PLoS ONE: Langsigtet Sphere Kultur Kan ikke opretholde en høj Ratio of Cancer Stamceller: en matematisk model og Experiment

Abstrakt

Erhvervelse rigelige og høj renhed cancer stamceller (CSCS) er en vigtig forudsætning for CSC forskning. På nuværende tidspunkt er forskerne normalt får høj renhed CSCS gennem flowcytometri sortering og udvide dem ved kortvarig sfære kultur. Det er dog stadig usikkert, om vi kan forstærke høj renhed CSCS gennem langsigtet sfære kultur. Vi har foreslået en matematisk model ved hjælp af sædvanlige differentialligninger til at udlede den kontinuerlige variation af CSC-forholdet i den langsigtede sfære kultur og anslået modelparametre baseret på en langsigtet sfære kultur af MCF-7 stamceller. Vi fandt, at CSC-forholdet i den langsigtede sfære kultur præsenteret som gradvist faldet afdrift og kan være stabilt på et lavere niveau. Desuden fandt vi, at udstyret model parametre kunne forklare de vigtigste vækstmønster af CSCS og differentierede kræftceller i langsigtet sfære kultur

Henvisning:. Peng T, Tsinghua M, Zhenning T, Kaifa W, jun J ( 2011) Langsigtet Sphere Kultur Kan ikke opretholde en høj Ratio of Cancer stamceller: en matematisk model og eksperiment. PLoS ONE 6 (11): e25518. doi: 10,1371 /journal.pone.0025518

Redaktør: Sui Huang, Institut for Systembiologi, USA

Modtaget: April 1, 2011; Accepteret: September 7, 2011; Udgivet: November 16, 2011

Copyright: © 2011 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev støttet af National Natural Science Fund af Folkerepublikken Kina (nr. 30.872.517). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i det sidste årti, flere og flere beviser har vist, at tumorer har oprindelse i en subpopulation af celler, der har selvfornyende og flerstrenget differentiering kapacitet, opkaldt cancer stamceller (CSCS) eller tumorfremkaldende celler (tics) [ ,,,0],1] – [3]. Endvidere er CSCS blevet bekræftet at være oprindelsen af ​​cancer tilbagefald og metastase [4] – [6]. Derfor har forskning i CSCS blevet et knudepunkt for kræftforskning.

Erhvervelse rigelige høj renhed CSCS er en vigtig forudsætning for CSC forskning. I 2003 Al-Hajj et al. først rapporteret, at kun en lille gruppe af brystcancerceller, der har en CD44

+ CD24

– /low fænotype har evnen til at opretholde tumordannelse [7]. Således kan høj renhed CSCS fås gennem flowcytometri sortering. Ikke desto mindre er lavt forhold mellem CSCS blandt kræftceller betyder, at vi næppe kan få nok CSCS for yderligere forsøg umiddelbart efter flowcytometri sortering. Dario Ponti et al. viste, at brystkræftceller kan danne mammospheres ved dyrkning uden serum i adhærerende retter og at denne metode kunne berige CD44

+ CD24

– /lav brystkræft CSCS [8]. Endvidere gliom, colorektal carcinom og andre former for CSCS er blevet dyrket efter samme metode. Derfor har CSCS blevet udvidet gennem sfære kultur [9] – [12]. Men om langsigtet sfære kultur kan opretholde en høj andel af CSCS er uklar.

Symmetrisk og asymmetrisk division er to slags vækst mønstre for CSCS [13], [14]. Én CSC kan opdeles i enten to identiske CSCS gennem symmetrisk division eller et CSC og en differentieret kræftcelle gennem asymmetrisk division. Desuden kan differentierede kræftceller forvandle CSCS gennem epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [15]. I mellemtiden vil differentierede kræftceller blandet med CSCS fra flowcytometri sortering og afledt af asymmetrisk division også formere når de dyrkes. Ikke desto mindre indflydelse af de førnævnte processer på CSC-forholdet i suspension kultur uden serum er ukendt.

