PLoS ONE: Identifikation af en ny epitop i uPAR som et mål for Cancer Therapeutic monoklonale antistof ATN-658, en Structural homolog af det uPAR Binding Integrin CD11b (αM)

abstrakt

urokinaseplasminogenaktivatorreceptorfunktion (uPAR) spiller en rolle i tumorudvikling og er blevet foreslået som et mål for behandlingen af ​​cancer. Vi beskrev for nylig udvikling af en hidtil ukendt humaniseret monoklonalt antistof rettet uPAR og har anti-tumor aktivitet i multiple xenograft dyretumormodeller. Dette antistof, ATN-658, hæmmer ikke ligandbinding (dvs. uPA og vitronectin) til uPAR og dets virkningsmekanisme er fortsat uklart. Som et første skridt i forståelsen af ​​anti-tumor aktivitet af ATN-658, vi satte os for at identificere epitop på uPAR til hvilke ATN-658 binder. Styret af sammenligninger mellem primat og menneske uPAR blev epitopkortlægningsundersøgelser udført ved anvendelse flere ortogonale teknikker. Systematisk stedrettet og alaninscanningsmutagenese identificeret region aa 268-275 af uPAR som epitopen for ATN-658. Ingen kendt funktion er tidligere blevet tilskrevet denne epitop Strukturelle indsigt i epitopgenkendelse blev opnået fra strukturelle studier af Fab-fragmentet af ATN-658 bundet til uPAR. Strukturen viser, at ATN-658 binder til DIII domæne af uPAR, tæt på C-terminus af receptoren, der bekræfter epitopkortlægningsundersøgelser resultater. Interessant nok når de bindes til uPAR, den komplementaritetsbestemmende region (CDR) regioner af ATN-658 nøje efterligner de bindende regioner af integrin CD11b (αM), en tidligere identificeret uPAR ligand menes at være involveret i leukocyt rullende, migration og komplementfiksering med ingen kendt rolle i tumorudvikling af faste tumorer. Disse undersøgelser viser en ny funktionel epitop på uPAR involveret i tumor progression og demonstrere en hidtil ukendt strategi for den terapeutiske målretning af uPAR

Henvisning:. Xu X, Cai Y, Wei Y, Donér F, Juarez J, Parry G, et al. (2014) Identifikation af en ny epitop i uPAR som et mål for Cancer Therapeutic monoklonale antistof ATN-658, en Structural homolog af det uPAR Binding Integrin CD11b (αM). PLoS ONE 9 (1): e85349. doi: 10,1371 /journal.pone.0085349

Redaktør: Francesco Bertolini, Europæiske Institut for Onkologi, Italien

Modtaget: April 10, 2013; Accepteret: December 4, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud fra NIH (HL086584) til MH, NCI (CA125564), til Harold Chapman (YW) og (CA151461) til (TVO og APM) og og H Foundation og Lynn Sage Breast Cancer Foundation (APM). Dette arbejde blev støttet af de tjenester i Tumor Biology Core (TBC) af Northwestern University, som nyder godt af filantropiske støtte fra Robert H. Lurie Cancer Center og kemi livsprocesser Institute. X-ray data for denne undersøgelse blev målt ved beamline × 29 i National Synchrotronbestrålingscenter Lyskilde og APS SER-CAT beamline 22ID. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Fernando Doner, Jose Juarez, Graham Parry og Andrew P. Mazar var ansat af Attenuon på tidspunktet for undersøgelsen. Andrew Mazar og Thomas O’Halloran har ejerandel og Andrew Mazar modtager konsulenthonorarer fra Tactic Pharma, en start-up virksomhed, der nu ejer rettighederne til ATN-658. Andrew Mazar er en opfinder på den udstedte patent for ATN-658. Flere amerikanske patenter udstedt dækker ATN-658 samt epitop. Disse patenter er US # 8.101.726 “ligander binder komplekset af urokinase plasminogenaktivator (uPA) og dens receptor (uPAR), der hæmmer downstream uPAR interaktioner: identifikation og brug i diagnose eller terapi” (Parry og Mazar), og US # 8.105.602 “Urokinase plasminogenaktivator receptor epitop, monoklonale antistoffer afledt deraf og metoder til anvendelse heraf “(Parry og Mazar). Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Metastase og angiogenese deler mange fælles fænotypiske træk som fører til invasion og migration af tumor og endotelceller. Disse omfatter opregulering af protease og integrin ekspression, tab af celle-celle- og celle-matrix-kontakter, en stigning i modtagelighed for vækst- og differentieringsfaktorer, og remodellering af ekstracellulær matrix (ECM) og basalmembranen (BM) [ ,,,0],1], [2]. Den (uPA) -system urokinaseplasminogenaktivator, bestående af uPA, en specifik celleoverfladereceptor for uPA (uPAR), og serpin inhibitorer af uPA, såsom plasminogenaktivator inhibitor-1 (PAI-1), spiller en central rolle i mange af disse aktiviteter [3] – [6]. Aktiviteten af ​​dette system er ansvarlig for at iværksætte kaskader, der resulterer i aktiveringen af ​​plasminogen og flere pro-metalloproteaser (proMMPs) [7], [8], frigivelse og behandling af latente vækstfaktorer deponeret i ECM, såsom FGF-2, VEGF, HGF, og TGF-β [9] – [12] og remodellering komponenter af ECM såsom vitronectin og fibronectin [13], [14]. Disse aktiviteter er generelt medieret af den proteolytiske funktion af uPA ved binding til uPAR, kan moduleres ved inhibering af uPA ved PAI-1, og forekommer i det ekstracellulære miljø. Derudover uPAR interagerer også med mange andre ligander i tillæg til uPA herunder flere integriner såsom α5β

