Abstrakt
Baggrund
Patienter generelt dør af kræft efter den fejlslagne nuværende behandlinger for at fjerne resterende sygdom. En delpopulation af tumorceller, kaldet kræft stamceller (CSC), synes entydigt i stand til at sætte gang i væksten af fænotypisk og histologisk forskelligartede tumorer. Det er blevet foreslået, derfor, at manglende effektivt at behandle kræft kan delvist skyldes præferentiel modstand af disse CSC til kemoterapeutiske midler. Subpopulationen af humane colorektale tumorceller med et ESA
+ CD44
+ fænotype er unikt ansvarligt for tumorigenese og har kapacitet til at generere heterogene tumorer i en xenograft indstilling (
dvs..
CoCSC). Vi antager, at hvis ikke-tumorigene celler er mere modtagelige for kemoterapeutiske midler, så resterende tumorer kan forventes at indeholde en højere frekvens af CoCSC.
Metoder og Resultater
xenogene tumorer indledt med CoCSC var lov til at nå ~400 mm
3, på hvilket tidspunkt mus blev randomiseret og kemoterapeutiske regimer involverer cyclophosphamid eller irinotecan blev indledt. Data fra individuelle tumor fænotypisk analyse og serielle transplantationer udført i begrænset fortynding viser, at resterende tumorer er beriget for celler med CoCSC fænotype og har øget tumorigen celle frekvens. Desuden vises den iboende evne resterende CoCSC at generere tumorer bevaret. Aldehyddehydrogenase 1 genekspression og enzymatisk aktivitet er forhøjet i CoCSC og anvendelse af en
in vitro
kultursystem der opretholder CoCSC som påvist ved serielle transplantationer og lentiviral mærkning af enkelt celle-afledte kloner, vi viser yderligere, at ALDH1 enzymatisk aktivitet er en stor formidler af resistens over for cyclophosphamid:. en klassisk kemoterapeutisk middel
konklusioner
CoCSC er beriget i tyktarmstumorer efter kemoterapi og forbliver i stand til hurtigt at regenerere tumorer, de hidrører fra. Ved at fokusere på biologi CoCSC, kan store resistensmekanismer til specifikke kemoterapeutiske midler tilskrives specifikke gener, hvilket tyder på muligheder for forbedring kræftbehandling
Henvisning:. Dylla SJ, Beviglia L, Park IK, Chartier C, Raval J, Ngan L, et al. (2008) Kolorektal Cancer Stamceller er beriget i xenogene tumorer efter kemoterapi. PLoS ONE 3 (6): e2428. doi: 10,1371 /journal.pone.0002428
Redaktør: D. Gary Gilliland, Brigham and Women ‘s Hospital, USA
Modtaget: November 29, 2007; Accepteret: 8. maj 2008; Udgivet: 18 Jun 2008
Copyright: © 2008 Dylla et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. MFC er medstifter og medlem af den indbetalte advisory board af OncoMed Pharmaceuticals Inc., og har en egenkapital position i virksomheden. Alle andre forfattere er medarbejdere i OncoMed Pharmaceuticals Inc., et bioteknologisk selskab med fokus på terapeutiske målretning af kræft stamceller, der har ansøgt om patenter relateret til dette studie. Finansieringen af disse undersøgelser blev opnået via privat finansiering; Men disse parter ikke havde nogen rolle i beslutningen om at udføre, analysere eller offentliggøre resultaterne
Konkurrerende interesser:. MFC er medstifter og medlem af den indbetalte advisory board af OncoMed Pharmaceuticals Inc., og har en egenkapital position i virksomheden. Alle andre forfattere er medarbejdere i OncoMed Pharmaceuticals Inc., en bioteknologisk virksomhed, der har ansøgt om patenter relateret til dette studie.
