PLoS ONE: Interferon-β induceret microRNA-129-5p nedregulerer HPV-18 E6 og E7 Viral genekspression ved målretning SP1 i livmoderhalskræft Cells

Abstrakt

Infektion med human papillomavirus (HPV) kan medføre cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) og kræft. Nedregulering af E6 og E7-ekspression kan være ansvarlige for de positive kliniske resultater observeret med IFN behandling, men det molekylære grundlag er ikke blevet godt fastlagt. Som miRNA spiller en vigtig rolle i HPV-induceret cervikal carcinogenese, vi hypotesen, at IFN-β kan regulere udtrykkene for specifikke miRNA i cervicale cancerceller, og at disse miRNA kan mediere E6 og E7-ekspression, således modulere deres onkogent potentiale. I denne undersøgelse fandt vi, at MIR-129-5p at være en kandidat IFN-β inducerbar miRNA. MIR-129-5p niveauer gradvist aftage med udviklingen af ​​cervikal intraepithelial læsioner. Manipulation af MIR-129-5p ekspression i HeLa-celler modulerer HPV-18 E6 og E7 viral genekspression. Exogent MIR-129-5p inhiberer celleproliferation i Hela-celler, fremmer apoptose og blokerer cellecyklusprogression i HeLa-celler. SP1 er et direkte mål for miR-129-5p i Hela celler. Denne undersøgelse er den første rapport af et cellulært miRNA med anti-HPV aktivitet og giver ny indsigt i reguleringsmekanismer mellem HPV og IFN-systemet i værtsceller på miRNA niveau

Henvisning:. Zhang J, Li S , Yan Q, Chen X, Yang Y, Liu X, et al. (2013) Interferon-β induceret

microRNA-129-5p

nedregulerer HPV-18 E6 og E7 Viral genekspression ved målretning SP1 i Livmoderhalskræft kræftceller. PLoS ONE 8 (12): e81366. doi: 10,1371 /journal.pone.0081366

Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, USA

Modtaget: 11. juli, 2013; Accepteret: 11 Oktober 2013; Udgivet: 16. december 2013 |

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende undersøgelsen blev støttet af National Natural Science Funds i Kina (nr. 81.072.139 og 30.872.760) og 2011 Shanghai kommunale særligt fundament for sundhedspleje (No.201002013). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cervikal carcinom og cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) er forårsaget af vedvarende infektion med human papillomavirus højrisiko-(HPV) serotyper, mest almindeligt HPV16 og HPV18 [1]. Derfor behandling af HPV-infektion er nøglen til forebyggelse livmoderhalskræft og CIN. To oncoproteiner, E6 og E7, som kodes af HPV16 og HPV18, kan binde til og stimulere nedbrydningen af ​​tumorsuppressorer p53 og pRb [2] – [5]. IFN har været meget anvendt i behandlingen af ​​CIN og cervical cancer. Nedregulering af E6 og E7 udtryk kan være ansvarlige for de positive kliniske resultater observeret med IFN behandling, men det molekylære grundlag er ikke godt fastlagt.

MikroRNA’er (miRNA) er 19-25 nt regulatoriske RNA, der deltager i reguleringen af ​​forskellige biologiske funktioner samt i forsvar mod patogener i mange eukaryote slægter. De er generelt menes at virke ved at binde til ufuldkomment komplementære sekvenser i 3′-utranslaterede (UTR) region af target gener, hvilket resulterer i nedsat oversættelse eller nedbrydning af målet udskrift. Navnlig sekvensen komplementært i 6-8 basepar “seed region” ved 5 ‘enden af ​​miRNA-mRNA heteroduplex synes at bestemme specificiteten af ​​miRNA-targetRNA interaktioner. MiRNA kan have pleiotrope virkninger på celleproliferation, apoptose og celledifferentiering [6]. Ændringer i cellulære miRNA mønstre i livmoderhalskræft væv eller livmoderhalskræft celler er blevet rapporteret. Nedregulering af human miR-218 [7], [8] og miR-34a [9] i livmoderhalskræft celler blev rettet til HPV 16 E6 onkogen, mens hæmning af miR-21 i HPV 18-holdige Hela livmoderhalskræft celler forårsager en stærk suppression af celleproliferation [10]. Det synes derfor, at miRNA spiller en vigtig rolle i cervikal carcinogenese af HPV.