For at forudsige den kontinuerlige variation af CSC-forholdet i langsigtet sfære kultur, vi først foreslået en kinetisk model ved hjælp af almindelig differential ligninger, der anses for den symmetriske og asymmetriske opdeling af CSCS samt spredning og omdannelse af differentierede kræftceller. Den teoretiske analyse viste, at der ville være en stabil andel af CSCS i en langsigtet sfære kultur afhængigt af modelparametre og indledende forhold af CSCS. For at underbygge vores teoretiske resultat, vi designet en langsigtet sfære kultur af menneskelig brystkræft MCF-7 stamceller. Baseret på de eksperimentelle data, anvendelse af en adaptiv Metropolis-Hastings (M-H) algoritme til at foretage en omfattende Markov-kæde-Monte Carlo (MCMC) simulation, opnåede vi de estimerede parameterværdier. Ifølge de numeriske simuleringer baseret på eksperimentelle data, fandt vi, at den observerede andel af CSCS kunne opfanges af vores model, og at de monterede parametre havde eksperimentel betydning.

Materialer og metoder

Model Beskrivelse

Lad og betegne befolkningen størrelser af CSCS og differentierede kræftceller på tidspunkt

på langsigtet sfære kultur, hhv. Fordi cellerne dyrkes på en ikke klæbende fad, og der er tilstrækkelige næringsstoffer i denne kunstige miljø, kan vi antage, at de observerede bølger i et kort tidsinterval ændringer, siger længde, er proportionale med befolkningstallene størrelser, dvs. hvor konstanterne kaldes netto fødselstal eller iboende vækst på befolkningen henholdsvis. Vi se og som værende en glat funktion af. Derefter dividere med og passerer til grænsen giver følgende differentialligninger:

Fordi vækstmønster CSCS omfatter symmetrisk og asymmetrisk opdeling [13], [14], og fordi differentierede kræftceller kan forvandle CSCS gennem visse modaliteter såsom EMT [15], nogle differentierede cancerceller og CSCS vil opstå under spredning af CSCS og differentierede cancerceller hhv. For at forenkle modellen, definerer vi den asymmetriske division proces, en CSC deler sig i en CSC og en differentieret kræftcelle som at CSC først opdeler symmetrisk i to CSCS og derefter en af ​​dem konverterer til en differentieret kræftcelle. Tager som omregningskursen fra CSCS til differentierede kræftceller i færd med CSC spredning og som omregningskursen fra differentierede kræftceller til CSCS i processen for spredning af differentierede kræftceller, kan vi bruge følgende matematiske model til at beskrive den interaktive vækst af CSCS og differentierede kræftceller i en langsigtet kugler kultur: (1) hvor og og alle parametre er ikke-negative konstanter

Eksperimentel Procedure

Cell kultur

Menneskelig brystkræft MCF-7 celler (fra Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences) blev dyrket adhærent med DMEM medium (Hyclone), 10% føtalt kalveserum (Hyclone) og 100 U /ml penicillin-streptomycin løsning A. CD44

+ CD24

– /lav CSCS fra MCF-7-celler blev opnået ved flowcytometri sortering og blev podet med 1000 celler /ml i en stamcelle kultursystem til dannelse mammospheres som tidligere beskrevet [8]. I ikke-adhærerende retter, CSCS blev dyrket i suspension ved hjælp af serum-frit DMEM-F12-medium (1:01, Hyclone) suppleret med 20 ng /ml EGF (BD Biosciences), 20 ng /ml bFGF (BD Biosciences), 4 mg /ml B27 (Invitrogen) og 100 U /ml penicillin-streptomycin-opløsning A. mammospheres blev dissocieret hver 10-12 dage ved enzymatisk fordøjelse med 0,25% trypsin-EDTA-opløsning (Invitrogen) ved 37 ° C i 3 minutter og mekanisk spredning. Enkelte celler blev frigivet ved forsigtig pipettering og filtreres gennem et 70 um celle si. Cellesuspensionen blev centrifugeret ved 500 g i 3 min. Efter supernatanten blev kasseret, blev enkelte celler inokuleret med 1000 celler /ml og dyrket til dannelse mammospheres i de førnævnte betingelser.

flowcytometri.

