PLoS ONE: Evaluering af ALK omlejring i kinesisk ikke-småcellet lungekræft Brug FISK, Immunhistokemi, og Real-Time kvantitativ RT-PCR på paraffinindlejrede Tissues

Abstrakt

Patienter med ALK gen omlejringer ofte manifest dramatiske reaktioner på crizotinib, en ALK-inhibitor. Præcis identifikation af patienter med ALK-positive ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er afgørende for den kliniske anvendelse af ALK-målrettet terapi. Men vurderer

EML4-ALK

omlejring i NSCLC forbliver udfordrende i rutinemæssig patologi praksis. Formålet med denne undersøgelse var at sammenligne den diagnostiske nøjagtighed FISH, immunhistokemi (IHC), og real-time kvantitativ RT-PCR (qPCR) metoder til påvisning af

EML4-ALK

omlejring i NSCLC og at vurdere immunhistokemi som en pre-screening værktøj. I denne undersøgelse blev i alt 473 paraffinindlejrede NSCLC prøver fra kirurgiske resektioner og biopsier analyseres ved IHC med ALK-antistof.

ALK

omlægning blev yderligere bekræftet af FISH og QPCR. ALK-protein-ekspression blev detekteret i tyve patienter (20/473, 4,2%). Af de 20 ALK-positive tilfælde ved IHC, blev 15 sager yderligere bekræftet som

ALK

omlægning af FISH, og 5 tilfælde var ikke fortolkelige. Også, vi evaluerede 13 ud af de 20 IHC-positive væv ved QPCR i yderligere til FISH, og fandt, at 9 tilfælde var positive og 2 tilfælde var tvetydig, mens 2 tilfælde var negative selv om de var positive med både IHC og FISH. ALK-status var samstemmende i 5 ud af 8 sager, der var tolkes af tre metoder. Derudover ingen af ​​de 110 IHC-negative tilfælde med adenocarcinom histologi viste

ALK

rearrangements ved FISH. Histologisk næsten alle de

ALK

-rearranged sager var adenocarcinom, bortset fra at den ene sag var sarcomatoid karcinom. En solid signet-ring celle mønster eller mucinøs cribriform mønster blev præsenteret mindst fokalt i alle ALK-positive tumorer. Afslutningsvis vores resultater foreslog, at

ALK

omlægning var forbundet med ALK proteinekspression. Den konventionelle IHC-analysen er et værdifuldt værktøj til pre-screening af patienter med

ALK

omlægning i klinisk praksis og en kombination af FISH og QPCR er nødvendig for yderligere bekræftelse

Henvisning:. Zhang YG , Jin ML, Li L, Zhao HY, Zeng X, Jiang L, et al. (2013) Evaluering af

ALK

omlejring i kinesisk ikke-småcellet lungekræft Brug FISK, Immunhistokemi, og Real-Time kvantitativ RT-PCR på paraffinindlejrede Væv. PLoS ONE 8 (5): e64821. doi: 10,1371 /journal.pone.0064821

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Modtaget: November 23, 2012; Accepteret: April 18, 2013; Udgivet: 31. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NO.81050015). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft stadig den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1], [2], på trods af forbedringer i detektionsmetoder og behandlinger. Blandt ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), der tegner sig for ca. 85% af alle lungekræfttilfælde, adenocarcinom er den mest almindelige form for lungekræft hos både mænd og kvinder [2]. I øjeblikket er indsatsen afsat til udvikling af molekyler mod specifikke mål for specifikke tumortyper. Med fortsat forbedring af vores forståelse af det molekylære grundlag for lungekræft, er en række målrettede behandlinger for NSCLC blive evalueret eller udvikles. Disse terapier omfatter angiogeneseinhibitorer og signalering transduktion inhibitorer, såsom epitel vækstfaktorreceptor (EGFR) -targeted terapier [3]. Derfor er identifikation af de vigtigste onkogener for lungekræft er et meget vigtigt skridt mod udviklingen af ​​hidtil ukendte molekylære-målrettede midler.

