PLoS ONE: En Off-Target Nucleostemin RNAi inhiberer vækst i Human glioblastoma-afledte Cancer Stamceller

Abstrakt

Glioblastomas (GBM) kan indeholde en variabel andel af aktive cancer stamceller (CSCS) er i stand til selv-fornyelse af sammenlægning ind CD133

+ neurosfærer, og til at udvikle intrakranielle tumorer, der phenocopy de originale. Vi antager, at nucleostemin kan bidrage til kræft stamcellebiologi da disse celler deler karakteristika med normale stamceller. Her rapporterer vi, at nucleostemin udtrykkes i GBM-CSCS isoleret fra patientprøver, og at dens udtryk, omvendt til, hvad det er blevet beskrevet for almindelige stamceller, ikke forsvinder, når cellerne er differentieret. Betydningen af ​​nucleostemin udtryk i CSCS blev behandlet ved at målrette de tilsvarende mRNA hjælp lentivirally transduceret kort hårnål RNA (shRNA). Dermed fandt vi en off-target nucleostemin RNAi (shRNA22), der ophæver proliferation og inducerer apoptose i GBM-CSCS. Desuden i overværelse af shRNA22, GBM-CSCS undladt at danne neurosfærer

in vitro

eller vokse på blød agar. Når disse celler xenotransplanted ind i hjernen på nøgne rotter, er tumor udvikling betydeligt forsinket. Der blev gjort forsøg på at identificere det primære mål /s af shRNA22, hvilket tyder på en transskription faktor involveret i en af ​​MAP-kinaser signalering-veje eller flere mål. Brugen af ​​denne shRNA kan bidrage til at udvikle nye terapeutiske tilgange til denne uhelbredelig form for hjernesvulst

Henvisning:. Gil-Ranedo J, Mendiburu-Eliçabe M, García-Villanueva M, Medina D, del Alamo M, Izquierdo M (2011) En Off-Target Nucleostemin RNAi inhiberer vækst i human glioblastoma-afledte Kræft stamceller. PLoS ONE 6 (12): e28753. doi: 10,1371 /journal.pone.0028753

Redaktør: Keith L. Sort, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: Juni 28, 2011; Accepteret: November 14, 2011; Udgivet: 12. december, 2011

Copyright: © 2011 Gil-Ranedo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra: Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 2009-07.259) Spanien, og Fundación Eugenio Rodriguez Pascual (Madrid). Centro de Biologia Molekylær S. O. er også modtageren af ​​en institutionel bevilling fra Ramón Areces Foundation. JG-R var modtageren af ​​en predoctoral fællesskab fra Gobierno Vasco, Spanien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glioblastoma multiforme er en af ​​de mest ondartede og almindelige af alle astrocytiske tumorer [1]. Væksten mønster af GBM er meget infiltrativ, hvilket gør en kirurgisk helbredelse meget vanskelig og resulterer i meget dårlige overlevelse resultater, som har forbedret marginalt i de sidste mange årtier [2]. Kræften stamceller hypotese antyder, at tumorer er organiseret i et hierarki med en delpopulation af CSCS ansvarlige for tumor progression, vedligeholdelse og tilbagefald [3]. Celler med stamceller-lignende egenskaber blev oprindeligt identificeret i akut myeloid leukæmi [4], og på nuværende tidspunkt deres eksistens er blevet bekræftet i brystkræft [5], medulloblastom og glioblastom [6], prostatakræft [7], melanom [8], ovariecancer [9], hoved og hals pladecarcinomer [10], tyktarmskræft [11], bugspytkirtel kræft [12] og lungekræft [13], blandt andre. I glioblastom, tilbagefald normalt følge behandlingen, sandsynligvis fordi CSCS er meget infiltrativ, selektivt resistent over for radiotherapies, kemoterapi [14], [15], [16], immunterapi [17], og fremme angiogene aktivitet. Desuden kemo- og radio- terapier kan prime hjerne tumor CSCS at forbedre deres stamme-celle-lignende egenskaber [18]. Denne population af CSCS er meget tumorigen og phenocopy den oprindelige tumor i gnaver xenograftmodeller [19], [20]. Tilgange til at tvinge CSCS at differentiere til celler med begrænsede eller ingen celledeling attributter, ved at udsætte dem for knoglemorfogenetiske proteiner for eksempel blev brugt til at gøre dem mere sårbare over for konventionelle behandlinger, og viste en betydelig effekt i musemodeller [21]. Forståelse af grundlæggende biologi cancer stamceller er et centralt element, før du flytter ind formodede behandlinger til at fjerne dem.