Flowcytometri sortering og testning blev udført under anvendelse BD FACSAria II FACS sorteringsanlæg (BD Biosciences) at gå efter CD44

+ CD24

– /lave CSCS fra MCF-7 klæbende celler og registrere CD44

+ CD24

– /lav CSC-forholdet i mammospheres. Adhærente celler eller mammospheres blev dissocieret enzymatisk og mekanisk som førnævnte og filtreret gennem en 40 um sigte at gøre enkelt cellesuspension. Derefter, mindst 1 × 10

5-celler blev centrifugeret ved 500 g i 3 minutter ved 4 ° C, resuspenderet i 10 pi PE-konjugeret anti-CD44 (BD Biosciences) og 10 pi FITC-konjugeret anti-CD24 (BD Biosciences), derefter inkuberet ved 4 ° C i mørke i 30 minutter. I mellemtiden blev celler inkuberet henholdsvis med isotype af CD44 og CD24 som negativ kontrol, og PE-konjugeret anti-CD44 eller FITC-konjugeret anti-CD24 som enkelt positiv kontrol hhv. De mærkede celler blev vasket 3 gange og derefter analyseret ved FACS sorteringsanlæg. Hver analyse opdaget 10.000 celler.

Resultater

Teoretisk analyse af Model (1)

I matematik, Laplace transformere er en lineær operatør af en funktion med en reel argument ( ), og det kan omdanne til en funktion med en kompleks argument, som er defineret som. Den inverse Laplace transformere er givet ved det komplekse integral, hvor er et reelt tal, så konturen vej integration er i området af konvergens. Da Laplace transformere har den nyttige egenskab, at mange relationer og transaktioner i originalerne svarer til enklere relationer og transaktioner i billederne, kan det bruges til at løse differentiale og integrerende ligninger. Lad. Den Laplace transformationen af ​​differentialligninger (1) er (2) Fra disse ligninger (2) efter nogle beregninger, vi obtainwhere er de virkelige rødder andengradsligning af en variabel.

Under den inverse forvandler af kundeemner til (3), som er de løsninger til model (1).

Bemærk at og. Vi kan obtainwhich betyder, at andelen af ​​CSCS i en langsigtet sfære kultur tendens til at være en stabil størrelse. Bemærk thatUsing (3), har vi (4) og (5) Da (4) er enklere end, vil vi bruge (4) at estimere modellens parametre.

Det er værd at bemærke, at vi kan få steady-state af forholdet ved en simpel algebra metode. Men ved hjælp af algebra metode, vi kan ikke udlede de eksplicitte modelparametre til vores viden (se bilag S1). Således har vi stadig bruge Laplace transformation her for at gøre hele papiret synes mere overensstemmende.

Eksperimentelle resultater

CSC-forholdet i MCF-7 brystkræftceller var 1,8% (figur 1A), som er i overensstemmelse med den tidligere rapport [16]. Efter flowcytometri sortering, blev en post-sortering analyse udført for at bestemme renheden af ​​de sorterede cellepopulationer. Høj renhed CD44

+ CD24

– /lave CSCS hvis forholdet var så høj som 96,2% blev opnået (figur 1B). CD44

+ CD24

– /lave CSCS fra MCF-7 celler eller enkelte celler fra mammospheres dannede kompakte sfærer inden 10-12 dage i suspension kultur uden serum. Men sammen med den langsigtede sfære kultur behandling, de observerede CSC nøgletal i mammospheres præsenteres som gradvist faldet, drift (Figur 1B-G og tabel 1) og endelig stabiliseret omkring 1,5%.

(A) CSC forhold i MCF-7-celler dyrket med serum. (B) Renheden af ​​sorteres CSC populationer påvist efter flowcytometri sortering straks. (C-G) CSC-forholdet i mammospheres dyrket i 52, 84, 117, 150 og 160 dage.

Model-baserede Skøn

For at beregne den procentdel af CSCS (tabel 1), vi først bestemt forholdet mellem differentierede cancerceller til CSCS (tabel 1). For at estimere, og vi ansat en adaptiv Metropolis-Hastings (MH) algoritme til at foretage en omfattende Markov-kæde Monte Carlo (MCMC) simulering (figur 2), der er beskrevet tidligere [17], [18] og opnåede de stabile værdier for 4 parametre (,,,). Således kan vi konkludere, at de iboende vækst i CSCS og differentierede kræftceller er, og henholdsvis og de omregningskurser fra CSCS til differentierede kræftceller og fra differentierede kræftceller til CSCS er og Hhv.

( A) Tilfældig serien; (B) histogram. Algoritmen løb for 10.000 iterationer med en burn-in på 3.000 iterationer. De indledende betingelser var

og

.