Introduktion
Tilstedeværelsen af forskellige cellepopulationer i normalt og neoplastisk væv har lang blevet anerkendt. Mens normalt væv struktur og funktion lettes af forskellige celletyper, som genereres under udvikling og løbende udskiftet for at opretholde homeostase, er cancer generelt kendetegnet ved uorganiseret overproliferation. Fordi genetiske materiale formeret over længere perioder på grund af de selvfornyelse egenskaber af stamceller, har de kompoundering mutationer, der kræves for tumorigenese blevet antaget at hidrøre fra disse sjældne celler, og ikke deres mere talrige afkom, som har en begrænset levetid, når begået til differentiering. Ligesom normale væv-resident stamceller, der understøtter den cellulære hierarki omfatter et særligt væv over levetiden for en person, er cancer stamceller (CSC) defineret ved deres evne til at forny sig selv i det uendelige, og samtidig opretholde deres evne til at generere både tumorigen (TG ) og ikke-tumorigene (NTG) -celler [1]. I modsætning til normale udvikling, men kan neoplastisk progenitor cellepopulationer få selvfornyelse kapaciteter, hvilket også opfylder definitionen af en CSC [2], [3]. I sidste ende, demonstration af selvfornyelse og differentiering kapaciteter, der definerer en stamcelle, både normale og neoplastiske, kan bekræftes ved serielle transplantation undersøgelser, der muliggør diskrimination af celler med selvfornyelse evne versus dem i stand til talrige, selvom finite, ikke selv -renewing celledelinger [4].
CSC paradigme hviler på det fundament, som tumor heterogenitet kan genereres af en enkelt CSC. Fordi traditionelle cellelinjer og xenografter ikke rekapitulere den cellulære og morfologiske heterogenitet observeret i xenografter skyldes implantation af tumorceller taget direkte fra patienter og ikke passeret
in vitro
, CSC biologi afhænger sidstnævnte form for xenografter. Selvom relevansen af disse, og alle har xenografter til patientens tumorer blevet afhørt [5] – [7], transplantation af humane celler i mus er den eneste model system, der ikke udsætter menneskeceller til en aphysiological
ex vivo
miljø bestående af vævskultur plast og dyrkningsmedium og som kan rekapitulere den cellulære heterogenitet af en primær tumor
in vivo
. Et andet emne polemik ved grundlæggelsen af CSC hypotese er forslaget om, at fuldstændig heterogenitet af en tumor kan skyldes en enkelt celle [8], [9]. Ses der bort fra det stromale, endotel- og hæmatopoietiske elementer rekrutteret og indarbejdet i tumoren, er det blevet foreslået, at TG og NTG populationer skyldes forskellige celler og ikke fra en enkelt [9] CSC. Hvis CSC faktisk kan generere den cellulære heterogenitet observeret i patientens tumorer, og mus xenografter sammensat af celler strengt passeres
in vivo
bedste opretholde karakteristika for tumorer hos patienter, så fokus for indsatsen i kræft biologi område bør holdent på disse celler og deres microenvironmental niche.
Kemoterapeutiske strategier, der målretter hurtigt delende celler er hovedsageligt blevet anvendt til behandling tumorer af epiteloprindelse. Mens ofte effektive til debulking tumormasse, har disse midler hele mislykkedes at udrydde sygdomme [10]. En grund ofte tilskrives denne fiasko er, at delmængder af celler opnår resistens over for behandlingen gennem genetisk mutation og naturlig udvælgelse. Mens denne formodning kan være tilfældet, især i en indstilling af langvarig behandling, en tese af “cancer stamcelle hypotese” postulerer, at cellerne er ansvarlige for tumortilbagevenden sagens natur kan være mere resistente over for tumor debulking midler gennem helst af en række mekanismer ; dermed forklarer ildfast tumorvækst efter disse behandlinger [11]. Til støtte for denne hypotese kan resistens over for stråling skyldes forhøjet ekspression af DNA skade responset gener, som det er tilfældet for CD133
+ glioblastoma stamceller [12]. Analogt med hæmatopoietiske stamceller, har fast tumor CSC blevet foreslået at udvise højniveauekspression af multilægemiddeltransportøren familie gener, såsom ABCG2 og ABCB5, sandsynligvis resulterer i mere effektiv udstrømning af kemoterapeutiske lægemidler [13] – [15]. CSC kan også indtaste cellecyklus mindre hyppigt, så de kan modstå toksicitet af medikamenter, der er målrettet meget proliferative celler. Evidens for kemoresistens af stamceller-lignende celler i epiteliale cellelinjer og xenogene tumorafledte celler er blevet præsenteret [16] – [19]; Imidlertid har disse undersøgelser enten anvendes cellelinier tilpasset vævskultur og /eller vurderer ikke ændret tumorfremkaldende celle frekvens
in vivo
efter kemoterapi. Per definition er tumor-initierende celler optalt retrospektivt, derfor ændres CSC frekvenser post-terapi er bedst ved seriel transplantation.
