PLoS ONE: et antistof til De-N-Acetyl sialsyre Indeholder-Polysialic Acid Identificerer en intracellulær Antigen og fremkalder apoptose i Human Cancer Cell Lines

Abstrakt

Polysialic syre (PSA), en α2,8- forbundet homopolymer af N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac), er udviklingsmæssigt reguleret, og dets ekspression menes at være begrænset til nogle få væv hos voksne. For nylig viste vi, at to humane patogener udtrykte et derivat af PSA-de-N-acetyl sialinsyrerester (NeuPSA). Her viser vi, at en epitop identificeret ved anti-NeuPSA monoklonalt antistof, SEAM 3 (SEAM 3-reaktivt antigen eller S3RA), udtrykkes i humane melanomer, og også intracellulært i en human melanoma cellelinie (SK-MEL-28), en human T-celle-leukæmi-cellelinie (Jurkat), og to neuroblastoma cellelinier (CHP-134 og SH-SY5Y). SEAM 3 binding induceret apoptose i de fire testede cellelinjer. Den usædvanlige intracellulære fordeling af S3RA svarede til den beskrevet for PSA polysialyltransferases, STX og PST, som afspejles i de fire anvendte cellelinier her. Interessant suppression af PST-mRNA-ekspression ved transfektion af SK-MEL-28-celler med PST-specifik lille interfererende RNA (siRNA) resulterede i nedsat SEAM 3-binding. Resultaterne tyder yderligere undersøgelser af anvendeligheden af ​​antistoffer, såsom SEAM 3 som terapeutiske midler for visse maligniteter

Henvisning:. Steirer LM, Moe GR (2011) et antistof til De-N-acetyl sialinsyre indhold-Polysialic acid Identificerer en intracellulær antigen og inducerer apoptose i humane cancercellelinier. PLoS ONE 6 (11): e27249. doi: 10,1371 /journal.pone.0027249

Redaktør: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasilien

Modtaget: August 18, 2011; Accepteret: 12. oktober 2011; Udgivet: 9. november, 2011

Copyright: © 2011 Steirer, Moe. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var tilvejebragt af NIH NIAID tilskud nummer AI064314 (www.niaid.nih.gov/Pages/default.aspx), NIH NCRR tilskud numre CO6 RR-16226 og S10RR025472 (www.ncrr.nih.gov), børnehospital Filialer, Inc. ( www.childrenshospitalbranches.org), NIH NHLBI T-32 5T32DK078514-09 (grants.nih.gov/training/nrsa.htm), Swim Across America San Francisco Bay Area (www.swimacrossamerica.org), og Jennifer Leigh Wells Familie (www.moonlight4meningitis.com/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

PSA modifikation synes at være begrænset til nogle få animalske proteiner og kapselpolysaccharider af neuroinvasive bakterier

Neisseria meningitidis

gruppe B (NMB) og

E. coli

K1 [1]. Hos mennesker har PSA vist sig at være til stede på neural celleadhæsionsmolekyle (NCAM) [2], synaptisk celleadhæsionsmolekyle 1 [3], alfa-subunit’en af ​​spændingen følsomme natriumkanal [4], integrin alpha 5 subunit [ ,,,0],5] scavenger receptoren CD36 [6], neuropilin-2 [7], og PSA polysialyltransferases ST8Sia2 og ST8Sia4, også kendt som STX og PST, henholdsvis [8]. NCAM er den mest rigelige polysialylated protein, især under fosterudviklingen, og den rolle, polysialylation i NCAM funktion er den mest grundigt undersøgt [9]. NCAM polysialylation blokerer de adhæsive egenskaber af NCAM at tillade cellevandring og modulere andre NCAM funktioner [9]. I voksne mus, er PSA-ekspression begrænset til nogle få væv i hjernen, der udviser synaptisk plasticitet såsom lugtekolben og hypothalamus [9] og kan have en rolle i celleudvikling T [10]. Nogle humane tumorer, herunder astrocytoma [11], småcellet og ikke-småcellet lungekræft [12], myelomatose [13], neuroblastom [14], rhabdomyosarcom [15] og Wilms ‘tumor [16] express PSA og den relative niveau af PSA-ekspression i nogle kræftformer er blevet associeret med dårlig prognose [12], [17].

