PLoS ONE: AKT1E17K Is oncogen i Mouse Lung og Samarbejder med kemiske kræftfremkaldende stoffer inducere Lung Cancer

Abstrakt

hotspot Akt1

E17K mutation i pleckstrin homologi domæne Akt1- optræder hos ca. 0,6-2% af humane lungecancere. Vi har for nylig demonstreret, at Akt1

E17K omdanner immortaliserede humane bronkiale celler. Her ved brug af en transgen Cre-inducerbare murine stammen i vildtype Rosa26 (R26) locus (

R26-Akt1

E17K

mus) vi vise, at Akt1

E17K er en

bona-fide

onkogen og spiller en rolle i udviklingen af ​​lungekræft

in vivo

. Faktisk rapporterer vi, at mutant Akt1

E17K inducerer bronchiale og /eller bronchiolær hyperplastiske læsioner i murin lunge epitel, hvilket fremskridt frank carcinom med meget lav frekvens, og accelererer tumordannelse induceret af kemiske carcinogener. Afslutningsvis Akt1

E17K inducerer hyperplasi af mus lunge epitel

in vivo

og samarbejder med urethan at inducere fuldt maligne fænotype

Henvisning:. Malanga D, Belmonte S, Colelli F, Scarfò M, De Marco C, Oliveira DM, et al. (2016) Akt1

E17K Er oncogen i Mouse Lung og Samarbejder med kemiske kræftfremkaldende stoffer inducere Lung Cancer. PLoS ONE 11 (2): e0147334. doi: 10,1371 /journal.pone.0147334

Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), SPANIEN

Modtaget: Marts 30, 2015; Accepteret: 1. januar 2016 Publiceret: 9 feb 2016

Copyright: © 2016 Malanga et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC 2012-14, IG_12969) og Ministero Istruzione Università e Ricerca (MIUR PRIN, prot 2010W4J4RM_001 ; PONa3_00239, PON01_02782) til GV. HF blev støttet af Västra Götalandsregionen under LUA /ALF aftalen og af Assar Gabrielssons og Magnus Bergvalls Foundations

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en førende årsag til kræft-relaterede dødsfald, at blive associeret med en 5-års verdensomspændende overlevelse på mindre end 15% [1,2]. Mutations aktivering af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) vej er den vigtigste sygdomsfremkaldende begivenhed i ikke tobak-induceret adenocarcinom (ADC), mens vejen drevet af v-Ki-ras2 /Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (KRAS) er involveret i tobak-medieret lunge carcinogenese [3-6]. Desværre aktiverende mutationer i EGFR typisk ikke til stede i lunge pladecellecarcinom (SCC), den anden mest almindelige type af NSCLC [7], og dermed målrettet terapi er ineffektiv. Nylige undersøgelser viser 2-4% på p110 α-katalytisk subunit af PI3K (PIK3CA) mutationer [8-10] og 1% på Akt1- mutationer [11,12] i SCC har antydet, at målrette disse gener kan vise en vellykket terapeutisk option [7,13-15].

AKT kinaser (Akt1, AKT2, Akt3) repræsenterer den primære nedstrøms endepunkt af phosphoinositid 3-kinase (PI3K) vej, regulering spredning, overlevelse, metabolisme og invasion. Akt1 og AKT2 ofte aktiveres i human cancer [16-18] efter tab af lipidet phosphatase PTEN, aktiverende mutationer og /eller kopiere nummer variation i EGFR eller HER2 tyrosinkinasereceptorer, aktiverende mutationer i KRAS, i PIK3CA [19,20]

, [21] eller i Akt1 selv [22]. I lungekræft en somatisk mutation i pleckstrin homologi (PH) -domæne af Akt1- der resulterer i glutaminsyre til lysin substitution ved rest 17 (E17K) blev rapporteret med samlede hyppighed for 0,6-2% [7,11,12,23-25 ].