1, α3β

1, og α5β

3 [15] – [17], samt andre celler overflade og ECM ligander, herunder vitronectin og G-proteinkoblede receptorer [6]. Flere af disse interaktioner er blevet påvist at være vigtige for tumorcelleoverlevelse, invasion, og angiogenese [6], og involvere uPAR-afhængig signalering.

Af disse grunde uPAR er blevet foreslået som et terapeutisk mål for behandling af cancer. Trods en overflod af litteratur, der påviser vigtigheden af ​​uPAR i progressionen af ​​de fleste faste cancere, herunder bryst- [18], colon [19], prostata [20], pancreas [21], ovarie- [22], lunge [23] og hjerne [24] samt flere hæmatologiske maligniteter såsom akut leukæmi og myelom [25], ikke uPAR målrettet terapeutisk middel er blevet udviklet eller evalueret i kræft kliniske forsøg til dato. er blevet foreslået en række antistoffer, som direkte inhiberer bindingen af ​​uPA til uPAR og testet i prækliniske undersøgelser, men de fleste af disse har kun demonstreret beskedne antitumorvirkning og blev derfor aldrig fremført ind i klinikken.

For nylig, vi identificeret og udviklet en ny uPAR målrettet monoklonalt antistof, der udviser robuste antitumorvirkninger i en række forskellige dyretumormodeller, men blokerer ikke bindingen af ​​uPA til uPAR [22], [26] – [28]. Dette antistof, ATN-658, har flere unikke egenskaber, der adskiller den fra tidligere uPAR målrettede tilgange. En vigtig funktion er, at ATN-658 er, at den ikke blokerer uPA-binding til uPAR og er i stand til at binde til uPAR, selv når det er besat af uPA, men ikke desto mindre inhiberer migration og invasion

in vitro

[22] , [27]. ATN-658 har ingen effekt på uPA medieret plasminogen aktivering, men har en række effekter på signalveje og ekspression af forskellige gener impliceret i tumor progression når evalueret i modeller for prostatakræft og kræft i æggestokkene

in vitro

in vivo

[22], [27]. Et af de mest slående observationer med ATN-658 er, at den farmakologiske målretning af uPAR med dette antistof fører til robuste antitumorvirkninger i en bred vifte af faste tumor xenograftmodeller [22], [26] – [28]. Antitumorvirkninger er observeret uanset tumorhistologi i disse modeller og i tillæg til inhibering af metastase

in vivo

, som ville blive forudsagt for en uPAR targeted middel, ATN-658 er også i stand til at inhibere tumor proliferation og inducerer apoptose [22], [26], [28]. Men det strukturelle og mekanistiske grundlag for disse antitumorvirkninger forblive uklar.