Under udviklingen af ​​vacciner til forebyggelse af sygdomme forårsaget af NMB, opdagede vi, at et murint monoklonalt antistof (mAb ) SEAM 3, som blev produceret ved immunisering med et N-propionyl-derivatet NmB kapselpolysaccharid (N-Pr Mbps) -baseret vaccine [18], anerkendte PSA antigener, der indeholdt de-N-acetyleret neuraminsyre (Neu) rester [19] [20], [21]. Tilstedeværelsen af ​​Neu rester i N-Pr MBPS-tetanustoksoid-vaccine var en utilsigtet side produkt som følge af ufuldstændig re-N-acylering. Efterfølgende viste vi, at neuraminsyre-indeholdende PSA (NeuPSA), herunder fuldt de-N-acetyleret PSA, var immunogene og fremkaldte antistoffer, som var beskyttende mod NmB og NMC-stammer [19].

Selvom NeuPSA havde ikke tidligere blevet beskrevet hos mennesker, kortere Neu-holdige sialsyregrupper antigener (NeuSia), såsom gangliosider var rapporteret at være til stede i nogle humane tumorer og cancercellelinier [22], [23], [24]. NeuSia antigener udtrykt i humane tumorer omfatter NeuSia varianter af mono- og disialylogangliosides GM3 og GD3 [22], [23], [24], [25], [26], hhv. Hakomori og medarbejdere viste, at NeuSia GD3 udtrykt i den humane epitel- carcinom-cellelinie A431 blev en stærk aktivator af epidermal vækstfaktorreceptor-kinase i Triton X-100-behandlede celler [27], [28]. Resultatet antyder, at NeuSia GM3 derivat kan have en rolle i aktivering receptor pathways, der fremmer celleproliferation. Brug radioaktive eksperimenter mærkning i melanom-cellelinjer, Varki og kolleger viste, at N-acetylgrupper i gangliosiderne GD3 og GM3 vendes hurtigere end forælder molekylerne, hvilket tyder eksistensen af ​​NeuSia-holdige gangliosider i disse celler [25]. For nylig Popa et al isoleret og strukturelt karakteriseret NeuSia-indeholdende GD3 fra primære humane melanomtumorer [26]. Da nogle kræftceller udtrykker NeuSia antigener, det rejst spørgsmålet om, hvorvidt de længere NeuPSA-modificerede antigener også udtrykkes af humane cancerceller. I det følgende, undersøgte vi reaktiviteten af ​​SEAM 3 med normal human hud, primære humane melanomtumorer og adskillige humane cancercellelinier, herunder leukæmi, melanoma, og neuroblastomceller, og den funktionelle aktivitet af SEAM 3 mod disse cancercellelinjer.