cyclophosphamid (CPA) og irinotecan er midler, der er målrettet prolifererende celler og er almindeligt anvendte kemoterapeutiske midler i behandlingen af faste tumorer. Gennem forskellige mekanismer, både virke til at inhibere DNA-replikation resulterer i langsommere eller inhibering af celledeling og resulterer i apoptose. Modstand mod CPA er blevet foreslået at skyldes høj cytoplasmatisk aldehyd dehydrogenase (ALDH) enzymaktivitet: særlig beslutningen af ALDH1 og ALDH3 [20], [21], som oxiderer og inaktivere bioaktive metaboliske biprodukt af CPA, aldophosphamide /4-hydroxycyclophosphamide ( 4-HC) [22], [23]. ALDH1 især kan spille en stor rolle i CPA modstand, da det er
K
m
for CPA er ~52 uM, mens den for andre ALDH familiemedlemmer med CPA kataboliske aktivitet, ALDH3 (
ALDH3A1
) og SSDH (
ALDH5A1
), er 10 gange lavere (
K
m
520 uM) [24]. Selvom mange væv er relativt robust i kølvandet på CPA behandling [25], har kun hæmatopoietisk og neurale stamceller blevet påvist at indeholde høje ALDH aktivitet i rekonstituering transplantationsstudier efter isolering af disse cellepopulationer [26] – [28]. Fordi tarmkræft sandsynligvis skyldes kolon stamceller eller stamceller, er det fristende at hypotesen, at lignende mekanismer kan gøre CoCSC resistente over for CPA.
Kræft stamceller populationer er nu blevet prospektivt identificeret fra forskellige tumorer af epitelial oprindelse, herunder bryst, colon og prostata [19], [29] – [33]. I alle kolorektale tumorer har vi undersøgt til dato, kan tumorer med held transplanteret ved hjælp af små tal (
f.eks
1000) af celler fænotypisk positive for både epitel-specifikt antigen (
dvs.
ESA eller EpCAM) og CD44 [30]. I nogle tumorer, isolering af celler positive for CD166, udover ESA og CD44, beriger endvidere for tarmkræft stamceller (CoCSC), hvorfra effektive tumorigenese med så få som 200 ESA
+ CD44
+ CD166
+ -celler [30]. Ikke alene denne fænotype identificere CoCSC i xenotransplantattumorer, men tumorigenese kan initieres fra primære tumor prøver med et lille antal ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler. Den reproducerbar identifikation af CoCSC hjælp ESA og CD44 letter ikke kun terapeutiske effekt studier på tværs af alle patient-afledte xenotransplantater undersøgt til dato, men også letter dissektion af de molekylære veje involveret i tumorigenese og modstandsdygtighed over for terapi.
Her viser vi at human ESA
+ CD44
+ CoCSC generere adenocarcinomer, der ligner parentale tumorer i både deres fænotype og histologi ved seriel transplantation i en xenograft indstilling og er beriget i tumorer efter klassiske kemoterapeutiske regimener bestemt til at skrumpe tumorer. Vi demonstrerer yderligere både
in vitro
in vivo
at modstand mod CPA medieres, i det mindste delvist, ved ALDH1 enzymaktivitet og at resistens over for andre kemoterapeutiske midler (
f.eks
Irinotecan) ikke sandsynligt tilskrives denne mekanisme. Så vidt vi ved, er dette den første funktionelle demonstration af, at en human epitel CSC population som defineret ved seriel transplantation, er beriget i residuale faste tumorer efter kemoterapi. Vi demonstrerer endvidere, at tumor heterogenitet i form af et kompleks adenocarcinom sammensat af TG og NTG populationer kan genereres af en enkelt celle. Endelig de eksperimentelle metoder, der anvendes her, giver en platform for at vurdere effekten af nye stoffer rettet mod solide tumorer stamceller.