For at løse dette problem, vi karakteriserede epitop på uPAR til hvilke ATN-658 binder. Epitopen for ATN-658 blev oprindeligt kortlagt under anvendelse af site-directed mutagenese og bekræftet af en hidtil ukendt deuterium udveksling massespektrometrisk teknik (H /D-udveksling massespektrometri, Exsar). Denne epitop blev bestemt til at være en epitop, for hvilken ingen funktion i uPAR tidligere er blevet beskrevet. Desuden har vi bestemt krystal strukturer i ATN-658-Fab-fragment alene og i kompleks med uPAR, det aminoterminale (uPAR bindende domæne) af uPA (ATF), og somatomedin B-domænet (SMB) af vitronectin. ATN-658 Fab binder til DIII af uPAR, i overensstemmelse med de epitopkortlægningsundersøgelser resultater. Epitopen på uPAR for ATN-658 er tæt på C-terminalen, og har ingen overlap med urokinase og vitronectin bindingssteder. Denne undersøgelse viste også strukturel homologi mellem ATN-658 CDR loops og uPAR bindende region integrin αM. Desuden viste vi, at ATN-658 bindende blokerer sammenslutning af en anden integrin, α5β1, til uPAR og svækker dermed integrin α5β1-medieret adhæsion til ekstracellulær matrix. Disse resultater tyder på en tidligere ukendt mekanisme, hvormed uPAR kan fungere i tumor progression og en roman epitop for den terapeutiske målretning af denne receptor.

Materialer og metoder

cellelinier

humane tumorlinier PC-3 (prostata-adenocarcinom), HeLa (cervical carcinoma) og humant lungecancer-cellelinie H1299 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Begge cellelinier blev dyrket i Dulbeccos modificerede minimum Eagles medium tilsat 10% føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin. Muse tumorcellelinien B-16 (melanom), hund osteosarkom (D-17) og udødeliggjort afrikansk grøn abe (AGM) nyreceller (COS-1) blev efterprøvet at udtrykke uPAR ved RT-PCR og western blot med et polyklonalt kanin-uPAR antiserum (rD2D3) vides at krydsreagere med uPAR fra flere arter som beskrevet tidligere [29]. uPAR udtrykkende celler blev derefter brugt til at evaluere evnen hos ATN-658 at krydsreagere med forskellige non-human uPAR. Både rekombinant opløselig uPAR (suPAR, rester 1-277) og ATF (aminosyreresterne 1-143 af uPA) blev produceret i Drosophila S2 celler som udskilte proteiner

E. Coli

[31].

Karakterisering af monoklonalt antistof ATN-658

ATN-658 blev rejst mod en chymotryptisk fragment af opløselig uPAR (suPAR) omfattende DIIDIII (aa 88-283 af modent uPAR) udtrykt i

Drosophila

S2-celler under anvendelse af standardteknikker. Kort fortalt blev Balb /c-mus immuniseret med suPARDIIDIII fragmenter konjugeret til KLH og størrelsen af ​​immunresponset overvåget ved ELISA. Baseret på disse data, blev hybridomer frembragt ved fusionering af miltceller med myelomacellelinien P3x63Ag8.653. Frosne lagre af 10 parentale hybridomaer blev fremstillet og fem og blev oprenset som beskrevet [30]. SMB-domæne-protein (aminosyreresterne 1-50 af humant vitronectin) var en venlig gave fra Dr. Aiwu Zhou, udtrykt i af hybridomerne underkastes begrænsende fortynding. Vævskultursupernatanter fra disse monoklonale antistoffer blev derefter undersøgt for aktivitet i ELISA-assays og isotypen af ​​hvert antistof bestemmes ved anvendelse IsoStrips (Roche) .ATN-658, isotype IgG1ĸ, bundet suPAR immobiliseret til plastic med en K

D af -1 nM og ioderet ATN-658 specifikt bundet uPAR på overfladen af ​​HeLa-celler med en K

D på -5 nM. Kd af ATN-658 for suPAR blev også bekræftet under anvendelse af overfladeplasmonresonans (BIAcore). Western blot analyse viste, at ATN-658 var specifikt for human uPAR og ikke krydsreagerer med muse uPAR. ATN-658 blev oprenset fra vævsdyrkningssupernatant ved søjlekromatografi under anvendelse af protein-A Sepharose, typiske udbytter varierede fra 60-120 mg /l vævskultursupernatant og renheden af ​​det færdige materiale var 95% som bestemt ved HPLC. Biotin-ATN-658 blev fremstillet for helcelle bindingsassays og til flowcytometri som beskrevet tidligere [27].