Nucleostemin er et GTP-bindende protein, såkaldte grund af dens nucleolar lokalisering og fortrinsret udtryk i stamceller [22 ]. Selvom proteinet er overvejende til stede i embryonale og voksne stamceller, er det også udtrykkes i flere transformerede cellelinjer og tumorer [23], [24]. Nucleostemin, på den anden side, er brat nedreguleres under differentiering før terminal celledeling. Dette protein blev først identificeret i voksne rotter neurale stamceller, og har været impliceret i cellecyklusfremadskriden [22]. Adskillige nucleostemin-bindende proteiner er blevet identificeret, herunder p53, MDM2 og telomere repeat bindende faktor 1 (TRF1) [22], [25], [26]. Ændringer i nucleostemin ekspressionsniveauer forårsage et fald i proliferationshastigheden af ​​celler, i begge p53-afhængige og uafhængige måder, [22], [26] – [28]. Proteinet er uundværlig for tidlig embryogenese [29], men er også vigtig i voksne neurale stamceller [30]. Nogle undersøgelser har vist, at udtømning af nucleostemin er forbundet med en begrænset tumorigen kapacitet i både HeLa og PC-3-celler [31], [24]. Ved siden af ​​sin konsekvenser i reguleringen af ​​celledeling, har flere andre roller blevet tildelt nucleostemin såsom regulering telomer længde ved at fremme nedbrydningen af ​​TRF1 [25], behandling af præ-rRNA’er [32] og vedligeholdelse af nucleolar arkitektur [33].

Vores hensigt var at udforske den rolle nucleostemin i human GBM-CSCS hjælp lentivirally transducerede korte hårnål RNA (shRNAs) til alvorligt reducere sin tilstedeværelse i cellerne. De CSCS forarmet af nucleostemin udtryk (shRNA18) resulterede ikke i den dybe reduktion af celledeling og øget apoptose, som vi havde forventet. I stedet en off-target lentivirus (shRNA22) afskaffet proliferation, selv-fornyelse og overlevelse CSCS. Også tilstedeværelsen af ​​denne shRNA betydeligt forsinket CSCS tumorigen kapacitet, når xenotransplanteret i nøgen rotte hjerner.

Resultater

Angivelse af nucleostemin i to menneske-glioblastom-afledte kræft stamcellelinjer

To kulturer beriget for cancer stamceller blev afledt fra humane hjerne tumor prøver (prøver CSCS-5 og CSCS-7). Begge cellelinier voksede eksponentielt og dannede neurosfærer selv når podet ved lav densitet, hvilket indikerer en stærk selvfornyelse kapacitet. De neurosfærer var positive til CD133 (figur 1A;. Grøn), nestin (figur 1A;. Rød), Sox2 (figur 1B. Grøn) vimentin (. Figur 1B rød), og nucleostemin (figur 1B. Lyserød) neural stamcellemarkører. Nucleostemin var til stede i kernen af ​​88% af CSCS-5 og CSCS-7-celler, som bestemt ved immunfluorescens-assays (fig. 1C). En stor procentdel af celler (76%) var også positive for CD133, og endnu højere procentdele blev opnået for nestin, vimentin og Sox2 (over 95%), sidstnævnte er involveret i selvfornyelse og proliferation af stamceller. CD15 var en markør for 54% af CSCS-5 og 69% for CSCS-7. Den multipotency af disse to kulturer blev demonstreret, da neurosfærer dyrket i differentieringsinducerende medium viste typiske morfologiske differentiering over for alle de tre neurale slægter – astrocytisk, neuronal og oligodendrocytic, som vurderet af positivitet for β-III-tubulin [34] og MAP2 ( neuronal) (fig. 1D rød, og S1 rød), GFAP (astrocytisk) (fig. 1D grøn), og NG2 (oligodendrocytic precursor) (fig. S1 grøn) antigener henholdsvis. Ikke desto mindre differentierede celler ikke løs ekspression af nucleostemin (fig. 1E), trods ikke udtrykker nogen af ​​de andre stemness beslægtede gener (data ikke vist). Den karyotypic analyser viste flere ændringer afspejler transformerende aktivitet, og clonogenicity analyser i blød agar angivet udviklingen af ​​mange kolonier.