Resultater
CoCSC er beriget i resterende tumorer efter CPA administration
Tidlig passage menneske xenotransplantattumorer genereret fra cellerne aldrig udvidet
in vitro
synes at ligne dem i patienter, og dermed kan tjene som en glimrende model ved at studere kræft. Vi har for nylig vist, at subpopulationen af humane colorektale tumorceller med et ESA
+ CD44
+ fænotype er entydigt ansvarlig for generering heterogene adenokarcinomer i en xenograft indstilling (figur 1A B) [30]. Human ESA
+ CD44
+ -celler fra xenogene colorektale tumorer kan underinddeles baseret på CD166 ekspression, hvilket resulterer i berigelse for tumorgene (TG) celler blandt CD166
+ population. I modsætning hertil alle resterende cancerceller af human oprindelse forekommer ikke i stand til at indlede tumorvækst og omtales som ikke-tumorgene (NTG). Have identificeret kolorektal cancer stamceller (CoCSC), der kan brændstofpåfyldning xenogene tumorvækst, vi søgte at løse en dvælende spørgsmål på området om, hvorvidt CSC er fortrinsvis modstandsdygtige over for kemoterapeutiske stoffer.
A
) fænotypisk profil UM-C4 kolorektale tumorer for ESA, CD44 og CD166, efter udelukkelse af Mlın
– celler.
B
) fikseret i formalin, paraffin-indlejret tumorsnit fra CPA eller vehikelbehandlede kontrolmus farvet med hematoxylin Eosin (H UM-C6) og efter at have nået ~400 mm
3, mus blev randomiseret til enten bil eller 38 mg /kg CPA, to gange om ugen. Inden 15 dage efter randomisering og administration, tumorvækst var mærkbart forsinket i CPA-behandlede dyr (figur 1C og figur S1A). Efter aflivning blev tumorer fjernet til histologisk og fænotypisk analyse. Selvom andelen af prolifererende tumorceller (
dvs.
Ki-67
+) ikke vises ændret, der var mærkbart mere celledød (dvs. TUNEL
+ celler, figur 1B) og ESA
+ CD44
+ celler var hyppigere i tumorer fra CPA-behandlede mus (Figur 1D). Tendensen i retning af hyppigere ESA
+ CD44
+ celler i CPA-behandlede tumorer regel sted sande uafhængig af tumor volumen og blev mere udtalt ved højere CPA doser (
f.eks
38 mg /kg versus 25 mg /kg; data ikke vist). Berigelse af ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler var endnu mere slående og især tydeligt, når CD166 ekspressionen blev analyseret på residual human ESA
+ CD44
+ celler (figur 1E, S1B C). Lignende resultater blev observeret med begge de undersøgte xenogene tumorlinjer.