miRNA kan spille en rolle i IFN-β induceret E6 og E7 undertrykkelse. Det er blevet 1shown miRNA kan induceres ved IFN-β. I RSA-celler, kan IFN-β inducerer MIR-431-ekspression, hvilket kan nedregulere IGF1R og IRS2 ekspression og følgelig inhibere celleproliferation ved at undertrykke MAPK-vejen [11]. I hepatocytter, IFN-β medierer modulering af ekspressionen af ​​talrige cellulære miRNA med næsten perfekt komplementaritet i deres frø sekvenser med HCV-RNA-genomet, der er stand til at inhibere HCV-replikation og infektion [12]. Som miRNA spiller en vigtig rolle i HPV-induceret cervikal carcinogenese, vi hypotesen, at IFN-β kan regulere udtrykkene for specifikke miRNA i cervicale cancerceller, og at disse miRNA kan mediere E6 og E7-ekspression, således modulere deres onkogent potentiale. For at kontrollere dette, vi screenet for miRNA udtrykt og forskelligt reguleret i HPV-18 positive Hela celler efter udsættelse for IFN-β, og vi fandt, at miR-129-5p at være en kandidat IFN-p inducerbare miRNA som kan nedregulere E6 og E7 udtryk.

Materialer og metoder

cellelinjer og humane væv

HPV 18-positive Hela cellelinje [13], HPV 16-negative Siha cellelinje [13] HPV-negative C33A cervicale cancercellelinie [13] og veldifferentieret cervical pladecellecarcinom HCC94 cellelinje [14] blev anvendt i denne undersøgelse. Alle disse celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% FBS ved 37 ° C og 5% CO

2. Cellelinierne blev høstet efter IFN-β (3 x 10

5IU L

-1) behandling i 2 timer.

Normalt livmoderhalsen og livmoderhalskræft væv blev opnået fra kvinder i alderen fra 28 til 77 år. Fire normale cervikale prøver blev opnået fra patienter, som gennemgik hysterektomi til at behandle andre typer af sygdomme, såsom myom eller adenomyose. Ingen af ​​patienterne havde undergået hormonterapi, strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. Stadierne og histologiske kvaliteter af disse tumorer blev oprettet i henhold til kriterierne i den internationale sammenslutning af Gynækologi og obstetrik (FIGO). Hver vævsprøve blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion. Forudgående skriftlig og informeret samtykke blev opnået fra hver patient, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i det medicinske fakultet i Shanghai Jiao Tong University. Kliniske og patologiske data vedrørende de kliniske prøver er vist i tabel 1.

Microarray udtryk profilering og dataanalyse

Totalt RNA i celler eller væv blev isoleret ved hjælp af Tri-reagens (Molecular Research center, Cincinnati, OH) ifølge producentens instruktioner. Efter at have passeret målinger RNA kvalitet i en NanoDrop instrument blev prøverne mærket ved hjælp af miRCURY ™ Hy3 ™ /hY5 ™ Power mærkning kit og hybridiseret på miRCURY ™ LNA Array (v.11.0). Prøverne blev hybridiseret på en hybridisering station efter protokollen beskrevet af producenten. Scanning blev udført med Axon GenePix 4000B microarray scanner. GenePix pro V6.0 blev anvendt til at læse den rå intensitet af billedet. De tærskelværdier, der benyttes til at screene differentielt udtrykte miRNA var fold ændrer ≥1.5 eller ≤0.7, og

P

værdier ≤0.05 i t-tests blev betragtet som signifikante.

Crucial frø sekvens komplementaritet analyse

behandling Array data og afgørende frø sekvens komplementaritet analyse blev udført ved hjælp af web-sites (https://www.mirbase.org/, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db = PubMed og https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/).