Fremstilling af ATN-658 Fab fragmenter

ATN-658 Fab fragmenter blev fremstillet ved omfattende proteolytisk fordøjelse af det rensede antistof (5 timer, 37 ° C) med immobiliseret papain (Pierce). ATN-658 Fab fragmenter blev separeret fra antistoffet Fc-domæner af protein-A-affinitetskromatografi og de oprensede Fab-fragmenter karakteriseret ved SDS-PAGE. For at bekræfte, at de oprensede ATN-658 Fab fragmenter bevaret evnen til at binde uPAR med høj affinitet udførte vi kompetitive assays anvendelse af biotinyleret ATN-658 [27] og immobiliseret suPAR. Proteinet blev koncentreret til 5 mg /ml under anvendelse af Millipore Ultrafree centrifugal filtre for protein krystallisation.

Evaluering af bindingen af ​​ATN-658 til celler in vitro

artsspecificitet for ATN-658 binding var evalueret ved helcelle bindingsassays eller flowcytometri som tidligere beskrevet [27]. Helcelle bindingsassays blev udført på celler (300.000 /brønd) udpladet på gelatineovertrukne plader med 12 brønde (Costar # 3516) og fik lov til at binde natten over. Efter grundig vask med Hanks pufrede saltopløsning (HBSS; Invitrogen, Inc.) indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA; Sigma) adhærente celler blev inkuberet med varierende koncentrationer af biotin-mærket ATN-658 i HBSS /0,1% BSA i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask 3 gange med HBSS /0,1% BSA blev cellerne inkuberet med HRP-konjugeret streptavidin i yderligere 0,5 timer ved stuetemperatur, brøndene vasket som beskrevet ovenfor og bundet antistof påvises ved inkubering med OPD-substrat (Sigma). Efter farveudvikling 0,1 ml substrat blev overført fra hver brønd til en plade med 96, reaktionen standset ved tilsætning af 20 pi 1mH

2SO

4 og absorbansen ved OD-490 nm registreres. Forud for flowcytometri adhærente celler blev høstet med trypsin og resuspenderet i FACS buffer (2% føtalt bovint serum i PBS). Celler (2 x 10

6 celler i 200 pi FACS buffer) blev inkuberet med ATN-658 (slutkoncentration 10 ug /ml), kontrol muse IgG, et kanin-polyklonalt antistof (1:100 fortynding) mod et fragment af human uPAR (rDIIDIII) eller normalt kaninserum (NRS) i 1 time ved 4 ° C. Efter inkubation blev cellerne vasket tre gange med 1 ml FACS buffer og resuspenderet i 100 pi FACS buffer indeholdende enten gede-anti-kanin eller gede-anti-muse Alexa Fluor 488 konjugerede sekundære antistoffer (Invitrogen, Inc.) og inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C. Celler blev vasket som beskrevet ovenfor og resuspenderet i 0,5 ml FACS buffer forud for erhvervelse af flowcytometri data.

stedorienteret mutagenese studier af ATN-658-binding til primatmodeller uPAR

Afrikansk grøn abe ( AGM) suPAR blev klonet fra COS-1-celler ved PCR, sekventeret, og proteinet udtrykkes som tidligere beskrevet for human suPAR [30], [32]. Site-directed mutagenese af AGM suPAR plasmidtemplate blev udført under anvendelse af en QuikChange steddirigeret mutagenese-kit (Stratagene, Inc.) ifølge producentens instruktioner til frembringelse af ni mutanter, hvor hver aminosyre unik for AGM suPAR blev erstattet med den tilsvarende humane suPAR sekvens. Sekventering og restriktionsfordøjelse af hvert muterede plasmid blev anvendt til at bekræfte sekvensen ændringer, og at den resterende sekvens forblev intakt. AGM mutant suPAR cDNA blev derefter subklonet ind i en Drosophila-ekspressionsvektor (pMT /BiP /V5-HisA) indeholdende V5-epitop flag og anvendt til transfektion af S2-celler. Lille skala (500 ml) shaker kulturer blev etableret for at producere protein til eksperimenter og proteinekspression blev bekræftet ved Western blot under anvendelse af en pAb [29] mod uPAR at krydsreagerede med primat suPAR. Kultursupernatanter (CS) for hver klon blev klaret ved centrifugering og portioner immun-udfældet ved hjælp af ATN-658 og protein-G Sepharose. Bundne proteiner blev påvist ved western blot under anvendelse af krydsreagerende kanin-anti-DIIDIII polyklonale antistof beskrevet ovenfor. En anden uPAR MAb, ATN-615, som også er artsspecifikke for human uPAR og for hvilken epitop var allerede kendt fra røntgenkrystallografi undersøgelser [33], [34], blev anvendt som kontrol til at validere denne IP metode.