Akt1

E17K viser øget affinitet for PI (4,5) P2, forbedret plasmamembranen rekruttering og konstitutiv aktivering [22,26]. Endogen Akt1

E17K mutant protein påvist i lunge kræftceller viser forbedret membran lokalisering [11], hvilket resulterer i aktivering af downstream signalering [11,22].

rolle mutant Akt1-

E17K i epitelial tumorigenese fortsat uklart, fordi undersøgelser i cellulære modeller i bryst og lungeceller har produceret uoverensstemmende resultater [27-30]. Derudover ingen murine stamme, modeller Akt1

E17K mutation er blevet genereret hidtil.

Disse overvejelser fik os til at tage fat på rollen som Akt1-

E17K i omdannelsen af ​​lunge epitelceller

in vivo

. Heri, viser vi, at Akt1

E17K fremmer hyperplasi i muse lunge og samvirker med andre genetiske læsioner at inducere den fulde malignitet.

Materialer og metoder Salg

Vector Design og Generering af transgene mus

For at generere

R26-Akt1

E17K

transgene mus human Akt1 cDNA blev amplificeret ved PCR fra humane mononukleære blodceller ved PCR under anvendelse af primere 5′-ATGAGCGACGTGGCTATT- 3 ‘og 5′-TCAGGCCGTGCCGCTGGC-3’. PCR-produktet blev klonet ind i en shuttle-plasmid (pBlueScript) under anvendelse af standard kloningsteknikker. Mutant Akt1

E17K cDNA blev genereret af Quick Change site-Direct mutagenese (Stratagene) og sub-klonet ind i pROSA26 vektoren [31-33] for at opnå den targeting konstruktion pR26-Akt1

E17K, som bestod af 5 ‘ og 3’homologiarme ROSA26 locus, FRT /FRT-flankeret neomycinresistens (Neo) kassette og loxP /loxP-flankeret tredobbelt polyadenylering (tPA) sekvens. Se figur 1 for detaljer.

A. Skematisk fremstilling af targeting-konstruktet anvendes til den betingede knock-in i

R26

locus. Den menneskelige

Akt1

E17K

cDNA forudgået af en loxP-flankeret transkriptionel stop-kassette, blev rekombineret ind i R26 locus. Cre-medieret fjernelse af stop-kassetten forbinder Rosa26 exon 1 til den exogene cDNA tillader ekspression af transgenet. B. Southern blot af EcoRV-fordøjet genomisk DNA afledt fra mESCs transficeret med targeting-konstruktet bærer mutant Akt1. Bane 1: DNA fra ikke-målrettet mESCs, bane 2 og 3: DNA fra DNA fra to forskellige

R26-Akt1

E17K

mESCs stammer. Endogen allel svarer til 11,5 kb bånd (

WT

); mutante allel svarer til 4,3 kb bånd (

REC

). C. Relativ mRNA-ekspression af human Akt1-

E17K af Q-RT-PCR i målrettede mESCs og i de tilsvarende celler transficeret med Flp (pFlpE-IRES-Puro) eller Cre-rekombinase (PCRE-IRES-Puro). Dataene er fra gentagne eksperimenter som middelværdi ± SD. *** P 0,001. D. Genotype analyse ved PCR på halen-tip DNA af genetisk modificerede mus som angivet.

30 ug af R26-Akt1

E17K plasmid blev lineariseret med SfiI restriktionsenzym (New England, Biolabs) og elektroporeret i mus embryonale stamceller (Mesc). G418-resistente Mesc kloner blev isoleret og screenet for korrekt målretning af locus ved PCR (primere F1 og R1, henholdsvis: 5′-AGGGAACGCAGGGAGACTGAGGTGACCCTTCTTT-3 ‘, 5′-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGC-3) amplifikation en 3,9 kb fragment. PCR positive G418-resistente kloner blev efterfølgende screenet ved Southern blot sondering for 5’rekombination junction. Når identificeret, målrettet Mesc kloner blev transficeret med Flp-udtrykkende plasmid (pFlpE-IRES-Puro) til udskæring af Neo kassetten. Efterfølgende Neo-deleterede Mesc kloner blev isoleret, screenet ved PCR (primere F2 og R2, henholdsvis: 5’-CGGCCTCGACTCTACGATACCGTCGATCC-3 ‘, R2 5′-GGATCGAGATCTGATAACTTCGTA-3’) og injiceres i B6 blastocyster, som efterfølgende blev overført til pseudo -pregnant hunner til at producere kimære dyr på embryonale stamceller Facility af IRGS (Ariano Irpino, Avellino, Italien). De genererede kimærer blev avlet til at etablere kimlinjeoverførsel af den menneskelige allel. Genotyper af