For at bestemme om den fænotypiske stigning i CoCSC efter CPA administration korreleret med en autentisk stigning i TG celle frekvens, vi serielt transplanteret 4 sæt af mus med bulk-UM-C4 tumorceller ved anvendelse af en begrænsende fortynding tilgang og scoret dem som positive eller negative for tumorvækst efter tre måneder. Mus med tydelige tumorer på 90 dage blev holdt i live for at afgøre, om tumorvækst ville fortsætte ud over 200 mm
3, kan så sjældne håndgribelige masser forekomme, men som indeholder murine stromale elementer og ingen påviselige humane celler upon analyse ved afslutningen af den undersøgelse (data ikke vist). Baseret på
Poisson
fordelingsstatistikker, TG celler 2,2 gange hyppigere i CPA-behandlede tumorer end hos mus administreret køretøj (
P
= 0,0016; Tabel 1 figur 2A) . Vigtigt er det, den cellulære fænotype af disse serielt transplanterede sekundære tumorer var identiske med de parentale tumorceller anvendt til initiering af undersøgelsen (figur 2B), hvilket viser, at mellemliggende behandling og serielle transplantation af celler i begrænsende fortynding ikke ændre hverken tumorigene potentiale CoCSC eller deres evne til at skabe heterogene tumorer overvejende indeholdende ikke-tumorigen (
dvs
CD44
-). celler
A) Begrænsning fortynding analyse af ufraktionerede UM-C4 tumorceller blev anvendt til at beregne TG celle frekvens ved hjælp af
Poisson
fordelingsstatistikker (± 95% konfidensniveau; *
P
= 0,0016).
B
) Procentdel af human ESA
+ CD44
+ og ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler i sekundære tumorer i forbindelse med resterende tumorigene celler transplanteres serielt begrænse fortynding efter køretøj eller CPA behandlingsregimer.
Fordi TG celler var hyppigere og tumor cellepopulationer fra CPA-behandlede dyr blev beriget for fænotyper forbundet med CoCSC, vi næste isoleret CoCSC fænotype celler fra UM-C4 tumorer af køretøj og versus CPA-behandlede mus og spurgt, om disse celler inhærent afveg i deres evne til at frembringe sekundære tumorer. Seriel transplantation af 50 ESA
+ CD44
+ eller ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler fra tumorer i CPA versus vehikelbehandlede kontrol mus resulterede i sekundære tumorer med nogenlunde samme frekvens (tabel 1), der, når ses i sammenhæng med tidligere observationer tyder på, at CoCSC er hyppigere inden tumorer udsat for CPA kemoterapeutiske regimer og er upåvirkede i deres evne til brændstof tumorvækst.
CoCSC har høj ekspression af
ALDH1A1
I søger efter yderligere CoCSC markører, vi tidligere har brugt et værktøj, der kan identificere hæmatopoietisk og neurale stamceller cellepopulationer: ALDH enzymaktivitet [30]. Brug af Aldefluor ™ reagens, som gennemgår et skift i fluorescens efter enzymatisk spaltning af ALDH enzymer, og ALDH1-specifikke inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB) [34], en stor underpopulation af ESA
+ CD44
+ celler fra både UM-C4 og UM-C6 tumorlinjer blev bestemt til at have høj ALDH aktivitet (figur 3A) [30]. Lignende observationer blev også gjort i andre patient-afledte xenograft kolorektale tumor linjer (Figur S2). Endvidere, når ESA
+ CD44
+ celler blev underinddelt baseret på ALDH aktivitet og isoleret ved FACS, ALDH
+ -celler var tumorigene i alle tilfælde undersøgte [30]. Notatet er tumorgenicitet strengt tillagt ved ESA
+ CD44
+ ALDH
+ celler i UM-C4 kolorektal tumor linje (figur 3B). Selvom tumorer kan opstå fra ESA
+ CD44
+ ALDH
– celler taget fra UM-C6, OMP-C5 og OMP-C8 tumor linjer [30], en ALDH
+ delmængde af TG ESA
+ CD44
+ -celler findes i alle xenogene kolorektale tumor undersøgt hidtil linjer (n = 6). I modsætning hertil en subpopulation af CD44
-. Celler med høj ALDH aktivitet findes også i alle tumor linier, men disse celler undlader at generere tumorer upon transplantation
A
) fænotypisk profil human ESA
+ UM-C4 tumorceller for ALDH1 enzymatisk aktivitet. Gates afgrænse tumor subpopulationer isoleret ved FACS for tumorigenisitetsforsøg studier, hvor
B
) vækst kinetik CD44
+ ALDH
+ (røde cirkler), CD44
+ ALDH
– (orange kasser) og CD44
-ALDH
+ (grønne trekanter) befolkninger er plottet. Målinger kun afspejle mus med palpable tumorer. Data, der repræsenterer N = 3 uafhængige forsøg.