Alternativt kultursupernatanter blev analyseret ved ELISA under anvendelse af et anti-V5-antistof og biotinyleret anti-uPAR antistoffer ATN-658 og ATN-617. ATN-617 [27] er et monoklonalt antistof der binder til en anden epitop på uPAR og krydsreagerer med AGM suPAR. Plader blev overtrukket med V5-antistof (1 mg /ml) i PBS (100 pi brønd i en 96 brønd EIA /RIA høj binding plade). Efter 3 timers inkubation ved stuetemperatur blev brøndene vasket og derefter inkuberet med 1 × kasein /vand (200 uL /​​brønd) i 2 timer ved stuetemperatur for at blokere ikke-specifik binding. Brøndene blev vasket og 100 pi kultursupernatant blev sat til hver brønd og inkuberet O /N ved 4 ° C. Kultursupernatanter blev anslået til at indeholde -3 ug /ml suPAR. Biotin ATN-658 eller biotin-ATN-617 (1 ug /ml) blev derefter tilsat til brøndene og inkuberet i yderligere 0,5 time ved stuetemperatur efterfulgt af omfattende vaskning. Endelig blev Streptavidin-HRP tilsat, og efter yderligere inkubering og vask blev farve udviklet ved anvendelse OPD og bundet ATN-658 eller bindes ATN-617 blev påvist ved absorbans målt ved 490 nm som tidligere beskrevet [27].

epitop kortlægning af ATN-658 af H /D-udveksling massespektrometri (H /D-Ex)

1,5 mg ATN-658 Fab fragment blev immobiliseret på 200 mg POROS AL harpiks (Applied Biosystems) i henhold til producentens anvisninger. Pull-down eksperimenter blev udført under anvendelse suPAR-DIIDIII at bekræfte specificiteten og bindingskapacitet affinitetssøjlen. ATN-658 Fab konjugerede perler (353 pi) blev resuspenderet i 700 pi deutereret phosphatpuffer (50 mM KH

2PO

4, 50 mM NaCl, pH 7,4) og fik lov at komme i ligevægt ved 4 ° C.suPAR- DIIDIII blev resuspenderet i 40 pi D2O pH 7,4 (Cambridge Isotopes) til enten 150, 500, 1500 eller 5000 sekunder for at tillade fuldstændig deuteration af overflade amider. Mærket suPAR-DIIDIII og affinitetsharpiks blev derefter blandet sammen i 10 minutter ved 4 ° C. Tilbage udveksling af opløsningsmiddel eksponerede amider blev udført ved at erstatte

2H phosphatbuffer med H

2O og inkubering ved 4 ° C i et tidsrum svarende til trinnet mærkning. En kontrol blev udført ved at binde umærket suPAR-DIIDIII til ATN-658 Fab konjugerede perler og mærkning det bundne materiale ved inkubering med 700 pi deutereret phosphatbuffer for de tider, der er anført ovenfor. Tilbage udveksling blev derefter udført som beskrevet. Reaktionerne blev quenchet og suPAR-DIIDIII elueret fra affinitetssøjlen under anvendelse af 40 pi 0,8% myresyre. Efter tilsætning af 20 pi 8 M urinstof, 1 M TCEP, pH 3,0 det eluerede materiale blev injiceret i Hydrogen /Deuterium Exchange massespektrometri (H /D-Ex) platform (Exsar, Monmouth Junction, NJ), der består af tandem immobiliseret pepsin og C18 separeringssøjler. De fordøjede fragmenter blev separeret og analyseret ved massespektrometri og identiteten af ​​hver top identificeres ved sammenligning med data opnået ved kontrolforsøg under anvendelse af deuterium-mærkede og umærkede suPAR-DIIDIII fordøjet med pepsin.