For nylig aktivering af anaplastisk lymfom kinase (ALK) gen i lungekræft ved fusion til pighuder mikrotubuli-associeret protein-like4 (EML4) eller andre gen partnere (såsom

TFG

og

KIF5B

) er blevet rapporteret [4], [5], [6]. ALK-genet blev oprindeligt karakteriseret som en fusionspartner af NPM-ALK onkogen i anaplastisk storcellet lymfom [7], og er nu anerkendt som den aktive komponent i flere fusionsproteiner i en række forskellige cancere [8]. ALK er en transmembran receptor med tyrosinkinase-aktiviteter tilhører insulin vækstfaktorreceptor overfamilien, som er kodet på kromosom 2 (2p23). De forskellige fusionspartnere i ALK medierer ligand-uafhængig dimerisering af ALK, hvilket resulterer i konstitutiv kinaseaktivitet, og dermed transmitterer anti-apoptotiske og celleproliferation signaler via KRAS og PI3K pathways [8]. I NSCLC, afvigende aktivering af ALK bidrager til lunge carcinogenese efter at være blevet fusioneret med en række andre gen-partnere, hyppigst pighuder mikrotubulus-associeret protein 4 (

EML4

). EML4 gen er placeret på kromosom 2 (2p21) og omvendt orienteret med

ALK

.

EML4-ALK

fusion kan opstå efter en spaltning af kromosomet ved en variabel websted og kromosom inversion, hvilket giver anledning til forskellige fusionspartnere isoformer [9].

EML4-ALK

fusion forekommer i en gensidigt eksklusiv mode med

EGFR

eller

KRAS

mutationer og næsten udelukkende i adenocarcinom. Tilstedeværelsen af ​​

EML4-ALK

er mere sandsynligt hos patienter med visse demografiske karakteristika, såsom aldrig ryge status eller yngre alder [10]. De fleste undersøgelser har opdaget denne genetiske abnormitet med en hastighed på 2-5% i den almindelige befolkning af patienter med NSCLC [11], [12], [13], [14].

I tidligere kliniske forsøg, Crizotinib, en dual ALK /MET kinase inhibitor, viste sig at være dramatisk effektivt hos patienter med NSCLC, der huser ALK gen omlejringer [15]. Crizotinib blev for nylig godkendt af det amerikanske FDA til behandling af fremskreden

ALK

-positiv NSCLC identificeret ved fluorescens in situ hybridisering (FISH) [16]. For at sikre identifikation af patienter med størst sandsynlighed vil drage fordel af Crizotinib, er det vigtigt at udvikle robuste og nemme diagnostiske metoder til påvisning ALK genomlejring ved screening af patienter til behandling med crizotinib. Selv ALK FISH er blevet den gyldne standard til påvisning

ALK

omlægning i NSCLC, kan det være teknisk udfordrende og dyrt. Derfor vil andre diagnostiske modaliteter mangler at blive undersøgt, herunder immunhistokemi (IHC) og revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR). RT-PCR er et meget følsomt teknik til påvisning og kvantificering af RNA til

EML4-ALK

. Det er også i stand til at skrive

EML4-ALK

variant ved sekventering af PCR-produktet. Men fordi denne metode ikke kan identificere nye rearrangementer involverer tidligere karakteriseret

EML4-ALK

, varianter eller ukendte fusionspartnere og dens proces kan let forurenet, dens følsomhed og specificitet mangler at blive valideret. IHC har den fordel, der bredt tilgængelige, relativt let at udføre og bevarer morfologiske information, der gør tillid vurdering af afvigende gener i tumorceller. Derfor ALK IHC synes egnet til en storstilet screening af patienter med

ALK

-positiv NSCLC.

Den største udfordring at bruge ALK IHC er det ofte lavt niveau udtryk for ALK fusionsproteiner i

ALK

-rearranged NSCLC [16], hvilket gør det nødvendigt at udvikle mere følsomme IHC-baserede metoder. Adskillige ALK-antistoffer er blevet rapporteret i de seneste undersøgelser, der viser, at IHC har høj konkordans med ALK FISH, herunder ALK1 monoklonalt antistof fra DAKO [17], 5A4 monoklonalt antistof fra Novocastra [18], og D5F3 monoklonalt antistof udviklet af Cell Signaling Technology [19] . Ikke desto mindre er store undersøgelser kræves for yderligere at validere overensstemmelse mellem IHC og FISH, samt udvikling og evaluering af nye antistoffer med høj specificitet og sensitivitet for ALK fusionsproteiner ville være meget velkommen.