Resultater

Specificitet af mAb SEAM 3

Vi har tidligere vist, at SEAM 3 er reaktivt med en bred vifte af Neu-holdige oligosialic syre (OSA) /PSA derivater [18], [19], [20]. At definere specificitet SEAM 3 med hensyn til NeuOSA /PSA antigener sandsynligvis vil blive udtrykt naturligt (dvs.. N-acetyl-holdige derivater), vi udarbejdet delvist de-N-acetylerede derivater af OSA ved mild basis behandling af oprensede oligosaccharider, der har en polymerisationsgrad (DP) på 2, 3, og 4. den gennemsnitlige mængde Neu blev bestemt under anvendelse af en modificeret resorcinol assay, der kan måle mængden af ​​neuraminsyre (Neu) og N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac) i PSA [19] . Efter mild basebehandling, oligosacchariderne indeholdt -25% Neu og der var nogen nedbrydning af de længere oligosaccharider, såsom at trimeren indeholdt både dimerer og trimerer og tetrameren indeholdt dimerer, trimerer og tetramerer. Den relative evne af oligosacchariderne at inhibere binding af SEAM 3 til den nominelle N-Pr MBPS antigen blev bestemt ved ELISA. Resultaterne er opsummeret i tabel 1. Koncentrationerne af oligosaccharid kræves for at inhibere SEAM 3-binding repræsenterer øvre grænser, eftersom præparater indeholder en blanding af kortere oligosaccharider foruden den længste angivet med DP. Desuden gør det antal givet for DP ikke hensyn til den mulige virkning, at C2 carbonylgruppen af ​​reducerende ende rest, som er nødvendigt for at forhindre nedbrydning under basen behandling. Givet disse overvejelser, oligosaccharider med en DP på ​​4 var de bedste inhibitorer af SEAM 3-binding. Evnen af ​​oligosaccharider til inhibering SEAM 3 binding blev ikke påvirket af inkubere dem ved pH 5 uden eller med exoneuraminidase ved 37 ° C i 48 timer (data ikke vist). Behandlingerne berige oligosacchariderne til kæder, der har Neu ved den ikke-reducerende ende [19]. SEAM 3 binding ikke blev inhiberet af nært beslægtede MCPS (dvs.. Poly α2,9 N-acetylneuraminsyre), enten når det er fuldt N-acetyleret eller indeholder de-N-acetylerede rester (tabel 1). Samlet konkluderer vi, at SEAM 3 genkender oligo eller polysialic syrederivater med en DP på ​​4 eller større, hvor cirka hver fjerde rest er Neu, som kan være placeret ved den ikke-reducerende ende eller ved de indre positioner af polymeren (figur 1 ).

immunhistokemisk (IHC) farvning af normal menneskelig hud og primære melanom tumorer

i normale væv, de-N-acetyl GD3 blev rapporteret at blive udtrykt “på lave niveauer i nogle blodkar, infiltrerende mononukleære celler i huden og colon og på moderate niveauer i huden melanocytter “[22]. Højere niveauer blev udtrykt i melanomer [22]. PSA-NCAM er almindeligt udtryk i endodermal, mesodermal, ektodermal og neuro-ektodermal afledte væv på forskellige stadier af fostrets udvikling, men udtryk hos voksne er begrænset til nogle få områder i hjernen udviser neuro-plasticitet [29]. For at bestemme om antigener er reaktive med SEAM 3 blev udtrykt i normal human hud og primære melanomer, udførte vi IHC på frosne og formalinfikserede paraffinindlejrede vævsprøver. MAb R24 blev anvendt til at markere GD3. Chammas et al., Har rapporteret, at formalin behandling af vævsprøver kan resultere i modifikation af de-N-acetyl GD3 aminogrupper med formaldehyd, resulterer i tab af reaktivitet med anti-de-N-acetyl GD3 mAb’er [22]. Desuden har IHC-farvning for tilstedeværelse af GD3 i formalin-fikserede paraffin-indlejrede væv prøver blevet beskrevet som værende følsomme over for tab af anti-GD3-reaktivitet som følge af procedurer antigen recovery [30]. Vi fandt de respektive farvningsmønstre observeret for hver mAb testet var den samme uanset hvilken metode blev anvendt til fremstilling af prøver, bortset fra, at farvningen blev reduceret til en vis grad i frosne, ikke-fikserede prøver sammenlignet med paraffin indlejret, formalin-fikserede væv. Det var også mere vanskeligt at opnå store, ubrudte sektioner af væv i de ikke-fikserede prøver. Da fastsættelse prøverne resulterede i overlegen bevarelse af vævsstruktur og større følsomhed af farvning er kun de opnået ved anvendelse fikserede væv resultater vist.