A. CSCS-5 og CSCS-7 neurosfærer udtrykker CD133 (grøn) og nestin (rød). Scalebar: 50 um. B. CSCS-5 og CSCS-7-celler, der viser ekspressionen og cellulære lokalisering af Sox2 (grøn), vimentin (rød) og nucleostemin (lilla). Scalebar: 10 pm, og kvantitativ plot (C) på stamcelle markører CD133, nestin, vimentin, Sox2, nucleostemin og CD15 i CSCS-5 (grå) og CSCS-7 (grøn). D. Neuron (β-III-tubulin, lyserød-rød) og astrocytisk (GFAP, grøn) differentiering kapacitet af CSCS-5 og CSCS-7. Scalebar: 50 um. E. nucleolar nucleostemin udtryk i stamceller eller differentiatiated CSCS-5 (grå) og CSCS-7 (grøn) celler. F. Magnetisk resonans af

in vivo

tumorer udviklet fra CSCS-5 og CSCS-7 (gule pile peger på tumor), og Kaplan-Meier overlevelsesanalyse (G) af immunodeficent rotter, efter CSCS-5 (rød) eller CSC-7 (grøn) ortotopisk xenografter.

Vi udforskede derefter potentialet i begge CSCS-5 og CSCS-7 til at danne tumorer efter ortotopisk xenogratf i immunodeficent rotte hjerner. Efter injektion 5 x 10

5-celler inden for kranialt, begge cellelinier dannet store tumorer i 100% af tilfældene (n = 12 for CSCS-5 og 11 for CSCS-7), efterfulgt af magnetisk resonans (MRI) (fig. 1F). Tumorerne var meget infiltrativ (fig. S2). Eksplantater fra disse gliomer blev serielt transplanteret ind i hjernen på andre nøgne rotter og genererede dødbringende tumorer, der var lige beriget med CSCS, viser en høj kapacitet til selv-fornyelse. De gennemsnitlige overlevelsestider af værter var 60 ± 4 dage med CSCS-5 og 81 ± 11 dage CSCS-7-celler (fig. 1G). Histopatologiske analyser af xenotransplantater viste de generelle karakteristiske træk ved GBM, som pseudopalisade og fokal nekrose, høj cellularitet, høj ekspression af EGFR og høj proliferativ indeks (MIB-1). Patienter og xenotransplantater prøverne viser lignende ekspressionsniveauer for alle markører, herunder medium (patient /xenotransplantat 5) og lav (patient /xenotransplantat 7) ekspression for p53, og meget lav, om nogen, for p16 (fig. S3). Resultaterne viser, at de transplanterede tumorer i rotter var fænokopier af de oprindelige patient tumorer.