Brug de estimerede værdier, vi plottet den bedste løsning ved montering af forsøgsdata (figur 3A). Endvidere har vi plottet den langsigtede tendens, der viste, at forholdet mellem differentierede cancerceller til CSCS vil stabilisere omkring 71 efter 200 dage (figur 3B). Dette betyder, at procentdelen af ​​CSCS vil have tendens til at være 1,4%.

(A) den bedste tilpasning af de eksperimentelle data. (B) Den langsigtede tendens.

Følsomhedsanalyse

Vi brugte lokale følsomhed koefficienter (LSC) til at måle følsomheden af ​​parametre, herunder, og. Som tidligere rapporteret [19], [20], ved vi, at LSC defineres som graden af ​​variation i design funktion under små ændringer af hvert design variabel, som kan beregnes ved: (6) Da hver parameter har forskellige dimensioner , at sammenligne følsomhed koefficienter af hver parameter, vi standardisere (6) aswhere er ændringen vifte af parameter.

Under summen af ​​kvadrater af afvigelserne (SSD) som design funktion og stigende eller faldende 1% , 2%, 3%, 4% og 5% af hver parameter, vi opnåede den tilsvarende LSC’er. Da der var en LSC efter hver ændring af parameteren, der var ti LSC’er for hver parameter. Følgelig blev middelværdien og standardafvigelsen for LSC’er beregnes for hver parameter (figur 4). Envejs ANOVA blev anvendt til at sammenligne forskellene, og Tamhane s T2 test blev anvendt til multiple sammenligninger grund ulige varians. Vi ved, at midlerne til (716.5037 ± 528.0119) og (925.3620 ± 688.3240) er betydeligt større end (73,4361 ± 4,8421) og (75,3665 ± 13,7670). Fordi en større følsomhed koefficient svarer til en højere grad af følsomhed, kan vi konkludere, at og, de iboende vækst i CSCS og differentierede kræftceller henholdsvis er de vigtige parametre for den stabile procentdel af CSCS i en langsigtet sfære kultur.

diskussion

Selvom forskerne normalt få høj renhed CSCS gennem flowcytometri sortering og udvide dem på kort sigt ved kugle kultur i et ikke klæbende miljø uden serum [21], den vækst mønstre af CSCS og differentierede kræftceller i langvarig sfære kultur i denne tilstand er ikke klart. Om vi ​​kan få rigelige høj renhed CSCS gennem denne metode er også usikker. I dette projekt, vi først foreslået en matematisk model til at udlede den kontinuerlige variation af CSC-forholdet i den langsigtede sfære kultur. For at estimere modelparametre, vi så designet en langsigtet sfære kultur af brystkræft MCF-7 stamceller, da MCF-7-cellelinje fulgte CSC modellen og dens CSC markør, CD44

+ CD24

– /lavt, blev generelt bekræftet og let afsløres ved flowcytometri [7] – [8], [22]. Fra eksperimentet resultater og numeriske simulationer, fandt vi, at forholdet mellem CSCS på langsigtet sfære kultur præsenteret som gradvist faldet afdrift og kan være stabilt på et lavere niveau. Desuden i forbindelse med modellen og eksperiment data, fandt vi, at udstyret model parametre kunne forklare de vigtigste vækstproces af CSCS og differentierede kræftceller i sfære kultur.