IHC-farvning af fast normal menneskehud viser, at SEAM 3 mark celler i skæl- epitel og infiltrerende lymfocytter (figur 2A), medens den negative kontrol irrelevant murint IgG2b og IgG3 mAb’er viste ingen reaktivitet. I modsætning hertil anti-GD3-mAb var kun reaktivt med antigener til stede i et par melanocytter i normal hud (figur 2A, eksempel angivet med pil). SEAM 3 farvning viste sig at være stort set cytoplasmatisk med en karakteristisk kornet udseende. SEAM 3-binding til antigener til stede i normal hud kunne inhiberes med mere end 90%, når mAb blev præinkuberet med N-Pr MBPS (50 ug /ml). N-Pr MBPS er polysaccharidantigenet anvendes til fremstilling af SEAM 3 [18]. Resultatet viser, at SEAM 3 binding blev medieret af antistofkombinerende sted.

IHC analyser af SEAM 3 og anti-GD3-binding til normal human hud (A) og en primær melanom (B). Formalin-fikseret normal human hud (A) og den primære melanom (B) blev inkuberet med irrelevant IgG2b, SEAM 3, SEAM 3 med et polysaccharid inhibitor N-Pr Mbps, irrelevant IgG3 og anti-GD3-mAb R24 som angivet. Binding blev påvist under anvendelse DAB, som frembringer et brunt bundfald. Modfarvning blev udført under anvendelse hemotoxylin. Pilen i mikrograf af SEAM 3-binding til normal hud viser et eksempel på SEAM 3 markerer en infiltrerende lymfocyt og for anti-GD3 mikrografi, en melanocyt. Reference barer = 40 um.

Den mørke farvning af melanom prøven som følge af SEAM 3 binding (figur 2B) viser, at S3RA antigener blev udtrykt i tumoren. Som med normal hud, blev SEAM 3-binding til antigener i melanom prøve inhiberes med opløseligt N-Pr Mbps (figur 2B). Den intense farvning af melanom prøven viser, at S3RA blev udtrykt ved højere niveauer i tumoren sammenlignet med normale epitelceller. Alle tumorceller i afsnittet, som havde dimensioner på ca. 1 cm × 2 cm, blev farvet. I modsætning hertil anti-GD3-mAb udviste heterogen binding til tumorvævet med nogle celler markeret med mAb mens andre viste ingen farvning (figur 2B).

Udover eksemplet primære humane melanom vist i figur 2B , en vifte af 12 mindre primære humane melanom prøver taget fra huden, esophageal, parotideale og rektale tumorer blev vurderet til søm 3 og irrelevant IgG2b reaktivitet ved IHC. Alle melanom prøver i arrayet var reaktive med SEAM 3, medens det irrelevante IgG2b mAb viste ingen reaktivitet (data ikke vist). Intensiteten af ​​farvning som følge af SEAM 3-binding i melanom tumor arrayet svarede til den vist i figur 2B eksempel. Prøver af normal hud taget fra områder, der støder til nogle af de melanomer, der var inkluderet i prøven vifte udstillede det samme mønster af SEAM 3 reaktivitet som vist i figur 2A med normal hud (data ikke vist).

Expression af S3RA i cancer-cellelinjer

da de-N-acetyl sialinsyre-holdige derivat af disialyloganglioside GD3 er blevet rapporteret at være til stede i melanomcellelinier [24] samt i primære humane tumorer [26 ] og vi fandt, at SEAM 3 var reaktivt med primære melanomer (Figur 2B), udførte vi flowcytometri til måling SEAM 3 binding med fire humane cancercellelinjer, der udtrykker forskellige Sia-holdige antigener (tabel 2).