R26-Akt1

E17K

mus blev bestemt ved PCR under anvendelse af genomisk DNA isoleret fra halen tips med følgende primere: 5’ARMF, 5′-AACTGCAGACTTGTGGGATAC-3 ‘ ; 3’ARMR, 5’-ATATTAGTCCACCTCACTCCT-3 ‘; mE17KR5 5’-GCCAACCCTCCTTCACAATA-3 ‘.

R26-Akt1

E17K

linje blev parret med

Ttf1-Cre

linie (en gave fra Dr. Mario De Felice, IRGS, Ariano Irpino, Italien ), til at generere

R26-Akt1

E17K

; Ttf1-Cre,

mus.

Ttf1

-Cre mus blev genotypebestemt ved anvendelse af følgende primere: FP, 5′-CCTGATGGACATGTTCAGGGACA-3 ‘: RP, 5′-GCCAGATCTCCTGTGCAGCATGT-3’.

R26-Akt1

E17K

mus blev tilbage-krydset på B6 baggrund. I alle forsøg blev søskende anvendt som kontroller.

Animal eksperimenter blev godkendt af den lokale etiske komité “Comitato Etico per la Sperimentazione Animale” (CESA) af IRSG og i overensstemmelse med regler og retningslinjer for Italien og Den Europæiske Union. blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser (S1 ankommer Tjekliste). Mus blev huset i et stærkt kontrolleret mikrobiologisk miljø at garantere SPF betingelser. De blev holdt i IVC bure, under konstante betingelser for temperatur (22 ± 2 ° C), fugtighed (55% ± 10 UR) og lys /mørke-cyklus på 12/12 timer. Dyrene havde fri adgang til bestrålede standard kost og vand. Mus blev genotypebestemt ved PCR af hale-DNA [34]. Sletningen af ​​loxP-flankeret transkriptionelle stop-sekvenser blev bestemt ved PCR ved hjælp af følgende primere:.

TRF, 5′-GGATCGACGGTATCGTAGAGTCGAGGCCG-3 ‘;

L2R 5′-GCCAATGAAGGTGCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3′

Angivelse af Akt1-

E17K i mESCs transficeret med PCRE-IRES-Puro blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR.

Southern blot

En standard protokol for Southern blot var anvendes. Genomisk DNA (30 ug) blev fordøjet med EcoRV. Et 500bp probe på 5′-siden af ​​det målrettede insertionsstedet (fra CTTGAAAGTGGAGTAACTAC til TCAGAAGCTTTGAACTAGAA i ROSA26 locus) blev mærket med DIG-dUTP, anvendelse af PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Schweiz). Denne sonde identificerer en 11,5 kb fragmentet i vildtype ROSA26 locus og et 4,3 kb fragment i målrettet ROSA26 locus.

Western Blot og antistoffer

Hele væv proteinekstrakter blev fremstillet med NP-40-puffer ( 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40) indeholdende proteaseinhibitorer (SigmaFast, Sigma-Aldrich). Western blot-analyse blev udført ved standardmetoder [11]. Anti-phospho-AKT (Ser473) (# 4058), anti-Akt1 (# 2938), anti-phospho-FoxO1 (Ser256) (# 9461), anti-FoxO1 (# 2880), anti-phospho-GSK3-α /β (Ser21 /9) (# 9331), anti-GSK3-α (# 9338), anti-GSK3-β (# 9332) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danver, MA).