C
) Taqman QRT-PCR-data viser relative udtryk for
ALDH1A1 Hotel (
1A1
),
ALDH3A1 Hotel (
3A1
)
og ALDH5A1 Hotel (
5A1
) i tumorigen (TG, sort) versus ikke-tumorigen (NTG, hvid) celler (n≥2) fra 2 patient-afledte xenogene kolorektale tumor linier (UM C4- UM-C6). Data afspejler Middelværdi ± SEM, er normaliseret versus
GUSB
og vises i forhold til UM-C4 NTG udtryk for hvert gen.
En undergruppe af ALDH enzymer kan oxidere, og dermed inaktivere, den cytotoksiske CPA metabolit 4-HC /aldophosphamide [23], [35]. Tilstedeværelsen af cytoplasmatiske ALDH1 og ALDH3 navnlig er blevet forbundet med CPA modstand i A549 lungecancer-cellelinje [20], [21]. ALDH1 (kodet af
ALDH1A1
) er større end 10 gange mere effektive til catabolizing 4-HC /aldophosphamide end dens relaterede familiemedlemmer ALDH3 og SSDH: kodet af
ALDH3A1
ALDH5A1
gener henholdsvis [24]. I Taqman ™ QRT-PCR-analyse af UM-C4 og UM-C6 tumorer,
ALDH1A1
udtrykkes generelt ved højere niveauer end
ALDH3A1
ALDH5A1
.
ALDH1A1
genekspression er 2,8 gange højere i CoCSC end i NTG celler, og på trods af let forhøjelse af
ALDH3A1
udtryk i CoCSC versus NTG populationer (figur 3C), dens budskab er knap påviseligt i enten tumorlinie. Derudover mens
ALDH5A1
er lidt forhøjet i TG versus NTG celler fra UM-C4 tumorer (~1.5-fold), dens udtryk er ens blandt disse populationer fra UM-C6 tumorer (figur 3C). Den præferentielle ekspression af
ALDH1A1
i TG-celler understøtter observeret enzymatiske aktivitetsmålinger blandt det humane ESA
+ CD44
+ subpopulationen, hvor de fleste af disse celler har høj DEAB-sensitive, ALDH1 aktivitet. Når den betragtes i sammenhæng med den 10 gange højere sprogfærdighed ALDH1 versus ALDH3 og SSDH på inaktivering CPA mellemprodukter [24], kan man fortolke disse resultater tyder på, at CoCSC resistens over for CPA kan overvejende medieret af ALDH1 enzymatisk aktivitet.
ALDH1A1
,
MYC
, og
MYB
er beriget i resterende TG celler skrive CPA terapi
Da
ALDH1A1
gen udtryk er forhøjet i TG versus NTG celler, ALDH1 enzymatiske aktivitet er disproportionably høj i celler med CoCSC fænotype, og denne aktivitet kan mediere resistens mod CPA, spurgte vi næste, om hyppigheden af ESA
+ CD44
+ ALDH
+ -celler var forhøjet i UM-C4, UM-C6 og OMP-C8-tumorer fra mus, der modtog CPA versus dem blive administreret bærer. Ligesom den observerede fænotypiske stigning i CD166
+ celler (figur 1E, S1B S1c), den ALDH
+ delpopulation af ESA
+ CD44
var konsekvent højere i CPA versus køretøj og + celler behandlede kontrol mus (67,6 ± 6,3% versus 56,8 ± 6,8%, henholdsvis; n = 5,
P
0,012 i parret
t
-test). (Figur 4A)
A
) Ratio af ALDH
+ tumorceller blandt den menneskelige ESA
+ CD44
+ befolkning i tumorer fra bærerbehandlede kontrol eller CPA-behandlede mus. Data afspejler den parrede Mean af 5 uafhængige forsøg med 3 forskellige xenogene kolorektale tumor linjer (UM-C4, UM-C6 OMP-C8) og n≥5 mus per eksperiment.