Figur 3 viser binding af underklassen-matchede irrelevant mAb IgG2b forhold til sømmen 3, anti-GD3-mAb R24 og anti-NCAM (CD56) mAb-binding til SK-MEL-28 melanom og SH-SY5Y-neuroblastomceller i fravær og nærvær af Triton X-100 behandling, som angivet. Gates definere celler som positive for binding blev sat under anvendelse subklasse matchede isotypekontroller og er angivet på hvert histogram vist i figur 3. I fravær af detergent, 29% af SK-MEL-28-celler var positive for SEAM 3 binding sammenlignet med 80% for anti-GD3 og 3% for det irrelevante mAb. Men når cellerne blev gjort permeable for mAb’erne ved behandling detergent, 82% af SK-MEL-28-celler var positive til søm 3-binding og den relative fluorescens steg mere end 10 gange. Procenten af ​​anti-GD3-positive celler steg en smule til 92%. Binding af anti-NCAM mAb var sammenlignelig med det irrelevante IgG1 mAb i nærvær eller fravær af detergent, og derfor blev N-CAM ikke udtrykkes i SK-MEL-28-celler. For SH-SY5Y-cellelinie, 20% af de ikke-detergent-behandlede celler var positive for SEAM 3 binding, som steg til 96% i nærvær af detergent (figur 3). Også den relative fluorescens steg med mere end 10-fold. Større end 85% af SH-SY5Y-celler var positive for anti-NCAM og mindre end 21% for anti-GD3 bindende i både intakte eller permeabiliserede celler. Resultaterne er sammenfattet i tabel 3 for de fire cellelinier viser, at procentdelen af ​​celler positive til søm 3-binding og den gennemsnitlige fluorescens af cellerne var variabel blandt de testede cellelinier. Men de intakte celler af hver cellelinie var stort set negativt til søm 3-binding. I modsætning hertil næsten alle celler af hver cellelinie indeholdt intracellulære SEAM 3-reaktive antigener (S3RA). Den fremherskende intracellulære fordeling af S3RAs ikke svarede til fordelingen af ​​GD3 eller PSA-NCAM, som primært blev lokaliseret på celleoverfladen. Resultatet antyder, at S3RAs ikke var de-N-acetyl Sia derivater af enten GD3 eller PSA-NCAM eller at de intracellulære modstykker af disse molekyler ikke var reaktive med de respektive mAb’er.

SK-MEL-28 og SH -SY5Y celler var enten ubehandlede for at detektere overfladen binding (øvre panel i hvert sæt af to paneler), eller behandlet med Triton-X 100 til påvisning af intracellulære binding (nederste panel) ved flowcytometri. Celler blev inkuberet med 5 ug /ml af hver primært antistof, efterfulgt af inkubation med 2 ug /ml Alexa Fluor 488-konjugeret sekundært antistof. Irrelevant murint IgG2b, IgG3 og IgG1 mAb’er blev anvendt som negative kontroller til søm 3, anti-GD3, og anti-NCAM henholdsvis og blev anvendt til at bestemme basislinie fluorescens. Binding blev påvist under anvendelse Guava EasyCyte flowcytometer. Gates bruges til at definere celler er positive for binding er angivet øverst i hvert histogram.

For at demonstrere specificiteten af ​​binding, faste og permabolized Jurkat eller SK-MEL-28 celler blev inkuberet med SEAM 3 i fravær og nærvær af N-Pr MBPS inhibitor. I modsætning til de faste prøver væv imidlertid de relativt høje koncentrationer af SEAM 3 (5 ug /ml) i kombination med den opløselige N-Pr MBPS inhibitor produceret tvetydige resultater. I nogle eksperimenter blev observeret partiel inhibering, men i andre polysaccharidet inhibitoren havde enten ingen virkning eller resulterede i en stigning i binding. Det er muligt, at de variable virkninger af tilsætning af n-Pr Mbps til bindingsreaktionen skyldtes tilbøjelighed NeuPSA derivater er til stede i den N-Pr MBPS præparat til dannelse aggregater der er for store til at undslippe permeablized celler eller at cellerne har receptorer for NeuPSA der også binder til N-Pr Mbps.

fluorescens mikroskopi.