I denne undersøgelse, vi undersøgte ALK genomlejring hjælp immunhistokemi i NSCLC kliniske prøver, og korreleret resultaterne med dem, der opnås ved hjælp af FISH og QPCR. Derudover undersøgte vi clinicopathologic karakteristika NSCLC med ALK gen omlejringer. Den foreliggende undersøgelse havde til formål at identificere nyttige oplysninger forudsige ALK genomlejring og bestemme en diagnostisk procedure, der kunne udføres i rutinemæssig praksis.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Denne undersøgelse blev udført med godkendelse af kliniske etiske komité i Beijing Chao-Yang Sygehus, Capital Medical University. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke. Archival formalin-fikseret paraffinindlejrede væv blev opnået fra 473 patienter, der havde undergået behandling af primær lungekræft mellem 2006 og 2011 på Beijing Chao-Yang Hospital i Capital Medical University i Kina. Tilfælde blev udvalgt tilfældigt blandt patienter diagnosticeret som NSCLC ved histologisk undersøgelse af prøvemateriale opnået ved kirurgisk resektion og biopsi. Ingen patienter havde fået kemoterapi før kirurgi og biopsi. For alle tilfælde, vi revideret alder ved diagnose, køn, rygning historie, og placeringen af ​​primær tumor, der blev opnået fra medicinske journaler. Ifølge the7th udgave TNM mellemstationer manual for lungekræft udgivet af AJCC i 2010 blev alle tilfælde revideret og iscenesat. Alle tilgængelige histologiske slides fra hvert tilfælde blev revurderet, og den histologiske type og kvalitet af differentiering blev bekræftet i henhold til kriterierne i World Health Organization Klassificering af lunge tumorer og ERS /ATS /IASLC tværfaglig klassificering af lunge adenocarcinom [20]. For hvert tilfælde blev den repræsentative vævsblokken indeholder mest levedygtige tumorceller udvalgt af to patologer. Den fase af sygdommen var postoperativ patologisk stadium. Trin IV sygdomme omfattede sager, der modtog biopsier af åben lunge eller video-assisteret torakoskopiske operation for diagnose. De klinisk-patologiske data er sammenfattet i tabel 1.

ALK Detection med Immunhistokemi

For hvert tilfælde et repræsentativt formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) væv blok blev valgt og sektioneret på 4-um tykkelse for immunfarvning. Kort fortalt, efter afparaffinering og rehydrering blev objektglassene opvarmes for antigen hentning i trykkoger i 3 minutter ved 100 ° C i 0,01 mol /L Tris-EDTA-buffer (pH 9,0). Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved at inkubere objektglassene i 3% hydrogenperoxid i absolut methanol i 15 minutter, og ikke-specifik binding blev blokeret med 10% gedeserum i 15 minutter. En kanin monoklonalt antistof mod ALK (klon SP8; Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, USA) blev anvendt som det primære antistof ved en fortynding på 1:100. Efter inkubation natten over med ALK antistof ved 4 ° C blev objektglassene inkuberet med et anti-kanin peberrodsperoxidase-mærket polymer sekundært antistof fra DAKO Envision + ™ System (Dako Corporation). Immunreaktivitet blev visualiseret med 3,3′-diaminobenzidin (Dako Corporation, Carpinteria, CA). Endelig blev snittene modfarvet med hematoxylin og monteret. Positive sektioner kontrol fra kendte ALK-positive ALCL sager blev inkluderet i hver farvning batch. Normal lymfeknude væv blev anvendt som en negativ kontrol. For blank kontrol, alle inkubationstrinnene var identiske bortset fra, at kanin immunt IgG serum blev anvendt i stedet for det primære antistof (ALK).