Karakterisering af shRNAs designet til at målrette menneskelig nucleostemin

nucleostemin genet har 15 exons, og som det gennemgår alternativ splejsning producerer tre forskellige mRNA-transkripter. Bortset fra exon 1, disse varianter har lignende sekvenser. Derfor, for at designe specifikke primere til knock-down alle tre varianter, har vi valgt primere i offentlige steder af exon 4, 10, 13 og 15 (fig. 2A). Vi målrettet nucleostemin af infektion med lentivirus udtrykke en shRNA mod nucleolar protein. Fem forskellige shRNAs med perfekt komplementære sekvenser i de humane nucleostemin mRNA blev indført til CSCS-5 og CSCS-7-celler. Tre af de fem shRNAs blev udvalgt til yderligere karakterisering: shRNA18, shRNA20 og shRNA22. RT-PCR og Western blot-analyse afslørede, at mens shRNA18 forårsagede en signifikant reduktion i nucleostemin mRNA (78%) og proteinniveauer (51%), nåede både shRNA20 og shRNA22 ikke ud til at påvirke niveauet af mRNA og protein, når normaliseret til den tilsvarende respektive GAPDH (mRNA) og actin (protein) kontrol (fig. 2B). Resultaterne tyder på off-target binding af både shRNA20 og shRNA22. Alternativt kunne relativt små reduktioner af nucleostemin messenger niveauer via target effekt har dominerende effekt på en analyse, hvis output er meget dosis-følsom over for niveauer af dette særlige protein. Vi har designet et assay baseret på kolonidannelse i blød agar, for at skelne mellem de to muligheder. Ekspressionen af ​​shRNA18 i CSCS-5 eller CSCS-7 hæmmer ikke kolonidannelse i blød agar, mens ekspression af shRNA22, og i mindre grad shRNA20, drastisk reduceret antallet af kolonier dyrket i denne type medium (fig. 2C og 2D). Hvis shRNA22 var forårsager en mindre reduktion i nucleostemin besked, og dette udløste en større hæmning af vækst, fordi vejen er involveret var meget følsom over for mindre reduktioner niveau af messenger eller protein, skal vi forvente en lignende effekt, når cellerne enten inficeret med shRNA18 alene, eller når cellerne er samtidig inficeret med både shRNA18 og shRNA22. Det vil sige, et stort antal kolonier vokser. Omvendt, hvis en sand off-target virkning opererede her, ville resultatet af denne kombination være det modsatte, som det egentlige mål vil være anderledes end nucleostemin, og vi bemærker så få kolonier vokser i blød agar som dem observeret, når shRNA22 blev anvendt alene. Infektionen af ​​celler med et lentivirus ikke bærer et shRNA blev anvendt som kontrol. Målingen af ​​antallet af CSCS-5 dannede kolonier i blød agar efter forskellige kombinerede behandlinger gav følgende resultater (figur 2E.): Et stort antal kolonier for kontrol shRNA (shRNACo) og for kombinationen shRNACo + shRNA18, som forventet og et lavt antal kolonier for både shRNACo + shRNA22, og shRNA18 + shRNA22. Udførelse dette eksperiment, var vi i stand til at skelne mellem mulighederne for alle shRNAs målrettet nucleostemin forskellige grader eller, at shRNA22 have et andet mål. Hvis virkningen skyldes det lave niveau af inhibering bør co-ekspression af shRNA18 og shRNA22 maskere virkningen af ​​sidstnævnte, idet shRNA18 ville forhindre stærkere ekspressionen af ​​nucleostemin genet. På den anden side, hvis effekten var off-target, vil vi sætte pris konsekvenserne af shRNA22 uafhængigt af ekspressionen af ​​shRNA18. Resultaterne viser klart, at shRNA22 inducerer sin virkning uafhængig af ekspressionen af ​​shRNA18, hvilket indikerer, at der på grund af en off-target effekt. Vi regerede derfor ud hypotesen om en meget mindre reduktion af nucleostemin ved shRNA22 have en dominerende negativ effekt i cellevækst. Vi mener, at væksthæmning effekt af shRNA22 i blød agar skyldes en

bona fide

forbi mål effekt.

A. Skematisk fremstilling af de 3 nucleostemin transcript varianter og exons. Pilespidser peger på hver designet shRNA. B. Nucleostemin mRNA (rød) og protein (blå) kvantificering i CSCS-5 behandles med shRNACo, shRNA18, shRNA20 og shRNA22. C. shRNAs virkning på CSCS-5 og CSCS-7 blød agar kolonidannende evne, og den kvantitative analyse (D). E. blød agar kimtal i dobbelt-infektioner til at bestemme nucleostemin-specificitet shRNA22. ** P ≤ 0,05; *** P≤0.001.

Udtømning af nucleostemin af shRNA18, ikke signifikant reducerer S fasen cellepopulationen som angivet af niveauet af BrdU optagelse efter en 15 min-puls (fig. 3A) eller den samlede population af celler Cycling fanget af en 20 timer BrdU behandling (fig. 3B). De to andre shRNAs: shRNA20 og shRNA22, der har en meget lav, om nogen, inhibering af ekspression, viste en konsekvent lavere procentdel af S-fase og cykling celler. Som påvist ved vækstkurve assays, det samlede antal celler inficeret med kontrol lentivirus mangler shRNA-udtrykkende indsats (shRNACo) steg adskillige gange i løbet af seks dage. De shRNA20 eller shRNA22 inficerede celler ikke stige i antal, eller endda falde betydeligt (fig. 3C og 3D), mens CSCS inficeret med shRNA18 opførte meget tættere på styre celler end til shRNA20 og shRNA22. Resultaterne tyder på en implikation af det primære mål for shRNA22, og i lidt mindre grad til shRNA20 ramt, for at fremme vækst og overlevelse af human GBM-CSCS. Vi er ikke sikre på shRNA20 og shRNA22 deler et primært mål, på trods af den fysiske nærhed af de oprindelige shRNA20 og shRNA22 sekvenser i nucleostemin genet. Selvom kun 66 nukleotider adskille disse to sekvenser, en human sekvens alignment søgning under hensyntagen til de 66 nukleotider mellem dem afslørede ikke nogen match udover nucleostemin.