Analyse af miRNA og mRNA af qPCR

Total RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler og væv under anvendelse Tri-reagens. For miRNA analyse blev modne miRNA omvendt transskriberet fra total RNA ved hjælp af specifikke miRNA RT primere i de TaqMan miRNA tests og reagenser i TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit. qPCR blev udført under anvendelse TaqMan MicroRNA Assay primere med TaqMan Universal PCR Master Mix og analyseret med et ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner.

U6B

blev detekteret som en intern kontrol for at normalisere alle data. De assay navne for

miR-129-5p

U6B

var HSA-mir-129-5p og RNU6B henholdsvis (Applied Biosystems). CDNA blev genereret ved hjælp af Prime Script RT Reagent Kit (Takara, Dalian, Kina). For kvantificering af HPV18

E6

, HPV 18

E7

ISG54

, real-time PCR blev udført på ABI Prism 7000 Sequence Detection System med SYBR Premix Ex Taq ( TaKaRa). Primersekvenserne er vist i tabel 2. For alle qPCR assays blev udtryk beregnet ved formlen 2

(- ΔΔCt), hvor ACt er forskellen mellem gen Ct og normalizer gen Ct. Ct repræsenterer tærskel cyklus, hvor fluorescens stiger statistisk signifikant over grundlinjen. Eksperimenter blev udført tre gange i tre uafhængige forsøg.

celletransfektioner

Celler blev vasket med PBS og skiftede til antibiotika-fri vækstmedium i 24-48 timer før transfektion. Celler blev transient transficeret med

pre-MIR-129-5p

, ikke-specifik miRNA kontrol (præ-MIR-negativ) eller blank kontrol (Applied Biosystems) i Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) under anvendelse af siPORT NeoFX Transfektion middel (Applied Biosystems) ved at følge fabrikantens protokol. Medium blev udskiftet 8 timer senere. Lige kopiantal af plasmider blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ved at følge fabrikantens protokol. Luciferase reporter vektor bærer target sites for

miR-129-5p

af

SP1

3′-UTR region blev købt af Shanghai choseasy co., Ltd detaljerede oplysninger om konstruktionerne anvendt i dette forsøg er vist i tabel 3.

Proliferationsassay

Celler (3000 per brønd) blev udpladet i plader med 96 brønde og dyrket i 72 timer efter transfektion (endelig miRNA koncentration 100 nM) i DMEM /F12 indeholdende 10% FBS. Celleproliferation blev dokumenteret hver 24 timer i 3 dage ved hjælp af kolorimetriske MTT-assayet (Sigma, St. Louis, MO), og absorbansen ved 490 nm blev evalueret af en Spectra Max 190 mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

celler, herunder transficerede celler, blev sultet i 24 timer ved at erstatte mediet med phenolrødt-frit og serum-frit DMEM /F12-medium (HyClone Laboratories, Logan, UT), og passende vehikelkontrol med phenolrødt-frit medium indeholdende 5% trækul-strippet FBS (HyClone Laboratories) i 48 timer. Celleproliferation blev dokumenteret hver 24 timer i 2 dage. Inden for en individuel eksperiment blev proliferation under hver betingelse testet tredobbelt, og den samlede forsøg blev gentaget mindst to gange.

Cellecyklusanalyse

Celler blev fikseret med 70% ethanol ved 72 timer efter transfektion og farvet med 25 pg /ml PI (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) i FACS-buffer (PBS indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA), 0,05% Triton X-100, og 50 ug /ml RNase A) . Efter 30 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys blev cellerne analyseret via flowcytometri under anvendelse af en Becton Dickinson FACScan, og fraktionerne af cellerne i G0 /G1, S og G2 /M-faser blev analyseret ved anvendelse Cell Quest Pro software (BD Biosciences, San Jose, CA). Eksperimenter blev udført tre gange i tre uafhængige forsøg.