Protein krystallisation og røntgen dataindsamling

suPAR-ATF-kompleks blev dannet ved inkubering ATF med suPAR ved stuetemperatur i 50 mM HEPES og 100 mM NaCl pH 7,4 og blev oprenset på en gelfiltreringssøjle Superdex 75. Det eluerede kompleks blev derpå tilsat overskud ATN-658 Fab, og det ternære kompleks ATN-658-uPAR-ATF blev oprenset igen på en Superdex 200 gelfiltreringskolonne. Forud for krystallisation blev SMB tilsat til det ternære kompleks ved et 2:01 molforhold, og derefter koncentreret til 10 mg /ml uden nogen yderligere oprensning. Krystallisation blev udført under anvendelse mødet dråbedampdiffusion metode ved 22 ° C. De afbøjende kvalitet ATN-658 Fab krystaller blev dannet ved anvendelse 20-22% PEG 3350, 0,1 M Tris pH 8,0-8,5. Til krystallisation af ATN-658-uPAR-ATF-SMB kvaternære kompleks, proteinet ved 10 mg /ml blev blandet med et tilsvarende volumen af ​​reservoiret opløsning indeholdende 0,1 M HEPES, pH 7,5, 55% (v /v) Tacsimate, og 2 % (vol /vol) 2-methyl-1,3-propandiol. Triangle krystaller blev typisk dukkede op efter et par måneder og voksede til en endelig størrelse på 0,15 × 0,15 × 0,15 mm

3.

ATN-658 Fab krystaller blev cryo-beskyttet med tilsætning af 20% glycerol til moderluden. Diffraktion data indsamlet ved 100 ° K på Avancerede Photon Sources (beamline 22-ID, SER-CAT) .X-diffraktion dataindsamling for komplekset blev udført ved 100 K på NSL Brookhaven National Laboratory (stråle linje × 29 ). De fleste ATN-658-uPAR-ATF-SMB kvaternære krystaller diffrakterede meget svagt, sædvanligvis mindre end 6 Å. Dette skyldes formentlig højt indhold opløsningsmiddel (76% opløsningsmiddel) og tilstedeværelsen af ​​en lang akse af krystallerne (c = 391,58 Å). Efter utallige forsøg med forskellige krystaller, forskellige strategier for dataindsamling og udforskningen af ​​forskellige kryo-beskyttelsesmiddel løsninger. Diffraktionsdata blev opsamlet fra en flash-kølet krystal, som var cryo-beskyttet af en sekventiel neddypning i Moderluden med forøget koncentration af ethylenglycol til den endelige koncentration på 10% (v /v) til 4,6 Å opløsning. Diffraktionsdataene blev indekseret og behandlet i den HKL2000 program [35]. Dataindsamlingen og endelige strukturelle raffinement statistik for begge konstruktioner er integreret i tabel 1.

Struktur beslutsomhed og raffinement

De strukturer ATN-658 Fab blev løst ved molekylær udskiftning metode (MOLREP [36] af CCP4 program suite [37]) under anvendelse af et antistof struktur (PDB entry 2DDQ) som en søgning model. Modellen blev derefter underkastet flere runder af manualen bygning ved hjælp Coot [38] vekslede med behersket forfining ved anvendelse Refmac5 [39]. I de sidste cyklusser af raffinement, TLS med tyve TLS grupper for hver kæde (genereret af TLS motion bestemmelse (TLSMD) server [40] var inkluderet i raffinement.

Denne ATN-658 Fab strukturen blev derefter anvendt som en molekylær erstatning model til at løse strukturen af ​​den kvaternære kompleks (ATN-658-uPAR-ATF-SMB) ved molekylær erstatning fremgangsmåde under anvendelse af programmer MOLREP [36] og CNS [41]. en suPAR-ATF model (PDB entry 1fd6 [ ,,,0],33]) blev derefter anbragt i krystallerne af de kvaternære komplekser ved molekylær erstatning (molrep [36]). på trods af den lave opløsning af denne krystal (4,5 Å), blev opnået meget stærke molekylære udskiftning løsninger for begge modeller. Efter forfinelse under anvendelse af CNS-programmet [41], viste Fo-Fc forskel elektrontæthed elektrontætheden for SMB domæne af vitronectin, hvilket yderligere bekræfter de korrekte molekylære erstatningsløsninger. de resulterende modeller med alle fire proteinkomponenter blev yderligere raffineret under anvendelse af CNS v1.3 [41] og REFMAC [39], og justeres manuelt ved program O [42] eller Coot [38].

Alle endelige strukturer blev analyseret og valideret af PROCHECK [43], PyMOL [44] og MOLSOFT ICM [45] . Koordinaterne for den rapporterede struktur er blevet deponeret i Protein Data Bank (FBF). Den endelige statistik, validering og stereokemiske kvalitet for strukturen er rapporteret i tabel 1.