A. Antal fase-S eller total-cykling (B) CSCS-5 (grå) og CSCS-7 (grøn) celler behandlet med de forskellige shRNAs. C. Antal af levedygtige celler på DIV 0, 3 og 6 i CSCS-5 og CSCS-7 (D) behandlet med de forskellige shRNAs. ** P ≤ 0,05; *** P≤0.001.

Off-mål shRNA20 og shRNA22, inducere apoptose fortrinsvis i CD133 + CSCS og svækker neurosfære-dannelse

Tilstedeværelsen af ​​disse shRNAs påvirker ikke kun celledeling men også cellulær overlevelse. Vi kvantificeret procentdelen af ​​apoptotiske celler i begge CSCS-5 og 7 befolkninger efter shRNACo, shRNA18, shRNA20 og shRNA22 lentiviral infektion. 7-AAD /annexin V-farvning afslørede en præferentiel apoptose i CD133

+ -celler i både CSC-5 og 7 populationer (figur 4A og 4B.); de relative værdi i forhold til kontrollerne for CSCS-5 og CSCS-7 er vist i tabel 1. Også andelen af ​​CD133

+ -celler reduceres i både CSCS-5 og CSCS-7 populationer efter shRNA20 og shRNA22 lentiviral infektion (fig. S4). Disse resultater tyder på, at det primære mål for shRNA22 og shRNA20 er en overlevelse faktor for GBM-CSCS fortrinsvis udtrykt i CD133

+ celler.

A. Apoptose induceret af shRNAs i CSCS-5 og CSCS-7 (B) CD133

+ (rød) eller CD133

– (blå) populationer. C. neurosfære formgivende evne CSCS-5 og CSCS-7 (d) celler, behandlet med de forskellige shRNAs. ** P ≤ 0,05; *** P≤0.001.

Deling visse centrale karakteristika ved normale stamceller, CSCS er i stand til selv-fornyelse, som giver vedvarende vedligeholdelse af denne delpopulation og udvidelse af den tilsvarende tumor. Neurosfære dannelse kapacitet efter behandling med forskellige shRNAs blev målt (Fig. 4C og 4D). Praktisk taget ingen sfærer blev dannet ved celler behandlet med shRNA22 og meget få af ShRNA20 behandlede celler i begge CSCS-5 og 7 populationer. Neurosfærer udviklet i 100% af kontrolgrupperne. Disse resultater, sammen med vores observationer, som CSCS undladt at formere og undergik apoptose, tyder på, at det primære mål for shRNA22 og shRNA20 er nødvendig for selv-fornyelse af glioblastom cancer stamceller.

Off-target shRNA22 reducerer den tumorigent potentiale CSCS-5

Vi undersøgte effekten af ​​at inficere CSCS-5 celler med kontrol lentivira eller lentivira udtrykker shRNA22. Efter puromycin selektion blev 5 × 10

5-celler injiceret i hjernen på nøgne rotter. Alle dyr, der bærer kontrolceller, der er celler inficeret med tomme lentivirus, (n = 3) udviklede store tumorer, efterfulgt af magnetisk resonans, og døde i 63 ± 1 dage ikke meget forskellig fra ikke-inficerede CSCS-5 (61 ± 4 dage n = 12). I modsætning hertil dyrene injiceret med celler, der udtrykker shRNA22 (n = 6), udviklet sig markant mindre tumorer, er den mediane volumen af ​​148 mm

3, mens middelværdien af ​​tumorer, der udtrykker shRNACo var 358 mm

3 (fig . 5A og 5B). Kaplan-Meier overlevelse plot indikerer en signifikant forskel mellem shRNACo og shRNA22 behandlede tumorceller, med en gennemsnitlig overlevelsestid for den sidste af 71 ± 2 dage (fig. 5C). Tilstedeværelsen og ekspressionen af ​​shRNA22 i CSCS synes at være vigtigt for dæmpe tumorudvikling.