Annexin V assay

Prøverne blev vasket med PBS og anvendelse af Annexin V-FITC og PI-farvning til bestemmelse af phosphatidylserin eksponering på den ydre plasmamembran . Efter inkubation i 30 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys blev prøverne kvantificeret ved flowcytometri under anvendelse af en Becton Dickinson FACScan. Eksperimenter blev udført tre gange i tre uafhængige forsøg.

Luciferase reporter assays

I luciferaseassays celler (15.000 per brønd) blev udpladet 24 timer før transfektion på hvid, klar-bottom 96-brønds plader. Cellerne blev co-transficeret med 100 ng

SP1

3′-UTR reporterplasmid med 50 nM pre-miR konstruere anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Luciferaseaktivitet blev analyseret 24 timer efter transfektion med Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) og blev målt med en Envision Plate-reader (Perkin Elmer Inc., Wellesley, MA). Prøver blev testet i triplikat i tre uafhængige forsøg.

Western blot-analyse

Efter de indikerede behandlinger, cellerne blev høstet og proteiner fremstillet ved anvendelse NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Extraction Reagent (Pierce, Rockford , IL) med proteasehæmmer cocktail (Roche Diagnostics). Alle ekstrakter blev lyseret ifølge fabrikantens protokol. Samlede proteinindhold blev bestemt ved Bradford-proteinet metoden under anvendelse af BCA proteinassaykit (Pierce). Proteiner (60 ug) blev påsat færdigstøbte 4% stabling, 10% Tris glycin geler og separeret ved gelelektroforese, efterfulgt af elektroforetisk blotting på en PVDF-membran. Efter vask med Tris-bufret saltvand blev membraner blokeret med 5% BSA /PBS i 1 time. Membraner blev inkuberet med polyklonale kanin-antistoffer rettet mod SP1 og p21 (1:1000 fortynding) (Abcam, UK). Membranerne blev derefter inkuberet med et gede-anti-kanin sekundært antistof (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og de blottede proteiner blev visualiseret ved anvendelse af forstærket kemisk-luminescens detektionssystem (Pierce), med præ-farvet markører (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) som molekylære størrelse standarder. De intensiteter af protein bands blev kvantificeret ved hjælp af billede J software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Statistisk analyse

Alle tests blev udført med det statistiske pakke til Social Sciences software udgave 17,0 (Chicago, IL, USA). Data er repræsenteret som betyder med standardafvigelse (SD). Statistisk signifikans blev bestemt med Student t-test, og

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske tests var to-sidet.

Resultater

miRNA udtryk profilering i Hela celler induceret af IFN-β

De differentielt udtrykte miRNA mellem ubehandlet og IFN-β induceret Hela celler blev analyseret ved anvendelse af mikroarrays. De udtryk for

miR-129-5p

,

miR-637

,

miR-744

miR-943

viste sig at være mest induceret i Hela-celler ved IFN-β og selekteres til yderligere analyse (tabel 4, og fig. S1). Frøene sekvens af

miR-129-5p

vises perfekt komplementaritet med HPV-18-genomet (fig. 1). Kvantitativ real-time PCR (qPCR) blev derefter udført for at validere microarray analyse, og resultaterne viste, at udtryk for

miRNA-744

,

miR-943

miR- 129-5p

var dybest set i overensstemmelse med den mikroarray; Tidsforløb analyse af udtryk afslørede, at induktion af

miR-129-5p

opstod hurtigt, topper inden 48 t. Svarende til induktion af

ISG54

, en velkarakteriseret IFN-β reguleret gen, opregulering af

MIR-129-5p

fulgte en klassisk dosisresponskurve mellem 3 og 3000 IU

-1 ml IFN-β (fig. 2).

(A) Validering af microarray data ved qPCR. Tredobbelte analyser blev udført for hver prøve. Induktioner af kendte IFN-regulerede gener

ISG54

ISG56

er vist for comparsion. (B) Tidsforløb for miRNA induktion ved IFN-β. Hela celler blev stimuleret med 300 IE ml

-1 IFN-β for de angivne tidspunkter, og

miR-129-5p

og

ISG54

/

ISG56

udtryk blev kvantificeret ved qPCR. (C) Dosis-respons analyse af miRNA induktion ved IFN-β. Hela-celler blev stimuleret med de angivne doser af IFN-β i 2 timer, og

MIR-129-5p

ISG54

/

ISG56

udtryk blev kvantificeret ved qPCR.