Co-immunoprecipitation

HT1099 celler blev lyseret i Triton lysis buffer (50 mMHepes, pH 7,5, 150 mM NaCI og 1% Triton X-100) suppleret med proteaseinhibitorer og 1 mM PMSF. Klarede lysater blev immunfældet med antistoffer ATN-615 og ATN-658. Immunopræcipitaterne blev blottet for uPAR (R2) eller integrin α5 (pAb).

celleadhæsionsassay

celleadhæsionsassayet blev udført som tidligere beskrevet [46]. Kort fortalt blev H1299 celler inkuberet i DME /0,1% BSA med 500 uM RGD eller RAD peptider i 1 time ved 37 ° C og blev derefter podet på fibronectin (5 pg /ml, Sigma) overtrukne plader med eller uden ATN-615 . Efter vask blev vedhæftede celler fikseret og farvet med Giemsa. Dataene blev kvantificeret ved at måle absorbansen ved 550 nm.

Resultater

ATN-658 binder ikke til ikke-humane uPAR

Indledende undersøgelser vurderet bindingen af ​​ATN-658 til celler fra forskellige arter, som udtrykte uPAR. uPAR-ekspression blev bekræftet i alle cellelinjer først ved RT-PCR efterfulgt af western blot under anvendelse af en kanin-anti-humant uPAR pAb (rD2D3) at krydsreagerer med uPAR fra gnaver og hund. Denne undersøgelse blev foretaget for at identificere mulige dyrearter, der kunne bruges til fremtidige toksikologiske undersøgelser af ATN-658. Biotin-ATN-658, som bevarede fuld bindingsaktivitet af umodificeret ATN-658 [27], blev anvendt til denne evaluering. Biotin-ATN-658 bandt ikke til muse melanom (B16) celler (fig. 1A) eller afrikansk grøn abe (AGM) (fig. 1B) immortaliserede nyreceller (COS-1) i helcelle-mætning bindingsforsøg, hvorimod mættelig binding blev observeret til uPAR udtrykker human prostatacancer-cellelinie, PC-3 (fig 1A . B), som tidligere beskrevet [27]. Disse resultater blev bekræftet og udvidet til at omfatte hund osteosarcomceller (D-17) ved hjælp af ikke-biotinyleret ATN-658 og en isotop matchet IgG som en negativ kontrol og evalueres ved hjælp af flowcytometri (fig. 1C).

A B. Specificiteten af ​​ATN-658 blev målt ved direkte bindingsassays under anvendelse uPAR udtrykkende muse melanom (B16), human prostatacarcinom (PC-3) og afrikansk grøn abe (COS-1) -celler og biotin-mærket ATN-658. B. FACS-analyse blev udført under anvendelse HeLa-celler (der udtrykker human uPAR), D-17 lungecarcinomceller (udtrykkende hunde uPAR og COS-1-celler. Hver cellelinje blev inkuberet med normalt kaninserum (NRS), et kanin-polyklonalt antistof rejst mod et fragment af humant uPAR (rDIIDIII), muse-IgG (mlgG) eller ATN-658 og den passende FITC-mærket sekundært antistof.

Identifikation af epitopen for ATN-658 på human suPAR ved steddirigeret mutagenese

Sekvensalignment af primat DIIDIII uPAR sekvenser afslørede, at human og AGM uPAR kun afveg ved ni aminosyrepositioner (tabel 2). Disse ni aminosyre-forskelle var tilstrækkelig til fuldstændigt at ophæve bindingen af ​​ATN-658 til AGM uPAR. således har vi klonet og udtrykt AGM suPAR i S2-celler og gjort ni forskellige mutanter, der sekventielt erstattet én aminosyre fra AGM sekvens i hver mutant med den tilsvarende humane aminosyre (fig. 2A). den indledende evaluering af disse mutanter var kvalitativ hvor evnen af ​​ATN-658 til at immunpræcipitere (IP) en given mutant fra kultursupernatanten (CS) fra celler, der udtrykker denne mutant blev vurderet. ATN-615, som også er menneskelig uPAR specifikke, men som havde vi allerede identificeret epitopen [33], [34], blev brugt til at bekræfte anvendeligheden af ​​denne fremgangsmåde. ATN-615 var kun i stand til IP den H192R suPAR mutant (klon 2. Figur 2A). Dette er konsistent med den beskrevne epitop for ATN-615, som består af aa 187-192 (fig. 2A). Faktisk er den eneste aminosyre forskel mellem AGM og human uPAR i denne epitop er aa 192. Tilsvarende ATN-658 var kun i stand til IP den E268K (klon 8) suPAR mutant implicerer denne rest som en del af ATN-658 epitop . Alaninscanningsmutagenese omkring denne aminosyre kortlægger sekvensen fra aa 268-275 som epitopen for ATN-658 (S1). Da IP er en kvalitativ vurdering af binding, fange ELISA analyser blev sat op for at måle den faktiske affinitet ATN-658 for de forskellige AGM suPAR mutanter som det var muligt, at måske mere end aa 268 var påkrævet for at genoprette fuld binding aktivitet for ATN-658 når AGM suPAR sekvensen blev muteret til den humane sekvens. Da AGM suPAR mutanter blev udtrykt med et inkorporeret V5 flag, blev et anti-V5 flag antistof anvendes til at indfange AGM suPAR på fast fase. kunne derefter bestemmes Bindingsaffiniteten for hver AGM mutant hjælp mætning bindingsundersøgelser som tidligere beskrevet for ATN-658 [27]. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, bindingen af ​​ATN-658 blev kun observeret at klone 8 med en K