B
) Taqman QRT-PCR-data for de betegnes gener ved hjælp af TG og NTG populationer isoleret fra (V) køretøj og eller CPA-behandlede UM-C4 tumorer. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SEM (n≥2).
C
) Immunofluorescens eller immunoperoxidasefarvning af frosne eller formalin-fikseret, paraffin indlejret tumorer for ALDH1 eller c-myc, henholdsvis fra køretøj og og CPA-behandlede mus. Sort bar = 100 um
En række genprodukter er blevet anset for afgørende for normal colon udvikling og er bredt udtrykt i kolorektale tumorer [36] -. [39]. Efter isolering af TG versus NTG befolkninger mod både køretøj og og CPA-behandlede UM-C4 tumorer med 99% renhed, udtryk for mange gener med foreslåede bånd til kolorektal cancer blev bestemt af Taqman ™ QRT-PCR. De, der er differentielt udtrykt i TG versus NTG-celler, ikke kun
ALDH1A1
, som beskrevet ovenfor (figur 3C), men også c-Myb (
MYB
) og c-myc (
MYC
, figur 4B). I modsætning hertil gener forbundet med differentiering og en mesenchymal fænotype [40], [41], såsom vimentin (
VIM
), blev mere stærkt udtrykt i NTG-celler.
I overensstemmelse med den forhøjede frekvens af resterende tumorceller, der udtrykker høje niveauer af tumorigenisitetsforsøg-associerede markører, såsom CD166, relative ekspression af CoCSC-associeret versus NTG-associerede transkripter, såsom
ALDH1A1
VIM
henholdsvis blev yderligere uensartede i CPA versus vehikelbehandlede kontrolgruppe UM-C4 tumorer (figur 4B). I overensstemmelse med den hypotese, at ALDH1 kan have en rolle i at mediere resistens over for CPA,
ALDH1A1
genekspression blev yderligere forhøjet i tilbageværende celler med CoCSC fænotype, men
ALDH3A1
ALDH5A1
var ikke (figur 4B S3). Desuden gener tidligere identificeret som stærkt udtrykt i epitel stamceller /progenitorceller rum i bunden af kolon krypter og i neoplastisk væv (
f.eks MYB
MYC
) blev mere stærkt udtrykt i resterende tumor CoCSC end NTG population af celler, der repræsenterer størstedelen af tumoren, men som er genereret af CoCSC og synes mere modtagelige for CPA-induceret cytotoksicitet. Lignende ekspressionsmønstre blev også observeret i andre xenogene tumorlinjer følgende CPA-behandling, herunder UM-C6 (fig S3).
Endelig genekspression forskelle i CPA versus vehikelbehandlede kontrolgruppe tumorer blev yderligere korreleret med protein ekspression ved immunofluorescens og IHC. Intracellulære niveauer af ALDH1 og nuklear c-Myc, f.eks var mere fremherskende i CPA-behandlede tumorer (figur 4C). Interessant ALDH1 farvning i CPA-behandlede tumorer syntes at lokalisere til den apikale overflade, hvor den kan hypotese at opsnappe CPA-metabolitter som de kommer ind i cellen. I modsætning hertil ALDH1 proteinniveauer var lavere og mere diffus i kontroldyr tumorer. Ligeledes c-myc var mærkbart mere koncentreret i kernen af kolorektale tumorceller af CPA-behandlede mus, i overensstemmelse med den øgede hyppighed af TG celler og forhøjet
MYC
udtryk inden for denne elastiske befolkning.