MIR-129-5p

niveauer gradvist falde med udviklingen af ​​cervikal intraepithelial læsioner og korrelerer med HPV-18 E6 og E7 udtryk

Ved qPCR-analyse i humane cervikal intraepithelial læsion prøver og normale cervikale væv,

miR-129-5p

ekspressionsniveauerne var meget lavere i kræft end i CIN i-II og normale cervikale prøver (fig. 3 A). de gennemsnitlige udtryk for

miR-129-5p

var 10,90 ± 4,01, 4,54 ± 3,12, 1,07 ± 0,65 og 0,57 ± 0,67, henholdsvis i de normale cervikale væv (kontrol), CIN I-II-gruppen, CIN III gruppe, og pladecellekræft grupper. Statistisk blev fundet signifikante forskelle i

miR-129-5p

udtryk, når man sammenligner de fire grupper (

P

0,05). De kliniske stadier og patologiske kvaliteter af CIN I-II-gruppen sammenlignet med de andre grupper blev bekræftet til at være signifikant forskellige (

P

0,05). HPV-18 E6 og E7 udtryk blev signifikant forøget fra den normale cervix gruppe, CIN I-II-gruppen, CIN III gruppe, og pladecellekræft (P 0,05, figur 3 B, C.). De gennemsnitlige udtryk for HPV-18 E6 var 1,67 ± 0,41, 3,55 ± 0,73, 4,70 ± 0,53 og 0,94 ± 0,33, henholdsvis i de normale cervikale væv (kontrol), CIN I-II-gruppen, CIN III gruppe, og pladecellekræft grupper, mens de gennemsnitlige udtryk for HPV-16 E7 var 1,90 ± 0,35, 3,67 ± 0,55, 6,87 ± 1,33 og 1,23 ± 0,24 i disse prøver. Negativ korrelation er fundet mellem ekspressionen af ​​miR-129-5p og HPV-18 E6 /E7 i cervikale vævsprøver (P . 0,05, figur 3 D, E).

(A) Udtrykket af miRNA-129-5p i humane cervikal intraepithelial læsion prøver og normale cervikale væv. (B) Ekspression af HPV-18 E6 i de samme prøver. (C) Udtrykket af HPV-18 E7 i disse prøver. (D, E) Sammenhæng mellem udtryk for HPV-18 E6 /E7 og miR-129 i disse prøver.

Manipulation af

miR-129-5p

udtryk i Hela celler modulerer HPV-18

E6

E7

viral genekspression

for at vurdere, om

miR-129-5p

har en funktionel rolle i down- regulering af HPV 18

E6

E7

, vi manipuleret ekspressionsniveauet af

miR-129-5p

i Hela celler. De tre grupper omfattede kontrol celler (ubehandlede), celler transficeret med ikke-specifik miRNA kontrol

(pre-miR-negative)

, celler transficeret med

pre-miR-129

. Ved 72 timer efter transient transfektion af præ-miRNA, mRNA udtryk for HPV-18

E6

E7

i Hela-celler blev detekteret ved qPCR. Transfektion af

pre-miR-129-5p

faldt betydeligt HPV-18

E6

E7

mRNA (fig. 4B, fig. 4C og fig. S2), og denne virkning var meget specifikke, som

pre-miR-negative

transfektion viste ingen effekt på HPV-18 E6 og E7 udtryk.

fig. (A) viste effektivitet miR-129 transfektion. Fold ændringer af udtrykkene for (B) HPV-18

E6

og (C) HPV-18

E7

i Hela-celler bestemt ved qPCR. Eksperimentet blev gentaget to gange, hver med tre gentagelser. Midler (barer) og SDC (fejl barer) er vist. *

P

. 0,001

Eksogene

miR-129-5p

hæmmer celledeling i Hela celler

Vi næste testede, om øget niveauer af

miR-129-5p

kunne mindske proliferative potentiale Hela celler som rapporteret i blæren kræftceller. En MTT-assay blev udført for at vurdere proliferation af Hela-celler i op til 72 timer efter transfektion med

MIR-129-5p

. Proliferationsassayet afslørede, at

miR-129-5p

overekspression hæmmede cellevækst (fig. 5), hvorimod celler transficeret med kontrol miRNA fortsatte med at vokse i denne periode.