d

~ 2 nM, svarende til K

d

af ATN 658 til human suPAR og for humane uPAR udtrykkende celler indikerer, at denne enkelt aminosyre ændring var ansvarlig for fuldstændig ophævelse af ATN-658 binding til AGM suPAR (fig. 2B). Denne enkelte aminosyreændring ikke ophæver ATN-658 binding gennem et globalt virkning på suPAR konformation siden bindingen af ​​ATN-617, som binder til DIIDIII og betyder krydsreagerer med AGM suPAR, blev ikke ændret (fig. 2C).

A. Enkelt punkt mutanter blev indført i AGM suPAR sådan, at en enkelt aminosyre blev ændret fra den AGM sekvens til den humane uPAR sekvens og proteinerne udtrykt og oprenset som beskrevet i Materialer og Metoder. Hver klon er identificeret ved nummer (1-9) med det punkt mutation identificeret under nummeret ved hjælp af enkelt bogstav aminosyren kode. Bortset fra det enkelt punktmutation, resten af ​​suPAR sekvens er den af ​​AGM. suPAR mutanter blev udtrykt i S2-celler og supernatanter inkuberet med enten ATN-615 eller ATN-658 efterfulgt af immunfældning som beskrevet i Materialer og Metoder. suPAR blev derefter detekteret ved western blot under anvendelse af et kanin-polyklonalt antiserum dannet mod human suPAR. B. ELISA-assays blev anvendt til at måle bindingsaffiniteten af ​​ATN-658 til de forskellige suPAR kloner beskrevet i (A). Capture på ELISA-pladen var gennem V5 tag og detektion brugte biotin-ATN-658. C. Biotin-ATN-617 blev brugt i en lignende ELISA-format som beskrevet i (B) for at bekræfte, at indførelsen af ​​den fælles punktmutation havde ikke en global effekt på suPAR conformation.ATN-617 krydsreagerer med abe suPAR og alle kloner syntes at bevare denne reaktivitet efter indførelse af mutationen.

Tilpasning af denne epitop på tværs af flere arter af uPAR hjælper med at forklare arten specificitet ATN-658 binding (3). De gamle verdens primater (aber, chimpanser) er evolutionært tættere på mennesket og har homologe uPAR til menneske i epitopen for ATN-658. ATN-658-binding er blevet observeret af immunhistokemi til chimpanse væv i overensstemmelse med denne observation. I modsætning hertil nye verden primat (makakaber, AGM) uPAR adskiller i de fleste tilfælde ved en enkelt rest, aa 268, og dette er tilstrækkeligt til helt at ophæve bindingen af ​​ATN-658. Den uPAR af lavere orden pattedyr adskiller sig også ved denne position samt andre i overensstemmelse med den manglende binding af ATN-658 til uPAR eller celler, der udtrykker uPAR fra disse arter samt (tabel 3).

Bekræftelse af ATN-658 epitop af brint /deuterium Exchange massespektrometri (H /D-Ex)

Hydrogen-deuterium (

1 H-D) udveksling er et nyttigt redskab til at identificere protein binding sites eller grænseflader. Efter omstilling fra vand til en deuterium-baserede solvent-system (tungt vand) et protein vil opleve en stigning i masse som de protein brintatomer gradvist erstattet med deuteroner.