Vi bestemt kriterierne scoring under en foreløbig evaluering ved hjælp af en multi-headed mikroskop for at nå til enighed. Farvning resultater blev derefter fortolkes af to af forfatterne uafhængigt, uden forudgående kendskab til klinisk-patologiske parametre. Uharmoniske sager blev gennemgået og aftalt før data blev statistisk analyseret. For hver prøve blev analyseret mindst fem felter (× 400) og mere end 500 celler. For ALK pletter blev kun utvetydig cytoplasmatisk farvning betragtes som en positiv reaktion. Antallet af immunpositive celler blev semikvantitativt anslået: ingen positive celler (-); 50% af tumorcellerne farves positive (+); 50% -75% af tumorcellerne farves positive (++); . 75% af tumorcellerne farvning positive (+++) Den farvningsintensitet blev gradueret på en skala fra 0 til 3+ (0, negativ, 1+, svag, 2+, moderat, 3+, intens), på lignende måde til de tidligere beskrevne protokoller [17], [18].

Fluorescens in situ-hybridisering (FISH)

FISH blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) tumorvæv ved hjælp af Vysis LSI ALK Dual Color, Break Apart omlejring Probe (Abbott Molecular, Abbott Park, Illinois, USA). ALK break-apart sonde sæt indeholder to DNA-prober mærket med Spectrum Orange og Spectrum Green, der henholdsvis hybridiserer til bandet 2p23 på modsatte sider flankerer breakpoint for ALK-genet. Assay blev udført ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev 4-um-tykke snit fra FFPE vævsblokke afparaffineret og dehydreret, så blev sektionerne behandlet med Vysis forbehandling reagens (Abbott Molecular) og omsat med proteaseopløsning (Abbott Molecular). probeblanding ALK break-apart blev anvendt på hele væv, og de blev co-denatureret ved 73 ° C i 3 minutter. Objektglassene blev derefter hybridiseret natten over i et fugtigt kammer ved 37 ° C. Efter vask blev kerner modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Sektioner blev analyseret under et fluorescensmikroskop udstyret med en tredobbelt-pass filter (DAPI /Grøn /Orange). En gentagen analyse af nogle prøver blev udført på grund af dårlige hybridiseringssignaler og /eller dårlig væv morfologi. Positive og negative kontrolobjektglas blev inkluderet i hver kørsel af FISH-test.

FISH Fortolkning

Ifølge producentens specifikationer blev FISK slides evalueret uden kendskab til IHC resultater for ALK. De to teknikere analyseret hver FISH dias, scanne hele vævssnit og lave 50 repræsentative kerner, som klart blev identificeret og indeholdt utvetydige signaler. Kerner, der indeholder signaler af kun én farve, bør ikke optalt. Resultaterne af hver tekniker blev ikke kombineret indtil undersøgelsen er afsluttet for at minimere skævhed i scoring. Cellen blev betragtet som positiv, når en kerne havde mindst ét ​​sæt af knækkede hinanden signaler, eller havde en enkelt rødt signal (udgår grønt signal) ud over kondenserede og /eller brudt fra hinanden signaler. Afstanden mellem to adskilte røde og grønne signaler blev estimeret ved anvendelse af de to tidspunkter af største signal størrelse. Prøverne blev betragtet som positive, hvis mere end 25 af 50 tumorceller var positive, og negativ, hvis mindre end 5 tumorceller var positive. Prøven med 5-25-positive tumorceller blev anset tvetydig, og derefter blev evalueret af en anden tekniker. Det første og andet celletal aflæsninger blev tilsat sammen og en procent blev beregnet af 100 celler. Hvis den gennemsnitlige procent af de positive celler var 15% eller mere, blev prøven som positiv. Ellers blev det anset negativ for

ALK

omordning.

Real-time kvantitativ RT-PCR (QPCR)

Total RNA blev ekstraheret fra frisk skåret FFPE vævssnit ved hjælp af RNeasy kit (Qiagen). Kort fortalt blev tumorområde identificeret gennem hæmatoxylin-eosin-farvning og væv fra dette område på ufarvede sektioner blev skrabet til RNA ekstraktion. Efter afparaffinering og lysistrin, blev det totale RNA oprenset med en RNeasy MinElute spin-kolonne. Genomisk DNA blev fjernet med RNase-fri DNase I (Qiagen). Før RNA-amplifikation, blev integriteten og renheden af ​​RNA estimeret ved denaturerende agarosegelelektroforese og A260 /A280 måling. Salg