Kvantitativ revers transkription realtids-PCR (Q-RT-PCR)

Totalt RNA blev fremstillet som beskrevet [35]. RT-PCR blev udført på RNA ekstraheret ved Trizol (Invitrogen) og retro-transcriberet med SuperScript II (Invitrogen). Q-RT-PCR blev udført ved anvendelse af Power SYBR Green PCR Master Mix i ABI Prism 7900 thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA). Genekspression blev normaliseret til GAPDH mRNA-indhold. De relative mængder af mRNA eller DNA blev beregnet ved den sammenlignende tærskelcyklus (CT) metoden [36]. Følgende primere anvendes i Q-RT-PCR

AKT1R26 frem 5′-CACACCACCTGACCAAGATG-3. ‘;

AKT1R26 omvendt 5′-AATCAAGGGTCCCCAAACTC-3′

Virus infektion af mus

Kontrol

R26 en

nd

R26-Akt1

E17K

mus blev inficeret med 10

6 eller 10

7 pfu Adenovira udtrykker Cre (Ad-Cre) (Vector Biolabs, Philadelphia, PA). Mus mellem 6 og 12 uger gamle, blev bedøvet med isofluran og Ad-Cre blev administreret intranasalt. Mus modtog 120 pi af Ad-Cre, i to doser på 60 pi hver, med en pause mellem de to doser, for at tillade musene at inddrive en normal vejrtrækning. Kontrolmus fik samme mængde buffer fosfat saltvandsopløsning (S1 ANKOMMER Checkliste).

Eksperimentel Carcinogenese

R26 eller R26-Akt1

E17K

kuld blev enten inficeret med Ad-Cre (10

6-10

7 PFU) eller er behandlet med opløsningsmiddel alene før modtager intraperitoneal injektion med en enkelt dosis på 1 mg /g legemsvægt af urethan, en ethylester af carbaminsyre udbredt i murine modeller af carcinogenese [37], opløst i sterilt 0,9% saltvandsopløsning. Musene blev overvåget ugentligt og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Ingen mus måtte aflives før den specifikke eksperimentelle endepunkt (6, 9 og 18 måneder, henholdsvis) af helbredsmæssige årsager. Mus blev aflivet efter 6, 9 og 18 måneder ved cervikal dislokation (S1 ARRIVE Checkliste). Lunger blev fjernet og oppustet med 10% neutral bufret formalin. Lungevæv blev opsamlet og fikseret med 10% formalin, og indlejret i paraffin under anvendelse af standardprocedurer. Lunge sektionering blev udført for at omfatte 1,5 mm i lunger parenkymatisk; frontale snit blev indsamlet på 15 niveauer med 100 um afstand) for sagittale afstand for at dække både perifere og centrale regioner. Sektioner blev monteret på objektglas og farves med hæmatoxylin ad eosin og blev evalueret ved lysmikroskopi af veterinære patologer og den menneskelige patolog (OP, HF og CM). For hver tumor objektglasset med maksimal læsion diameter blev identificeret og registreret under mikroskopet.

Histologisk analyse og immunhistokemi

Lungevæv blev opsamlet og fikseret med 10% formalin, og indlejret i paraffin under anvendelse af standard procedurer. Sektioner (5 um) blev monteret på objektglas og farves med hæmatoxylin og eosin skal vurderes ved lysmikroskopi af veterinær (OP og HF) eller human (CM) patologer. En kombineret score på hyperplastiske læsioner blev beregnet ved at tilføje en score måle antallet af epiteliale lag (Layer score) til en score måling procentdel af hyperplasi stede i hele strækningen (Global hyperplasi score). Det Layer point er defineret som følger: score 1, tilstedeværelse af 1-2 lag (r), score 2, tilstedeværelse af 2-3 lag, score 3, tilstedeværelsen af ​​ 4 lag. Den globale hyperplasi point er defineret som følger: score en, når hyperplasi var til stede i 1-20% af de samlede sektioner analyserede (3 serielle snit /mus); score 2, når hyperplasi var glad i 21-60% af de samlede sektioner analyseret (3 serielle snit /mus); score 3, når hyperplasi blev fundet i 61-100% af de samlede sektioner analyseres (3 serielle snit /mus).