A. Kvantificering af mængden af ​​inducerede tumorer med CSCS-5-celler behandlet med shRNACo (sort) og shRNA22 (rød). B. Magnetisk resonans billeddannelse af repræsentative eksempler på tumorer efter ortotopisk xenografter i nøgen rotte-hjerner CSCS-5 celler der bærer shRNACo eller shRNA22, og Kaplan-Meier overlevelse plot (C) af immunodeficent rotter podet med CSCS-5 (mock, grå ), celler, der bærer shRNACo (sort) og shRNA22 (rød). *** P≤0.001.

Effekten af ​​shRNA22 synes ikke at være eksklusiv for CSCS

Vi har forsøgt at bestemme virkningen af ​​shRNA22 i gliom celler uden CD133

+ stamceller egenskaber såsom U87MG og U373MG humane gliomcellelinier. Vi vurderede deres klonogene potentiale ved blød agar assay efter shRNACo og shRNA22 lentiviral infektion. En signifikant reduktion i det gennemsnitlige antal kolonier blev observeret, når shRNA22 blev udtrykt i U373MG (ned til 1%), og i mindre omfang, når i U87MG glioma cellelinie (ned til 41%) (fig. 6A). Vi målte også cellulære overlevelse ved at estimere procentdelen af ​​apoptotiske celler i både U373MG og U87MG cellelinjer efter shRNACo, og shRNA22 lentiviral infektion. 7-AAD /annexin V-farvning afslørede fortrinsret apoptose i U373 celler i en lignende adfærd til CSCS. På den anden side, U87MG celler optrådte temmelig resistent over for apoptose (fig. 6B). Resultaterne antyder, at selv om shRNA22 kan svække tumorvækst i gliomceller i almindelighed, kan dens virkninger afhænge af den celletype. Konstateringen af, at shRNA22 effekten ikke er begrænset til CSCS er vigtigt, når designe strategier til at fjerne alle kræft celletyper, der opbygger en yderst heterogen tumor, såsom glioblastom.

A. shRNAs virkning på U373MG (sort) og U87MG (grå) blød agar kolonidannende evne. B. shRNAs-induceret apoptose i U373MG (sort) og U87MG (grå). ** P ≤ 0,05; *** P≤0.001.

Forsøg på at identificere det primære mål for shRNA22

Vi foretaget en genomisk søgning efter sekvenser, bortset nucleostemin, med forskellige grader af homologi med shRNA22 nukleotider. Til dette brugte vi den grundlæggende lokale tilpasning søgeværktøj (BLAST), og vi vælger fire kandidater: PCLO, involveret i neurotransmisor frigivelse; HSPA13, medlem af chaperon familien HSP70; SEC22C, involveret i vesikulær trafik; og CNOT1 relateret til transskription og mRNA nedbrydning. Af de 21 nukleotider, 14 var et perfekt match i alle tilfælde undtagen CNOT, med en 13 nukleotider kamp. Men ikke en af ​​de fire kandidater var det primære mål for shRNA22 som målt ved QRT-PCR (data ikke vist), som blev observeret nogen forskel i koncentrationen af ​​deres mRNA s i tilstedeværelse eller fravær af shRNA22 relateret til shRNACo.

for at bestemme hele genomet differentielt udtrykte gener i CSCS-5 efter shRNA22 infektion, anvendte vi Affymetrix GeneChip Gene 1.0 ST Array System indeholdende ca. 28,869 humane gener, herunder det 3′-utranslaterede region (UTR) af de mRNA’er, der kunne være en målet for bindende i en mikro (mi) RNA-lignende måde. Som følge heraf vi identificeret 182 gener nedreguleret i CSCS-5 behandlet med shRNA22 i forhold til shRNACo (tabel S1). Som forventet nucleostemin var ikke blandt de ned-regulerede gener. Forsøg på at samle de gener med shRNA22 rammer efter funktion (baseret på Gene ontologi og signalvejen data) afslørede tilstedeværelsen af ​​26 gener involveret i regulering af transkription blandt de tavse gener og 56 DNA-bindende proteiner (fig. 7A). Signaltransduktionsvejen med flere gener nedreguleret var MAPK-kinaser pathway (fig. 7B). Selvom de hidtidige resultater er ikke afgørende, kan foreslås en indikation af, at shRNA22 kan være involveret i tavshed en transskription faktor impliceret i en af ​​MAP-kinaser signalering-veje. Alternativt flere mål effekter er også en stærk mulighed for shRNA22, på en lignende måde til mikro RNA.