Real-time PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af AmoyDx ™ EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit (Amoy Diagnostics , Xiamen, Kina) i henhold til producentens anbefalinger. Kort beskrevet 0,1-5 ug totalt RNA blev revers transkriberet til cDNA med M-MLV revers transkriptase (Invitrogen). Seks mikroliter cDNA blev derefter anvendt som template for en 25-pi reaktion til real-time PCR påvisning af EML4-ALK fusionstranskripter vha EML4-ALK Reaction Master Blandinger og en ABI 7500 cyklusapparat (Applied Biosystems). Den EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit beskæftiger roman, proprietære primere til specifikt at forstærke target gensekvens involverer ni kendte EML4-ALK fusion udskrift varianter, herunder E13, A20, E6a /b, A20, E20, A20, E15, A20, E14 , A20, E18, A20, E2, A20, E17, A20. Mængden af ​​mål-cDNA blev målt efter hver cyklus i datafangst fase under anvendelse af en hidtil ukendt fluorescerende probe. Kvaliteten af ​​den syntetiserede cDNA blev efterprøvet under samme løb ved forstærkning af referencen genet (β-actin,

ACTB

). Den EML4-ALK fusion gen og

ACTB

assays blev mærket med FAM. En positiv og negativ kontrol blev inkluderet i hver real-time PCR run. Som defineret i fabrikantens anvisninger, blev QPCR assay for EML4-ALK fusion gen anses for positivt, hvis prøven Ct værdi 30. For de negative prøver blev real-time RT-PCR-analysen gentages to gange.

Statistiske Analyser

De statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS til Windows 13.0 program (SPSS Inc., Chicago , IL). For at analysere sammenhænge mellem

ALK

status og kliniske-patologiske variabler, brugte vi χ2 test eller Fishers eksakte test, hvor det er relevant. Sandsynlighed værdier af 0,05 blev anset for signifikant i analyserne

Resultater

Clinicopathogical funktioner i tumorer

I den foreliggende undersøgelse, analyserede vi et panel af 473 NSCLC prøver. bestående af 375 sager fra kirurgisk operativt fjernede tumorer og 98 sager fra biopsier. Ingen patienter fik kemoterapi på tidspunktet for diagnosen. Som er sammenfattet i tabel 1, patienterne er sammensat af 314 (66,4%) mænd og 159 (33,6%) kvinder med en median alder 59 år (fra 21 til 84 år). Histologisk 341 (72,1%) var adenocarcinom, 112 (23,7%) pladecellekarcinom, og 20 (4,2%) andre typer. Den patologiske etape var jeg i 166 (35,1%), II i 104 (22%), III i 105 (22,2%), og IV i 98 (20,7%) tilfælde.

ALK Protein Expression ved IHC

Alle ALK-positive tilfælde udviste en diffus og cytoplasmatisk farvningsmønster i tumorceller, og ingen immunfarvning blev observeret i normale lunge bronkieepitel, alveolære pneumocytter, alveolære makrofager, mesenkymvæv, og inflammatoriske celler i de tilstødende lungevæv (Figur 1). Tyve tilfælde ud af 473 var ALK-positive, der repræsenterer 4,2% af alle tilfælde undersøgt af IHC, som omfattede score på 3 set i 14 tilfælde med en kornet intens cytoplasmatisk farvning (Figur 1-A), score på 2 i 5 tilfælde med en moderat cytoplasmatisk farvning (Figur 1-C), score på 1 i en sag med en svag cytoplasmatisk farvning (Figur 1-E) og score på 0 i 453 tilfælde (Figur 1-G). Ingen signifikant intratumoral farvning heterogenitet blev observeret, selvom signet-ring celler havde tendens til at udvise svagere farvning end de andre celler, måske fordi cytoplasmatisk ALK-protein blev formindsket med et stort volumen af ​​slim materiale. Der var tilsyneladende ingen sammenhæng mellem ALK genomlejring af FISH og intensiteten af ​​immunfarvning