Immunfarvning med anti-phospho-AKT blev udført med standard protokoller under anvendelse af Vectastain Universal Quick Kit og DAB peroxidase Substrat Kit (Vector Laboratories, Burlingame) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Antigen genfinding blev udført med mikrobølgebehandling i antigen afmaskering opløsning (VectorLaboratory, Burlingame, CA) i 10 minutter. Kanin anti-phospho-AKT (Ser473) (1: 1000, # 4058) blev købt fra Cell Signaling Technology

Immunfarvning for Ki67 blev udført med standard protokoller bruger Bond ™ Polymer Avanceret Detection (Leica Biosystem, Buffalo Grove. , IL) ifølge producentens instruktioner. Kanin-anti-Ki67 (1: 100, PA5-19462) blev indkøbt fra Fisher Scientific (Thermo Fisher Sientific, Pittsburgh, PA). Immunfarvning for p21 blev udført med standard protokoller vha EnVision ™ Detection Systems Dako, ifølge producentens instruktioner. Polyklonalt Ab-5; anti-p21 /WAF1 antiserum (1:50) blev indkøbt fra Oncogene Research Products (Cambridge, MA). Ki67 og p21 positivitet blev bestemt ved at tælle positive kerner i 10 felter på X400 forstørrelse

Laser capture microdissection (LCM)

mikrodissektions blev udført ved hjælp af Laser Microdissector Leica LMD6 LMD7 (Leica Microsystem, Milano). 5-um tumor vævssnit på objektglas blev indsat i Laser Microdissector for dissektion af lungetumorer. Udvalgte områder blev fanget med infrarøde laser pulser på CapSure Macro LCM Caps.

Direkte

Kras

sekventering

Mikrodissekterede prøver blev lyseret af SB LysePrep Kit (Silicon Biosystem, Bologna) i henhold til producentens anvisninger. Alikvoter af lysis-opløsning (2,5 ul) blev anvendt som template for DNA-amplifikation med de følgende primere: mKrasF-TCCTAC AGGAAACAAGTA og mKras R-TTATTTATGGCAAATACA. Amplifikationen anvendte program var: 95 ° C /5 minutter; 35x (95 ° C /30 s, 52 ° C /30 s 72 ° C /30 s) for denaturering, annealing og udvidelse; 72 ° C /7 min at afslutte forlængelse, efterfulgt af afkøling til 15 ° C. PCR-produkter blev separeret på 2% agarosegeler og oprenset ved QIAquick PCR oprensningskit (Qiagen). Oprensede PCR-produkter blev analyseret på 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). For alle analyser blev data tilpasset til konsensus sekvensen opnået fra BLAST GenBank databasen.

Immunfluorescensfarvning

afparaffineres sektioner blev hydreret i faldende ethanol gradient løsninger og skylles i vaskeopløsningen (TBST, 0,05 mol /L Tris saltvand med Tween 20). Antigen genfinding blev udført med citratbuffer pH 6 i 30 minutter ved 98 ° C efterfulgt af vask i phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4). Snit blev inkuberet med antistoffer mod SP-C (gede-polyklonalt antistof-anti-SP-C, 1: 200 fortyndingsvandet, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) eller CC-10 (gede polyklonalt antistof-anti-CC-10, 1 : 200 fortyndingsvandet, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) i 60 minutter efterfulgt af inkubering med sekundære Alexa Fluor 488-konjugeret anti-gede-IgG-antistoffer (1: 400 fortynding; Santa Cruz Biotechnology) i 60 min. Cellerne blev modfarvet med DAPI (2 mg /ml, Santa Cruz Biotechnology), monteres ved hjælp af anti-fade montering medium (DakoEnvision System, Inc., CA, USA) og observeret ved Fluorescence Microscopy (Leica Microsystems)

. Statistisk analyse

data præsenteret er midler ± SD af

n

uafhængige analyser eller replikerer som angivet i teksten. Kontinuerlige variabler blev analyseret ved t-test eller ANOVA-test, mens kategoriske variabler blev analyseret ved χ

2 eller Fishers eksakte test. Signifikans blev beregnet ved Log-rank (Mantel-Cox) test (GraphPad Prizm 5 Software, San Diego, CA).