A. Signifikante ned- (grøn), up- (rød) og alle regulerede (blå) gener grupperet efter funktion af biologiske processer, eller ved tilhører signalveje (B) fremkaldt af shRNA22 i CSCS-5 celler.

diskussion

de ligheder og forskelle mellem SC’er og CSCS har været kilde til megen påstand [35], [36], [37]. Brain CSCS ligne neurale SCs i form af fænotype, signalering og opførsel in vitro [38], men det er i øjeblikket uklart, om CSCS er i virkeligheden,

bona fide

stamceller. Eksperimentelle karakterisering af kræft stamcellepopulationer kan hjælpe i disse sager. Hos rotter er nucleostemin højt udtrykt i nucleoli af centralnervesystemet SC’er, men ikke i deres differentierede afkom, som genet synes at være brat standset under differentiering før terminale stadier [22]. Vores observationer af nucleostemin udtrykkes selv efter CSCS blev tvunget til at differentiere i kultur, indebærer en ny signatur for CSCS og en betydelig forskel med SCs, der ikke tidligere er rapporteret.

Vi brugte en RNAi tilgang til specifikt at fremme nedbrydning af nucleostemin mRNA. Forrige data har vist, at banke ned nucleostemin udtryk forårsagede en alvorlig nedgang i celledeling i blære cancerceller [39] og reduceret kuglen-dannende evne i humane brystcancer stamceller [40]. En betydelig reduktion i cellecyklusfremadskriden i forskellige typer af humane hjernetumorer og i humane glioblastom afledt cellelinier blev også rapporteret [41]. Vi fandt imidlertid, at den eneste shRNAi der effektivt reducerer protein, undertrykker ikke cellecyklusprogression, ikke falde væksten af ​​CSCS kulturer, og ikke formindske antallet af dannede kolonier i blød agar, sammenlignet med kontroller inficeret med en tom lentivirus. Uoverensstemmelserne kan skyldes forskelle i banker-down niveauer af nucleostemin opnået i tidligere rapporter (over 75% og nogle gange mere end 90%) og os (51%).

RNAi-teknologi har været meget anvendt i pattedyrceller at undertrykke ekspressionsniveauet af individuelle gener og således bidrage til at definere funktionelle roller af gener, især i sygdomme. Meget arbejde har været centreret omkring shRNA design algoritmer, med fokus på gen-target specificitet og effektivitet [42], [43]. Ikke desto mindre ikke-tilsigtede virkninger er udbredt, og individuelle shRNAs er blevet vist at nedregulere en eller flere andre “uønskede” gener [44], [45], undertiden ved binding i en mikro (mi) RNA-lignende måde til 3 ‘UTR’er af mRNA’er [46]. Vi fandt end shRNA22 binder til andre /s end den tilsigtede målgen. Off-target effekter rapporteret i tidligere RNAi undersøgelser blev formidlet ved delvis komplementaritet mellem shRNAs og de 3 ‘UTR’er af off-målgener, der involverer en heptamer eller hexamer »frø« match af shRNA strander ved 5’-enden på positionerne 2 til 8 eller 2 til 7, henholdsvis [46], [47]. Mekanismen svarer til den af ​​miRNA. Selv BLAST biblioteket anvendte omfattede 3’UTRs af budbringere blev en 7-nukleotid match parameter ikke inkluderet i skærmen analysen, da det ville udgøre en alvorlig lempelse af betingelserne og en stor stigning i formodede kampe. En fælles primære mål for shRNA20 og shRNA22 formodes, da sekvenserne er i nucleostemin exon 10. kun 66 nukleotider fra hinanden Det er muligt, at en nucleostemin sekvens herunder shRNA22, regionen mellem de to shRNAs og shRNA20 (måske delvist), ville også være til stede i en anden genomisk region, der koder for et andet protein, hvis mRNA sekundær struktur ville være mere tilgængelige for shRNA22 og shRNA20 end den ene på nucleostemin mRNA. Ikke desto mindre blev ingen nye kampe ved siden nucleostemin fundet i en menneskelige genom-dækkende søgen efter supplerende regioner til de to-shRNA sekvenser og nukleotider mellem dem, udført ved hjælp af den grundlæggende lokale tilpasning søgeværktøj (BLAST).