Cell vækst var målt ved en MTT assay. Forsøget blev gentaget mindst to gange, hver med tre gentagelser, og dataene udtrykkes som absorbansgennemsnittet med SD. *

P

0,001; #

P

. 0,05

Eksogene

miR-129-5p

fremmer apoptose og blokerer cellecyklus progression i Hela celler

Som bestemt af Annexin V mærkning, ubehandlede celler og dem behandlet med

pre-miR-negative

kontroller forblev levedygtige og var primært Annexin V og propidiumiodid (PI) negativ. En højregående forskydning i fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) profil, der indikerer apoptose, blev observeret for Hela-celler transficeret med

pre-MIR-129-5p

(fig. 6).

annexin V-analyse viste, at Hela-celler transficeret med

pre-mIR-129-5p

vises en signifikant større apoptose niveau end kontrolgrupperne. *

P

0,01, #

P

. 0,05

Cell cyklus analyse ved flowcytometri viste, at andelen af ​​celler i G0 /G1 og S faser i de negative kontroller var uændret sammenlignet med ubehandlede celler. Transfektion af Hela-celler med

pre-MIR-129-5p

medførte en ophobning af celler i G0 /G1-fasen og et fald af celler i S-fasen i forhold til kontrolceller. Flowcytometrisk analyse foreslog, at

miR-129-5p

kunne arrestere Hela celler ved G1 /S checkpoint og forsinke cellecyklus komme ind i S-fasen. Derfor

miR-129-5p

overekspression bremset cellecyklusprogression og forårsagede en celle cyklus G1 fasen blok, selv om forskellen ikke var statistisk signifikant.

SP1

er et direkte mål for

miR-129-5p

i Hela celler

en dobbelt-luciferase reporter blev anvendt til at bestemme, om

miR-129-5p

kunne binde til

miR-129-5p

målsteder i

SP1

3′-UTR. Vi anvendte konstruktioner indeholdende den forudsagte frø sekvens for at teste den inhibitoriske virkning af

MIR-129-5p

. Transfektion af

pre-MIR-129-5p

i HeLa-celler i 48 timer faldt luciferaseaktivitet i forhold til den negative kontrol. Mens sås ingen ændring i aktivitet, når transficeret med kontrol (fig. 7B), Western blot analyse bekræftet, at eksogene

miR-129-5p

kan reducere protein niveauer af SP1 (fig. 7C).

(A) Vector restriktionskort. (B) SP1 blev angrebet af MIR-129-5p via sin 3’UTR i Hela-celler som vurderet ved anvendelse af et luciferase-assay. (C) Western blot-analyser af p21, SP1 og GAPDH i HeLa-celler efter MIR-129-5p overekspression. Midler (barer) og SD (fejlmargener) er vist * P. . 0,05

Diskussion

I denne rapport identificerede vi IFN-beta inducerede miRNA i HPV-18 positive Hela-celler. miRNA microarray analyse viste udtryk for

miR-129-5p

,

miR-637

,

miR-744

miR-943

blev forøget , mens

miR-526

* blev nedreguleret efter IFN-β stimulation.

miR-129-5p

blev plukket ud for yderligere undersøgelse, som bioinformatik analyse viste, at

miR-129-5p

og HPV-18 virale gensekvenser er fuldt komplementære. Det er blevet vist, at MIR-129-5p dereguleret i flere tumortyper herunder endometriecancer, esophageal cancer, coloncancer og blærecancer, og dens verificerede målgener inkluderet SOX4 [15] – [17], VCP /p97 [18] og Cdk6 [19]. Over-ekspression af MIR-129-5p kan hæmme cellevækst og inducerer celledød i blærekræft [17] og hepatocellulær cancer [18], men dens rolle i livmoderhalskræft er ikke klart.