Resultater

Mutant Akt1

E17K fremmer hyperplasi af bronkier og bronkioler

Vi genererede en transgen mus stamme (

R26-Akt1

E17K

), som betinget udtrykker human mutant Akt1 i lungen ved brug af en knock-in system (Cre betinget

Rosa26

,

R26

), som huser loxP-flankeret transkriptionel stop-sekvenser opstrøms for mutant Akt1 cDNA (fig 1A). Murine økonomiske og sociale råd blev målrettet og screenet ved Southern blot at identificere kloner, der bar rekombinante allel (fig 1B) og for Cre-induceret ekspression af transgenet (figur 1C). Cre-responsiv

R26-Akt1

E17K

mESCs blev derefter brugt til at generere kimære mus. Kønscelleoverførsel af det bankede-i-allelen blev bekræftet ved PCR (Fig 1D)

For at udtrykke mutant Akt1 i lunge epitel vi brugt to forskellige systemer:. Intranasal instillation af en adenovirus bærer Cre rekombinase (Ad-Cre) eller parring af

R26-Akt1

E17K

mus med

Ttf1-Cre

mus [38,39]. Anvendelse af

Ttf1-Cre

mus tilladt ekspression af transgenet i det bronkiale epitel [39]

, [40] henviser instillation af Ad-Cre viser fordelene ved at tillade den somatiske aktivering af transgenet i lappede områder og af ikke at vælge på forhånd den celletype, hvor transgenet udtrykkes.

i første sæt eksperimenter, vi krydsede

R26-Akt1

E17K Salg mus med

Ttf1-Cre

. Figur 2A viser sletningen af ​​loxP kassette i lungevæv af

R26-AKT

E17K

; Ttf1-Cre

mus; Figur 2B viser real-time RT-PCR udtryk for mutant Akt1- i lungerne og fig 2C viser forhøjede niveauer af phosphoryleret AKT og /eller AKT substrater (GSK3α /Ø, FOXO1) i lunger fra

R26-AKT

E17K

; Ttf1-Cre

mus sammenlignet med

R26-Ttf1-Cre

søskende. Vi målte Akt1 udtryk ved RT-PCR i yderligere fem væv (hale, muskel, nyre, milt, hjerte og lever) afledt af R26-AKTE17K; Ttf1-Cre og R26-Ttf1-Cre kuld mus, og resultaterne er vist i S1 Fig. Som vist er ingen ekspression observeres i væv forskellige fra lungerne.

A. PCR-analyse af lunge DNA fra

R26-Akt1

E17K

; Ttf1-Cre

og kontrol søskende. ΔStop tpa: lox-P flankeret transkriptionsterminering stopsignal. B. Relativ mRNA-ekspression af human Akt1- af Q-RT-PCR på RNA af lunger fra

R26; Ttf1-Cre

,

R26-Akt1

E17K

; Ttf1-Cre

. Data er præsenteret ved gentagen analyse som middelværdi ± SD. C. repræsentant immunoblotanalyse af Pakt, total Akt1- og nedstrøms signalering proteiner i alt proteinekstrakter fra hele lunger af

R26; Ttf1-Cre

R26-Akt1

E17K

; Ttf1-Cre

mus hhv. D-E. Repræsentant H Ttf1-Cre

R26-Akt1

E17K

; Ttf1-Cre

hhv. Forstørrelse som angivet. F-G. Repræsentant Pakt farvning af lunger fra

R26;. Nkx2

1-Cre

R26-Akt1

E17K

; Nkx2

.

1-Cre

hhv. Forstørrelse som angivet.

Mus af 2 (n = 10), 6 (n = 8) og 12 (n = 11) måneder blev ofret som endepunkter.