Fra de monterede parametre i vores model, vi først bemærket, at den iboende vækst i differentierede cancerceller er større end den intrinsiske vækst i CSCS, hvilket betyder, at selvom dyrket i en ikke klæbende miljø uden serum differentierede cancerceller også vil proliferere og deres vækst hastighed er lidt hurtigere end den for CSCS. Ikke desto mindre er forskellen mellem deres opformeringsrater ved dyrkning i denne tilstand er meget mindre end i adhærerende kultur. Dette er den vigtigste årsag til den vedvarende faldende forholdet CSCS. I mellemtiden kan dette resultat og progressionen i forholdet differentierede cancerceller også forklare, hvorfor den proliferative aktivitet af kugler stiger til meget sene subkultur stadier sammenlignet med tidligere passager [23]. I mellemtiden, den iboende vækst i CSCS, er ca. 20 gange større end den omregningskurs fra CSCS til differentierede kræftceller, som tyder på, at den vigtigste spredning mønster af CSCS i denne kultur betingelse er symmetrisk division frem asymmetrisk division eller differentiering i en adhærent kultur miljø med serum [8] – [10], [23]. Dette resultat fører til et højere forhold mellem CSCS en sammenlignende lang tid i denne kultur. På grund omregningskursen for CSCS til differentierede kræftceller, er næsten 10 gange større end omregningskursen for differentierede kræftceller til CSCS, betyder det, at den asymmetriske opdeling af CSCS er større end transformation af differentierede kræftceller til CSCS i denne kultur tilstand, der også understøtter den lave procentdel af CSCS på lang sigt sfære kultur. Derudover skønt omregningskursen for differentierede kræftceller til CSCS, er lille, dens eksistens angiver, at i denne kultur tilstand differentierede kræftceller kan stadig spontant konvertere til CSCS, hvilket er i overensstemmelse med de tidligere eksperimentelle resultater [24], og kan være en vigtig årsag til, at sfære kultur kan berige CSCS [8].

fra vores forskning, herunder de eksperimentelle data og teoretisk analyse af den matematiske model, fandt vi, at selv om CSCS var bare dyrket i et ikke klæbende miljø uden serum var der en afdrift af CSC stat mod en tilsyneladende ligevægt tilstand, hvor der var færre CSCS end på såning. Dette resultat kan være en tegn på ikke-genetisk heterogenitet i tumorer, fordi der ikke var nogen kunstigt genetisk ændring i hele kulturen processen [25]. For at få rigelige høj renhed CSCS ved sfære kultur baseret på ekspressionen af ​​en begrænsende forhold af differentierede kræftceller og CSCS i (5), foreslår vi følgende lovgivningsmæssige foranstaltninger: opnå en højeste indledende forhold af CSCS, hæmmer differentiering eller asymmetriske division af CSCS og fremme omdannelsen af ​​differentierede kræftceller til CSCS, såsom ved dyrkning med TGF-β til at øge EMT [15], [26].

Bemærk, at parametrene estimering i denne matematiske model blev kun baseret på vores eksperimentelle data testning brystcancercellelinje MCF-7 CSCS, der blev dyrket som mammospheres. Selv om den model kan anvendes til at forudsige den kontinuerlige variation af CSC-forholdet i næsten alle former for fast tumor CSC sfære kultur, parametrene kan ikke anvendes i udstrakt grad på grund af de forskellige karakteristika ved forskellige tumorer. Imidlertid bliver denne forskning netop beskrevne processen med dyrkning høj renhed CSCS som sfærer. proceduren for at berige CSCS af sfærer kultur, kan dog være anderledes. Ved en anden fremgangsmåde ville en stor mængde af differentierede cancerceller undergå apoptose i de tidlige faser på grund af dårlig justering til suspensionen dyrkningsbetingelser. Men i vores tilstand, kan tilpasning til suspensionskultur miljø være grunden differentierede cancerceller stige gradvist [22]. Derfor vil de parametre, som beskriver den CSCS berigningsproces også være forskellige i forhold til dette papir. Selv vores forenklet model var gyldig til at fange væksten og overgang mønster af CSCS kultur (dvs., afslører den mekanisme af strukturelle heterogenitet af kræftceller), mere kompliceret dynamisk system (f.eks celle nummer /tæthed afhængig vækst og omregningskurser) kunne være muligt at tilpasse disse seneste opdagelser af CSCS [24], [27] – [28]. Vi vil gerne studere disse parametre og alternative modeller videre nord i det fremtidige arbejde.

Støtte oplysninger

Appendiks S1. Salg bet for algebra metode til beregning af steady-stete af forholdet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0025518.s001

(DOC)

Tak

Vi er meget taknemmelige for to anonyme dommere og den akademiske redaktør for omhyggelig læsning og værdifulde bemærkninger, som førte til en forbedring af vores oprindelige manuskript. Forfatterne vil gerne takke Zhao Bin (lektor, engelske redaktør af kinesisk Tidende Breast Disease), Yu Shicang og Wang bin (MD af Patologisk Institut, Southwest Hospital, Third Military Medical University, PR China) til kritisk læsning af manuskript og venligt at give værdifulde råd.