A, C, E, G:. ALK immunfarvninger (original forstørrelse × 200). A og C: intens og moderat cytoplasmatiske farvninger (score = 3 og 2 henholdsvis), E: svage cytoplasmatiske farvninger (score = 1) og G: ingen farvning (score 0). B, D, F og H. FISH-analyse til

ALK

anvendelse af en tofarvet ALK break-apart probe. B, D og F viser FISH sigals i ALK-omarrangeret tumorer, og andelen af ​​celler med ALK positive signaler var 49% (49/100), 38% (38/100), 56% (28/50), henholdsvis . Omarrangeret

ALK Hotel (B, D og F) er angivet ved spaltning af røde og grønne signaler eller enkelt rød signals.H viser FISH sigals i en ikke-omarrangeret tumor. andelen af ​​celler med ALK positive signaler var 3% (3/100). Ikke-omarrangeret

ALK Hotel (H) viser fusion eller tilstødende røde og grønne signaler.

ALK Omlejring Vurderet af FISH

ALK omlægning blev vurderet ved hjælp af FISH i 110 IHC-negative tilfælde med adenocacinoma histologi og 20 IHC-positive tilfælde. Blandt de 20 IHC-positive tilfælde blev 15 sager bekræftet som

ALK

omlægning af ALK FISH, 5 tilfælde var ikke tolkes, på grund af de tekniske artefakter såsom tab af signal, der muligvis førte fra uhensigtsmæssig fiksering eller tab af tumor væv. Ingen af ​​de 110 IHC-negative tilfælde viste

ALK

omordning ved FISH. Repræsentative billeder af ALK FISH er vist i figur 1-B, D, F, H. Der var to positive

ALK

rearrangement mønstre. En var break-apart (BA) mønster med en eller to adskilte røde og grønne signaler, og en anden blev isoleret rødt signal mønster uden tilsvarende grønt signal. ALK FISH-negative tilfælde viste to fusion signaler eller nærhed af de røde og grønne signaler.

Sammenhæng mellem ALK IHC og FISH

I den foreliggende undersøgelse, 130 sager blev analyseret af både IHC og FISH. Overensstemmelse mellem IHC og FISH er vist i tabel 2. Uden at overveje 5 tilfælde af FISH ikke var tolkes, følsomheden og specificiteten af ​​IHC i de 125 tilfælde, i sammenligning med FISH, var 100% og 100%, hhv. Således viste denne undersøgelse, at der var høj konkordans i vurderingen af ​​

ALK

omlejring mellem IHC og FISH.

EML4-ALK Fusion Gene af QPCR

Vi derefter testet 13 IHC-positive tilfælde af QPCR. De EML4-ALK fusionsgener blev påvist i 9 ud af 13 tilfælde. De omfattede

EML4-ALK

variant 1, 2, 3 med exon 13 af

EML4

, exon 20 af

EML4

, og exon 6a /b af

EML4

fusioneret til exon 20 af

ALK

hhv. Der var 2 tilfælde, hvor EML4-ALK fusionsgener ikke blev registreret af QPCR, men

ALK

omlejringer blev påvist ved FISH. Hertil kommer, at positivt resultat for

EML4-ALK

i 2 tilfælde ikke kunne gentage sig i gentagne analyser. Notatet i et tilfælde, ALK FISH var uninformative for

ALK

omlejring, men sagen blev rapporteret positive ved QPCR. Dette kunne sandsynligvis skyldes knapheden af ​​tumorcellerne. I denne prøve, blev i alt 30 repræsentative tumor cellekerner tælles, og kun to tumorceller var positive.

Clinicopathologic Karakteristik af ALK-positive patienter

I alt 473 resektion og biopsi NSCLC Der blev undersøgt. ALK proteinekspression blev evalueret i alle tilfælde ved IHC.

EML4-ALK

translokationer og /eller

ALK

omlejringer blev yderligere bekræftet i alle ALK-immunpositive tilfælde ved FISH og /eller QPCR. Forholdet mellem

ALK

omlægning og clinicopathologic funktioner er sammenfattet i tabel 3.