Immuno-fluorescensmikroskopi (IFM) blev anvendt til yderligere at undersøge cellulære lokalisering af SEAM 3-reaktive epitoper i detergent ubehandlet og behandlet SK-MEL-28 og CHP-134-celler (figur 4). Resultaterne af flowcytometri bindingsforsøg med SK-MEL-28-celler ikke behandlet eller behandlet med detergent (figur 3) foreslog, at SEAM 3 reaktive epitoper havde en cellulær lokalisering, der var forskellig fra GD3 og PSA-NCAM. I overensstemmelse med disse resultater, kun en delmængde af SK-MEL-28 og CHP-134 celler ikke behandlet med detergent var reaktive med SEAM 3 ved IFM (rød fluorescens i figur 4). Som vist i figur 4, SK-MEL-28-celler, der var mest reaktiv med SEAM 3 blev “rundet op” celler med relativt kondenseret kerne-DNA som vist ved DAPI-farvning. Aflange celler var mindre reaktive med SEAM 3 (sammenlign SK-MEL-28-celler i lysmikroskopi vist i figur 4 med IFM). I modsætning hertil anti-GD3 mærkede alle celler (grøn fluorescens som angivet i figur 4). Men når SK-MEL-28-celler blev behandlet med detergent, alle celler var positiv til søm 3-binding (figur 4). I de detergent-behandlede celler, blev SEAM 3 reaktivitet dispergeret gennem cytoplasmaet i granulneuroner-lignende strukturer (figur 4, eksempel angivet med en pil). Anti-GD3-reaktivitet var karakteriseret ved en diffus mønster af farvning med pletter af koncentreret reaktivitet i både ubehandlede og detergent-behandlede celler (figur 4). Der var en vis grad af co-lokalisering tydeligt i sammensatte billeder af SEAM 3 og anti-GD3-labled celler (gul i figur 4), men klare forskelle samt. Således blev SEAM 3 reaktivitet ikke direkte korreleret med andre end tilfældig lokalisering til membranen i fravær eller nærvær af detergent og ekspression af S3RAs var begrænset til en delmængde af celler GD3. Salg

Lette mikrografier af SK-melodilinjen 28 og CHP-134 viser den generelle form af celler med kerne-DNA vist med blåt. Anti-NeuPSA mAb SEAM 3 binding (med rødt) til SK-MEL-28 og CHP-134 celler ikke behandlet eller behandlet med Triton X-100 til permeablize cellerne, blev sammenlignet med anti-GD3 og -PSA med grønt, som angivet . Subcellulære lokalisering af S3RA i SK-MEL-28-celler med Golgi (Giantin, golgin 97 og Tuba) og ER (calnexin) markører er vist i det nederste panel i gul. Pile viser granulære vesikuløse-lignende strukturer med relativt intens SEAM 3-farvning. Reference barer = 20 um.

I CHP-134 celler, SEAM 3-reaktive epitoper (rød fluorescens i figur 4 CHP-134 celler som angivet) blev primært lokaliseret til grænser kontakt mellem celler. PSA-antigener, som detekteret med anti-PSA mAb 2-1-B [31] (grøn fluorescens i figur 4 som angivet), blev også placeret hovedsageligt i områder af celle-celle-kontakt. Selv fluorescensen som følge af SEAM 3 binding var lavere, både den relative intensitet og fordeling af fluorescens som følge af anti-PSA binding blev ligner SEAM 3 i intakte celler som vist ved den gule farve er resultatet af overlejring af rød og grøn fluorescens i det sammensatte billede (figur 4). Dette var tegn på sømmen 3-mærkede antigen er anbragt på celleoverfladen. Desuden blev SEAM 3 mærkning korreleret med anti-PSA mærkning (Manders ‘koefficient for grøn = 0,998) og i mindre grad med anti-NCAM mærkning (Manders’ koefficient for grønne = 0,642; mikrografier ikke vist) i enten fravær eller nærvær Triton X-100. Men når cellerne blev behandlet med detergent var der mindre overlapning mellem SEAM 3 og anti-PSA mærkning (angivet med relativt større mængde af rød fluorescens i detergentet behandlede sammensatte mikrografi), hvilket antyder, at der var en brøkdel af antigener genkendes af mAb’er in fælles og adskilte antigener indregnes separat.