Ttf1-Cre

mus viste ingen tegn på sygdom op til 12 måneder (n = 7). Omvendt histo-patologiske analyse viste tilstedeværelsen af ​​hyperplastiske læsioner i lungen af ​​alle 12 måneder gamle

R26-Akt1

E17K

; Ttf1-Cre

mus (fig 2D og 2E). Disse mus viste moderat hyperplasi af de bronchiale og /eller terminal bronkieepitel med polariserede kerner. Alveolær epitel var normal selvom atelektase blev observeret i nogle mus. Immunfarvning med anti-pS473 påviste øget niveauer af AKT aktivering i de hyperplastiske lunger

R26-Akt1

E17K

; Ttf1-Cre

mus sammenlignet med kontrol eller

Ttf1-Cre

mus (fig 2F og 2G).

Vi aktiverede også mutant Akt1

E17K transgen ved intranasal administration af Ad-Cre (10

6, 10

7 pfu) i 6-12 uger gamle

R26-Akt1

E17K

mus. Efter 6, 9 og 18 måneder (n = 8, 8 og 7, henholdsvis) mus blev aflivet, og lunger blev analyseret. Vi har ikke observere lunge abnormiteter i

R26-Akt1

E17K

mus behandlet med opløsningsmiddel alene (PBS) (n = 7) (fig 3A). Omvendt stort set alle

R26-Akt1

E17K

mus udviklede moderat bronkial og /eller terminal bronchiolær hyperplasi på 9 måneder efter Ad-Cre administration (Fig 3B og 3C).

AD. Repræsentant H 4 lag epithelceller (n = 6 mus /gruppe; 3 serielle snit /mus ). Evaluering af omfanget af hyperplasi, score 1: hyperplasi i 1-20% af de samlede sektioner analyserede; score 2: hyperplasi i 21-60% af de samlede sektioner analyserede; score 3: hyperplasi i 61-100% af de samlede sektioner analyseres (n = 6 mus /gruppe; 3 serielle snit /mus). Læsioner blev klassificeret i henhold til en kombineret score fremkommer som summen af ​​partituret af lag og score på den procentdel af hyperplasi observeret (p 0,05; t-Student).

Blandt kontrolmusene Layer score var 1 til 4 ud af 6 mus og 2 i 2 ud af 6 mus. Global hyperplasi nu var 1 til 5/6 og 2 for 1/6 mus. Omvendt af

R26-Akt1

E17K

mus Layer point er 1 for 1/6 mus og 2 for 5/6 mus og global hyperplasi nu var 1 til 2/6 , 2 for 2/6 og 3 for 2/6 mus. Endelig fandt vi, at

R26-Akt1

E17K

mus præsenteret en kombineret score på hyperplasi på 3,8 ± 0,4, der var betydeligt højere end i kontrol mus (2,5 ± 0,3) ( n = 6 /gruppe; p. 0,05)

Efterfølgende undersøgte vi, om de hyperplasisk læsioner observerede var proliferative eller senescens-relaterede ved immonostaining af Ki67 og p21. Resultaterne er sammenfattet i tabel 2 og repræsentative billeder af farvning for Ki67 og p21 i muselunger er vist i S3 Fig. Vi fandt, at det gennemsnitlige antal Ki67-positive kerner i transgene R26-AKTE17K mus (11,1 ± 1,2, n = 5) var mere end 2 gange forøget sammenlignet med kontrolmus (4,6 ± 0,49, n = 3). Omvendt blev der ikke observeret nogen signifikant forskel på p21 farvning. Disse resultater tyder på, at de hyperplastiske læsioner induceret af Akt1

E17K i lungen af ​​transgene mus er et resultat af øget celleproliferation.

Det er at bemærke, at efter 18 måneder fra behandlingen, to ud af syv

R26-Akt1

+ /E17K

mus behandlet med Ad-Cre udviklet en enkelt knude hver, som blev diagnosticeret som bronchio-alveolær adenocarcinom med papillær mønster bestående af ledninger og reder af epitelceller omgivet af sparsom fibrovaskulær stroma (fig 3D). Immunfarvning analyse viste høje niveauer af Pakt i hyperplastiske og neoplastiske læsioner af

R26-Akt1

E17K

mus inficeret med Ad-Cre sammenlignet med lunger fra ikke-inficerede mus (fig 4A -4C).