ALK

omlægning blev påvist i 20 af 473 NSCLC sager. Af de 20 ALK-positive tilfælde, 19 (95%) var adenocarcinomer, og 1 var sarcomatoid carcinom, som havde en signifikant spindel celle og giant cell komponent. Histomorphologically, som vist i tabel 4,

ALK

-rearranged lunge adenokarcinomer ofte viste solid signetring celle mønster. En solid signet-ring celle mønster eller mucinøs cribriform mønster blev præsenteret mindst fokalt i alle ALK-positive tumorer (figur 2). Som vist i tabel 3, viste ALK-positive patienter statistisk forskel i alder (p = 0,003) og patologisk stadium (p = 0,024) sammenlignet med ALK -negative patienter. Patienter med ALK-positive lungeadenokarcinom var yngre ved diagnose og havde en højere trin, hyppigst i trin IV. Ingen nævneværdig sammenhæng blev demonstreret mellem ALK omlægning og enten patient køn eller rygning historie.

De viste solid signet-ring celle mønster (A), en cribriform struktur (BD), og rigelig ekstracellulær slim (C).

diskussion

Selvom EML4-ALK-fusionsgenet er en mindre genetisk abnormitet i NSCLC [21], [22], var forekomsten af ​​lungekræft stiger i mange lande, det absolutte antal lungekræftpatienter huser EML4-ALK fusionsgenet er ikke trivielt. Crizotinib, har en dobbelt MET /ALK tyrosinkinaseinhibitoren blevet vist at være effektiv til behandling af patienter med ALK-positiv NSCLC. Baseret på dens effekt og sikkerhed blev crizotinib nylig godkendt af det amerikanske FDA til behandling af patienter med fremskreden ALK-positive NSCLC. Men forekomsten af ​​

ALK

omlejring er forholdsvis lav, i området fra 2 til 5%. Selv når en beriget population af NSCLC patienter er udvalgt på baggrund af deres prædiktive kliniske karakteristika, såsom yngre alder, ikke-ryger status og adenocarcinom histologi, er det vanskeligt at identificere de delmængder af ALK-positive tumorer. Derfor effektiv screening for patienter med

ALK

-rearranged NSCLC er et afgørende spørgsmål i klinisk praksis.

ALK break-apart FISH-analysen har fungeret som følgesvend dignostic test for oprettelse ALK positivitet i kliniske forsøg med crizotinib [15]. I teorien, ALK FISH er i stand til at opdage enhver omlægning involverer

ALK

, uanset fusionspartnere eller

EML4-ALK

varianter, på FFPE væv, der udgør den mest anvendte metode til behandling og lagring tumorprøver. fra den teknologiske og omkostninger perspektiv, FISH til rutinemæssig storstilet detektering af

ALK

omlægning i NSCLC er dog stadig, at være udfordrende. Det haster med at udvikle og validere mere omkostningseffektive metoder til påvisning af denne genetiske afvigelse. Aktuelle diagnostiske metoder til at opdage

ALK

omlægning omfatter immunhistokemi (IHC), FISH og polymerasekædereaktion (PCR) -baserede metoder. Dog er tilstrækkelige oplysninger om en passende sammenligning med FISH øjeblikket mangler.

IHC er en hurtig og billig metode foretrækkes af patologer til rutinemæssig diagnose. Det kan udføres med succes på en række histologi og cytologiprøver. Selvom den immunhistokemiske teknikken ikke direkte detektere ALK fusionsgenet selv, baseret på den iagttagelse, at ALK ikke kan detekteres i nogen andre end hjernen [23] normale væv, er ALK-immunoreaktivitet forbundet med opreguleret ekspression af genet, på grund af den ændret promotoraktivitet, der er meget karakteristisk for en

ALK

inversion. Tidligere undersøgelser har vist, at nogle kommercielt tilgængelige ALK antistoffer har relativt lavere følsomhed i detektering ALK ved IHC, muligvis på grund af en svag transkriptionel aktivitet af promotor-enhancer region

EML4

som driver ekspressionen af ​​EML4-ALK. Den D5F3 antistof (Cell Signalling Technology) er en af ​​de mest lovende antistoffer til påvisning af

ALK

omlægning i NSCLC [19]. Dog forbliver yderligere undersøgelser nødvendige for at validere overensstemmelse mellem IHC og FISH i større serier af prøver