Siden i SK-MEL-28 celler størstedelen af ​​antigener reaktive med SEAM 3 blev placeret i kornet lignende strukturer i celler, vi udførte IFM hjælp markører for Golgi og endoplasmatiske reticulum ( eR) at afgøre, om SEAM 3 reaktivitet var forbundet med disse særlige subcellulære organeller. Golgi markører inkluderet Giantin og golgin-97 for cis /mediale og trans Golgi membraner, henholdsvis og Tuba, et multifunktionelt protein menes at være involveret i regulering af celle vejkryds og endocytisk handel [32] af Golgi-afledte vesikler i cytoplasmaet [33] . Calnexin, blev en molekylær chaperone-protein anvendes som en ER markør [34]. Som vist ved tilstedeværelsen eller manglen på gul fluorescens i sammensatte billeder, SEAM 3 var i det væsentlige co-lokaliseret med Golgi og ER (som angivet i figur 4) markører. Co-lokalisering blev analyseret yderligere hjælp Jacop [35] i Image J. Alle Golgi og ER markører viste sig at have høj colokalisering for markøren versus SEAM 3 (Manders ‘koefficienter for grøn alle større end 0,92) med indlysende fordeling af S3RAs uden for organeller samt. Den nærmeste samlede colokalisering var mellem SEAM 3 og tuba som vist i figur 4. Således NeuPSA antigener påvises under anvendelse SEAM 3 blev hovedsagelig placeret inde celler og associeret med Golgi, ER og cellulær matrix, men var også til stede på overfladen af ​​subpopulationer af hver cellelinie.

Ekspression af polysialyltransferases PST og STX i cancercellelinier

neuroblastomcellelinier CHP-134 og SH-SY5Y var kendt for at udtrykke høje niveauer af PSA i form af PSA -NCAM, mens Jurkat- og SK-MEL-28 celler blev ikke kendt for at udtrykke PSA eller NCAM. Da NeuPSA sandsynligvis være afledt af PSA, målt vi udtryk for α2,8 polysialyltransferases ST8Sia2 (STX) og ST8Sia4 (PST) mRNA i de fire cellelinier ved kvantitativ PCR. SH-SY5Y-celler er blevet vist at udtrykke både STX og PST [36], og blev anvendt til sammenligning af STX og PST-ekspression i de andre cellelinjer. Ved hjælp af absolut kvantificering, vi bestemt STX udtryk var højest i SH-SY5Y celler, med 1,2 × 10

6 kopier /1 × 10

7 eksemplarer af GAPDH (Figur 5). CHP-134 udtrykte tilsvarende niveauer af STX, mens SK-MEL-28 celler udtrykte næsten 100 gange mindre og jurkatceller udtrykte næsten 1000 gange mindre STX. SH-SY5Y celler udtrykte den mindste mængde af PST sammenlignet med de øvrige tre cellelinjer, med 9,0 × 10

2 kopier /1 × 10

7 eksemplarer GAPDH. CHP-134, SK-MEL-28, og Jurkat celler udtrykte 60, 140, eller 550 gange mere PST, sammenlignet med SH-SY5Y-celler (figur 5).

1 ug totalt RNA fra hver cellelinje blev revers-transkriberet til cDNA anvendes derefter som template i QRT-PCR-reaktionen. MRNA’et kopi antal STX, PST, og GAPDH bestemt ud fra en standardkurve for serielt fortyndede standarder er vist i grafen som mål-mRNA kopier pr 10

7 GAPDH mRNA kopier. Fejl barer er SEM for tredobbelte målinger fra tre uafhængige populationer af hver cellelinie.

afhængighed af SEAM 3 reaktivitet med SK-MEL-28 celler på ekspression af polysialyltransferase PST

at fastslå, at SEAM 3 er reaktivt med et antigen, der er afledt af PSA, undersøgte vi, om inhibering af ekspressionen af ​​polysialyltransferase PST-mRNA i SK-MEL-28-celler med PST-specifik lille interfererende RNA (siRNA) ville resultere i et fald i SEAM 3-positive celler ved flowcytometri. Negativ kontrol scrambled siRNA eller PST specifik-siRNA blev transficeret i SK-MEL-28-celler, og efter 72 timer er den relative mængde (RQ) af PST foreliggende var signifikant reduceret (P 0,0001) i cellerne transficeret med PST siRNA (RQ = 0,124) sammenlignet med celler transficeret med negativ kontrol siRNA (RQ = 1) (figur 6).