genekspression profilering af CSCS-5 i nærvær eller fravær af shRNA22 ikke entydigt peger dens primære mål. Snarere flere mål effekter er en rimelig mulighed for dette shRNA. Det største antal gener tavshed var relateret til reguleringen af ​​transskription når hits blev grupperet efter funktion, og overrepræsentation af gener involveret i MAPK signalvejen blev nedreguleret af shRNA22 udtryk. Over-ekspression af et eller flere gener af MAPK signalvej er almindelig i glioblastomer, og flere små molekyler, der inhiberer PI3 kinase-Akt signalvej er i klinisk udvikling. Selv om mange af disse molekyler har været effektive i prækliniske modeller er det uklart, om denne strategi alene vil være tilstrækkelig til at afbryde de molekylære begivenheder påbegyndes og fortsættes af signalering langs veje på grund af aktivering af andre veje, der kompenserer for inhibering af det målrettede kinase. Forsøg er for nylig blevet gjort på at identificere gener eller veje, hvis inaktivering, i kombination med de PI3K-inhibitorer PX-866 og NVPBEZ-235, kan resultere i en dødelig fænotype i glioblastoma multiforme-celler [48]. Den identificerede shRNA22, når de udtrykkes i CSCS fra glioblastom patienter, hæmmer celledeling og selvfornyelse, inducerer apoptose og reducerer deres tumorigent potentiale betydeligt, når xenotransplanted ind i hjernen på nøgne rotter. Det forhold, at det primære mål for shRNA22 ikke er begrænset til CSCS er vigtigt, for når de forsøger at eliminere en tumor skal der også målrette tumor stroma celler og mikroglia fordi disse celler bidrager til tumor vedligeholdelse og progression. Brugen af ​​denne shRNA alene eller i kombination med andre lægemidler kan udgøre en potentiel klinisk terapeutisk strategi.

Materialer og metoder

Statement for dyr pleje

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med lovgivningen og retningslinjer for pleje af dyr og håndtering i Spanien (spansk kongeligt dekret 1201/2005 BOE offentliggjort 21 oktober 2005), og dem fra EU (2003/65 /EF fra Europa-Parlamentets og Rådets juli 2003) . Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i den selvstyrende universitet i Madrid (tilladelse forbundet til projekt SAF 2009-07.259 udstedt i Madrid 11

th marts 2009) og af CBMSO institutionelle biosikkerhed udvalget. Alle operation blev udført under isofluorangasanæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Statement for patient Samtykke

Vi opnåede to nye cancer stamceller linjer (CSCS-5 og CSCS-7 ) fra primær glioblastom kirurgiske prøver fra patienter, der gennemgår resektion for nyligt diagnosticeret gliom i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Etik Komité Ramón y Cajal Hospital. Skriftligt informeret samtykke til at udnytte overskydende væv til forskning blev opnået fra hver patient, og de-identificerede væv, for at beskytte anonymitet, blev anvendt (tilladelse forbundet til projekt SAF 2009-07.259, udstedt i Madrid den 26

th februar 2009 Spanien .)

Statement for microarray data

Alle data præsenteres her er MIAME kompatibel og de rå data er blevet deponeret i kompatibel database GEO (Adgang nummer: GSE30448)

. Cell isolation og kultur

de nye kulturer, CSCS-5 og CSCS-7, blev etableret fra friske kirurgiske prøver indsamlet direkte fra operationsstuen i PBS plus 0,6% glucose og straks transporteret på is til cellen kultur værelse og behandles som følger: tumor stykker blev vasket og hakket fint med en lille saks, de blev derefter inkuberet i 0,1% trypsin og 0,04% DNase (type II, Sigma) i PBS i 1 time ved 37 ° C . Nedbrudt væv blev vasket to gange og mekanisk dissocieret ved at passere gennem brand-poleret Pasteur pippetes.