Vi fandt, at mIR-129-5p overekspression kunne inhibere væksten af ​​Hela-celler til ca. 70,23% af kontrolceller. I mellemtiden er den transficerede præ-MIR-129-5p øget anholdelsen af ​​Hela-celler ved G0-G1-fasen (68.34%), mens S-fase celler faldt, hvilket indikerer, at celleproliferation blev inhiberet som DNA-syntese bremset. Disse resultater af effekten af ​​miR-129-5p på celledeling og cellecyklus sammen med sin evne til at øge apoptose var i overensstemmelse med observationer i blære cancerceller [17]. Vores undersøgelse viste også, at MIR-129-5p ekspression blev induceret af IFN-β i en dosis og tidsafhængig måde. Disse resultater indebærer, at anti-spredning og pro-apoptose effekt af IFN i livmoderhalskræft kan dels på grund af induktion af miR-129-5p udtryk.

Livmoderhalskræft skyldes HPV-infektion er primært knyttet til E6 og E7 virale onkogener. Ved qPCR analyse blev transfektion af præ-MIR-129-5p i Hela-celler fundet fald udtrykkene for E6 og E7 fra 69.01% og 77,15%, henholdsvis. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, at en IFN-β induceret microRNA kan nedregulere HPV-18 E6 og E7 viral genekspression. Vores yderligere undersøgelse fandt, at transskription faktor SP1 er en direkte downstream mål for miR-129-5p. SP1 er en sekvens-specifik DNA-bindende protein, som indeholder en MIR-129-5p bindingssted i 3′-UTR. De opstrøms regulatoriske regioner af HPV-18-gener indeholder SP1-bindingssted, og de har vist sig at bestemme E6 og E7-genekspression [20] – [22]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at SP1 ekspression kunne nedreguleres signifikant med overudtrykt MIR-129-5p. Desuden har vi bekræftet eksistensen af ​​et bindingssted for miR-129-5p på SP1 3′-UTR af luciferaseaktivitet assay. Tilsammen tyder vore resultater, at den inducerede ekspression af MIR-129-5p af IFN-β undertrykke udviklingen af ​​livmoderhalskræft ved nedregulering HPV-18 E6 og E7-ekspression, og SP1 er en direkte nedstrøms target af MIR-129- 5p. Et interessant resultat afsløret af vores undersøgelse er, at miR-129-5p udtryk var høj i CIN I tumorer, men det faldt gradvist i løbet af udviklingen af ​​kræft og stigningen af ​​patologisk klasse. HPV-infektion kan fremkalde ændringer i cellulær miRNA udtryk under udviklingen af ​​livmoderhalskræft. Nedregulering af human miR-218 og miR-34a i livmoderhalskræft celler blev rettet til HPV 16 E6 onkogen. En nylig undersøgelse viste, at 25 miRNA forskelligt var reguleret i to eller tre HPV-typer (HPV 11/16/45) [23]. Det er rimeligt, at miR-129-5p udtryk kan blive undertrykt af HPV-infektion, som infektionen på højrisiko-HPV øges gennem CIN I til livmoderhalskræft. Ikke desto mindre er yderligere undersøgelse er nødvendig for at bestemme den nøjagtige mekanisme af nedsat miR-129-5p udtryk under udviklingen af ​​livmoderhalskræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

zonekort for differentielt udtrykte miRNA mellem ubehandlede og IFN-beta inducerede Hela celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0081366.s001

(TIF)

Figur S2.

A Ekspressionen af ​​HPV-18 E6 i HeLa-celler; S2B Udtrykket af HPV-18 E7 i HeLa celler

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0081366.s002

(TIF)

anerkendelser

En særlig tak til Youji Feng og Feng Wang i Shanghai First Folkets Hospital Tilknyttet til Shanghai Jiao Tong University for at levere teknologiske vejledning langs løbet af denne undersøgelse.