CoCSC resistens mod kemoterapi er ikke specifik for CPA
for at bestemme om CoCSC også udvise resistens over for andre vigtige kemoterapeutiske stoffer, undersøgte vi virkningen af Irinotecan (
aka
SN-38) på CoCSC frekvens . Eksperimenter blev initieret hvorefter tumorbærende mus fik ugentlige injektioner af 15 mg /kg Irinotecan. Efter en lille forsinkelse på ca. 1 uge blev tumorvækst stoppet af Irinotecan (figur 5A). Ved tumor høst to uger efter initiering af kemoterapi, blev procentdelen af tilbageværende CoCSC bedømt ved flowcytometri. I irinotecan-behandlede tumorer, blev procentdelen af bulk tumorceller med CoCSC fænotype steg 61% versus kontrol mus administreret bærer (figur 5B). Dernæst den iboende tumorgenicitet af ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler fra køretøj og eller irinotecan-behandlede mus blev testet i en seriel transplantation indstilling versus de celler, der ikke fænotypisk klassificere som CoCSC. Lignende take satser blev observeret med CoCSC fra kontrol- eller irinotecan-behandlede tumorer i disse transplantationer, og celler fænotypisk klassificeret som “Andet” ikke indlede tumorer (data ikke vist). Den øgede hyppighed af CoCSC fænotype celler i resterende tumorer fra mus administreret Irinotecan og den manglende evne af celler med andre fænotyper at omplante sygdom sammen tyder på, at CoCSC er også fortrinsvis modstandsdygtige over for irinotecan.
A
) Efter randomisering at normalisere behandlingsgrupper ved 400 mm
3 på dag 43, en gang ugentlig administration af vehikel (grønne kasser) eller 15 mg /kg Irinotecan (røde trekanter) påbegyndt og tumorer blev målt to gange ugentligt. Vækstkurver repræsenterer gennemsnit ± SEM er vist. B) Procentdel af human ESA
+ CD44
+ CD166
+ CoCSC fænotype celler i resterende tumorer vises. Data afspejler n≥4 mus per behandlingsgruppe.
CPA modstand er specifik for celler med høj ALDH1 aktivitet
Se, at ESA
+ CD44
+ tumorceller har høj ALDH aktivitet, hyppigheden af ESA
+ CD44
+ ALDH
+ celler øges i tumorer fra mus behandlet med CPA, og
ALDH1A1
genekspression er forhøjet i CPA-resistent CoCSC vi derfor forsøgt at afgøre, om modstand mod CPA blev medieret af ALDH1 enzymaktivitet. Fordi ALDH1 specifik inhibitor DEAB er meget ustabilt
in vivo
[42],
in vitro
dyrkningsbetingelser, der understøtter TG kolorektal tumor celle ekspansion blev etableret. Især til den cellulære fænotype af celler bedste stand etablere kolonier
in vitro
blev ESA
+ CD44
+ CD166
+ (også, at af CoCSC), hvorimod FACS renset CD44
– celler var ude af stand til at gøre det (data nu vist). At bekræfte, at dette dyrkningssystem understøtter vedligeholdelse af TG-celler, vi sorteret ESA
+ CD44
+ CD166
+ CoCSC i begrænsende fortynding i plader indeholdende mitomycin C-behandlede 3T3 eller MEF fødeceller som støtte, afhængigt af tumor linje anvendes: UM-C4 eller UM-C6 hhv. Colony dannelse hyppigheden af CoCSC under disse betingelser var nogenlunde svarer til TG celle frekvens observeret ved transplantation (~1:86 ± 33, n = 7 for UM-C4 og 01:52 ± 5, n = 3 for UM-C6). Kolonier blev dyrket i 14 dage uden passage før reimplantation i mus. Ikke alene har celler opretholder ESA, CD44 og CD166 udtryk under
in vitro
kultur (figur 6A B), men evnen til at generere heterogene tumorer ligner forældrenes tumorer blev bevaret samt (figur 6C). At validere, at tumor-initierende celler i tumorer med oprindelse fra enkelt
in vitro Salg kolonier både lignede parentale tumorer og blev afledt af en enkelt celle, UM-C4-celler blev transduceret med et lentivirus bærer GFP-Luciferase, tumorer blev genereret og enkeltkolonier opnået fra ESA
+ CD44
+ CD166
+ celler blev transplanteret i mus. Efter høst af disse tumorer afledt af en enkelt koloni blev enten celler med CoCSC fænotype eller alle andre tumorceller med forskellige fænotyper isoleres ved FACS, og tumorigenisitetsforsøg og klonalitet blev udført.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.