I den foreliggende undersøgelse, vi udført immunhistokemi anvendelse af monoklonalt antistof (klon SP8; Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, USA)., en almindeligt anvendt, velafprøvede ALK antistof på samme fortynding som anvendes i ALCL, hvilket gør dets anvendelse mere praktisk fra et diagnostisk laboratorium perspektiv. Dette antistof genkender et humant p80-protein, der er konstateret som en hybrid af ALK-genet og nucleophosmin (NPM) genet som følge af t (2; 5) (p23; q35) translokation findes i 30-50% af CD30 + store celle lymfomer. Det erkender også i fuld længde ALK protein. Vores IHC metode er baseret på en standard IHC metode til rutinemæssig patologi praksis. Vi forlænget antigen hentning tid og inkuberet antistof natten over i 4 ° C for at forbedre følsomheden og specificiteten. ALK-positiv rate i vores NSCLC tilfælde (20/473, 4,2%) var sammenlignelig med en sats på EML4-ALK fusion udskrift rapporteret i de tidligere undersøgelser (2-5%). Alle ALK-positive NSCLC tilfælde ved IHC viste ALK genomlejring af fisk og /eller QPCR. På den anden side, blandt 473 NSCLC sager, vi tilfældigt udvalgte 110 IHC-neagative sager med adenocarcinom histologi at evaluere

ALK

omlægning af FISH, og fandt, at der ikke var nogen sager, hvor

ALK

genomlejring blev påvist. I modsætning til en tidligere undersøgelse [6], IHC-test med SP8 antistof viste højere specificitet og følsomhed i vores undersøgelse. ALK farvning forudsat en meget ren, let fortolkelige immunoreaktivitet uden at forstyrre baggrund farvning i de positive tilfælde. Denne uoverensstemmelse resulterede formentlig fra forskellige IHC procedure som antigen hentning og antistof inkubation eller skyldtes variationerne i vævsbehandling i forskellige laboratorier. Vores resultater manglede at blive bekræftet i pilsner kohortestudier.

RT-PCR af cDNA har været en almindeligt anvendt screening strategi for ALK gen omlejringer. Ved sekventering af PCR-produktet, kan den specifikke EML4-ALK-varianter udtrykt identificeres. Dog vil nye ALK fusionspartnere ikke påvises med sådanne teknikker. I de seneste undersøgelser, RT-PCR-detektion af

ALK

omlejring er stort set begrænset til frisk eller frosset væv. Sammenlignet med multiplex RT-PCR, QPCR vises en perfekt egnet fremgangsmåde til direkte identifikation af fusion variant og detektion af dets ekspression niveau, på grund af dens lave omkostninger og hurtigt ekspeditionstid. RT-PCR-detektion af

ALK

omordning på FFPE væv kræver optimering af assay design og er fortsat skal vurderes i store kohortestudier. I vores undersøgelse, udførte vi QPCR på FFPE væv fra 13 ALK-positive tilfælde ved IHC. 2 tilfælde var negative for

EML4-ALK

af QPCR, men positiv for

ALK

arrangement ved FISH. Formentlig var der nye ALK fusionspartnere eller roman

EML4-ALK

variant, mens vores assay design involveret kun ni kendte

EML4-ALK

varianter. Dette forblev valideres af gen-sekventering. I yderligere, kan nedbrydning af RNA i FFPE væv blokke også føre til falsk negative resultater. I vores undersøgelse, alle de testede FFPE væv blokke var 7-45 måneder gamle, når vores afsløring arbejde blev udført. RNA kvalitet og ikke er kontamineret med genomisk DNA blev verificeret ved formaldehyd-agarose-gelelektroforese. Vi kvantificeres også niveauet af β-actin som den endogene RNA kvalitetskontrol. Den krævede kvalitetskontrol, herunder en kontrol uden template, kendt ALK-positiv og negativ kontrol blev udført under hele proceduren. Vores resultater viste QPCR på FFPE væv ikke var effektiv nok som en eneste påvisningsmetode, men det forblev nyttigt at identificere de involverede fusion variant når frosne materiale er ikke tilgængelig.

Vi udførte FISH, hvilket betragtes som den aktuelle