Pakt immunfarvning af lungevæv fra

R26-Akt1

E17K

mus behandlet med opløsningsmiddel alene (A) eller inficeret med Ad-Cre efter 9 og 18 måneder fra infektion, henholdsvis (B, C).

som konklusion fremgår det, at den mutante Akt1

E17K allel inducerer moderat hyperplasi af bronkier og /eller terminal bronkioler, at der i på lang sigt, og ved lave frekvenser, kan udvikle sig til åbenlys karcinom.

Mutant Akt1

E17K samarbejder med kemiske carcinogener

i humane celler, Akt1

E17K fremmer proliferation og migration når det udtrykkes i bronchiale celler immortaliseret af Adeno 12 /SV0 hybridvirus [30]. For at undersøge om Akt1 mutationer er i stand til at samarbejde med andre onkogene hits også

in vivo

, vi gjort brug af ethylcarbamat (urethan), en kemisk forbindelse til stede i røg, som er blevet flittigt brugt til eksperimentelt modellere flertrins lunge carcinogenese [41].

R26 eller R26-Akt1

E17K

søskende var enten inficeret med Ad-Cre (10

6-10

7 PFU) eller behandles med opløsningsmiddel alene, før de udsat for urethan (1 mg /g) og analyseret efter 6 eller 9 måneder. Mangfoldighed og størrelsen af ​​tumorer /lunge viste sig at være betydeligt højere i

R26-Akt1

E17K

mus inficeret med Ad-Cre. At være relativt resistent over for urethan,

R26-Akt1

E17K

mus, der ikke tidligere var blevet eksponeret for Ad-Cre udviklet knuder i en ud af seks mus ved 6 måneder, og i en ud af 4 mus på 9 måneder efter urethan administration, (fig 5A). Omvendt næsten alle

R26-Akt1

E17K

mus, der var blevet inficeret med Ad-Cre forud for urethan administration, præsenterede lunge knuder både efter 6 (n = 4) og 9 (n = 6) måneders behandling. Det gennemsnitlige antal af tumorer udviklet af mutante mus behandlet med urethan og inficeret med Ad-Cre var 3 /mus efter 6 måneder og 7 /mus ved 9 måneder; Omvendt mus behandlet kun med urethan udviklet 0,15 tumor /mus efter 6 måneder og på 1,6 tumorer /mus ved 9 måneder (Fig 5A). Især størrelsen af ​​tumorerne er udviklet af mutante mus efter infektion med Ad-Cre var afhængige af dosis af Ad-Cre indgives (Fig 5B).

A. Lung tumor mangfoldigheden i

R26-Akt1

E17K

inficeret med Ad-Cre (6 og 9 måneder efter behandlingen, henholdsvis). Hvert punkt repræsenterer en mus; søjler repræsenterer middelværdi ± SD. ** P 0,01, * p 0,05. B. diameter lungetumorer genereret af urethan i

R26-Akt1

E17K

mus behandlet med stigende doser af Ad-Cre. Søjler repræsenterer middeldiameter på tumor ± SD. * P 0,05. C, D. repræsentant H G overgang i codon 61 fører til Q61 udskiftning med R. Se S4 Fig for repræsentative kromatogrammer. Disse resultater indikerer, at Akt1

E17K kan samarbejde med de onkogene begivenheder induceret af urethan i mus lunge (dvs.

Kras

gevinst på funktion mutationer), således fremskynde progression til åbenlyse tumorer.

I musen, Clara-celler linje bronchiolær epitel og udtrykke Clara celle-associeret protein 10 (CC10), mens alveolær type II (AT2) celler bor i alveolerne og udtrykke overfladeaktivt protein C (SPC) [42-44].

Derfor, for at karakterisere de celler, der udgør de lungelæsioner induceret af Akt1

E17K i mus, udførte vi indirekte immunofluorescens for SP-C og CC10 på FFPE lunge sektioner afledt af

R26-Akt1