholdsvis (GAPDH og YWHAZ for sarkom, og PPIA og HMBS for karcinom). Nogle af stamme-relaterede gener anses viste en forbedret robusthed statistisk analyse udført med normaliseringen med den mest stabile HKG, for så vidt med ACTB. Især som vist i figur 4, fandt vi, at normaliseringen af ​​Nanog til det geometriske gennemsnit af de mest stabile HKG medførte *** p = 0,0007 for cscMG-63 og ** p = 0,0043 for cscACHN, hvorimod med ACTB normalisering vi opnåede ** p = 0,0011 og * p = 0,0130, henholdsvis. I cscMG-63, for cMyc vi opnåede *** p = 0,0003 med den nye analyse, i stedet for ** p = 0,0019 med normaliseringen til ACTB.

Effekten af ​​genekspression normalisering med optimal HKG var undersøgt på CSC og medfødte celler fra MG-63 og ACHN. (A) For osteosarcomcellelinie blev ekspressionen af ​​stamceller markører NANOG og cMyc evalueret og normaliseret til det geometriske gennemsnit af GAPDH og YWHAZ. *** P = 0,0007 for Nanog, *** p = 0,0003 for c-Myc. (B) For ranal carcinom cellelinje blev ekspressionen af ​​Nanog og cMyc normaliseret til det geometriske gennemsnit af PPIA og HMBS. ** P = 0,0043 for Nanog. (N = 6).

Diskussion

De udvikler konceptet CSC har tiltrukket meget opmærksomhed, og karakterisering af CSC har ført an til nye prospektivt for anti-behandlinger mod kræft. CSC er en minoritet delmængde af tumor-initierende celler involveret i forskellige faser af pro-tumorigen processen fra tumorinitiering [30], at kemoresistens [31] og tilbagefald [32]. CSC kan isoleres fra cellelinjer og vævsprøve med kuglen systemet metoden [12], baseret på evnen hos CSC til at vokse som sfæriske flydende kolonier i forankringsuafhængige betingelser. Til dato, anses dette for en uvurderlig metode til at opnå CSC-berigede kulturer. For nylig isolerede vi CSC fra bevægeapparatet sarkomer, både fra cellelinie og frisk biopsi [16,27].