SK-MEL-28-celler blev transient transficeret med 50 nM siRNA i 72 timer i tre eksemplarer, så totalt RNA fra hver cellelinie blev revers-transkriberet til cDNA og anvendt som template i QRT-PCR-reaktionen. Relativ kvantificering blev bestemt under anvendelse af komparativ CT-metoden, normaliseret til GAPDH mRNA.

I dette forsøg kun undergruppen af ​​celler transficeret med siRNA og udtømt for allerede eksisterende PSA-derivater vil forventes at vise afdøde reaktivitet med SEAM 3 hvis antigenet reaktivt med mAb var afhængig af aktiviteten af ​​PST. På trods af disse begrænsninger, i tre separate forsøg med to udført tredobbelt, den del af SEAM 3-positive celler blev signifikant reduceret i celler transficeret med PST siRNA sammenlignet med celler transficeret med scrambled siRNA (tabel 4). Resultatet viser klart, at antigener genkendes af SEAM 3 i SK-MEL-28 celler var afhængig af ekspressionen af ​​PST.

Cytotoksisk funktionelle aktivitet af SEAM 3 mod kræftceller

funktion af S3RA i celler er ukendt. For at bestemme hvilken virkning interferere med funktionen af ​​S3RA udtrykt på celleoverfladen kan have, blev celler inkuberet natten over med SEAM 3 ved mAb-koncentrationer anvendt i bindingsundersøgelser beskrevet ovenfor. Ved mikroskopisk undersøgelse, at cellerne udviste karakteristika undergår apoptose (data ikke vist). Baseret på denne indledende bemærkning anvendte vi to uafhængige assays til at måle effekten af ​​SEAM 3 på levedygtigheden af ​​de fire cellelinier: flowcytometri med ViaCount reagens og et lactat dehydrogenase (LDH) release assay. Det første er baseret på membran gennemtrængelig og uigennemtrængelige DNA-bindende fluorescerende farvestoffer og LDH-analysen om frigivelse af LDH som følge af tab af membranen integritet. Resultaterne for koncentrationsafhængig virkning SEAM 3 på levedygtigheden af ​​de fire cellelinier efter 16 timers inkubation ved hjælp af LDH assay er vist i figur 7A. Oprenset SEAM 3 var cytotoksisk over for de fire testede cellelinjer men effekten var variabel for hver cellelinie. Jurkat-celler var de mest følsomme over for sømmen 3-medieret antistof cytotoksicitet (ADC), mens SK-MEL-28-celler var den mindst følsomme. Ca. 45% af Jurkat-celler og 25% af SK-MEL-28, CHP-134, og SH-SY5Y-celler blev dræbt ved den højeste SEAM 3 testede koncentration. SEAM 3-cytotoksicitet syntes at flade ud til en fast brøkdel af celler. F.eks ADC mod Jurkat og SH-SY5Y-celler medieret af SEAM 3 nærmede et maksimum ved ca. 10 ug /ml SEAM 3 med kun en marginal forøgelse af dræbte 20 ug /ml (figur 7A). Resultaterne kan afspejle det faktum, at både antallet af celler og mængden af ​​S3RA udtrykt af cellerne var variabel blandt cellelinjer (se tabel 3), og at mængden af ​​antigen forbliver relativt konstant i populationen af ​​celler over 16 timer tidsperiode. Resultater svarende til dem vist i figur 7A, blev opnået ved anvendelse af Guava ViaCount assay (data ikke vist). For at demonstrere specificiteten af ​​SEAM 3 ADC aktivitet, vi har forsøgt at hæmme drab med opløseligt N-Pr Mbps. hæmning Forsøget blev dog beskæmmet, fordi opløseligt N-Pr MBPS blev taget op af levende celler, hvilket resulterer i en markant stigning i ekspressionen af ​​S3RA (BT Hagen og GR Moe, upubliceret).

(A), antistof cytotoksicitet af SEAM 3 imod SK-MEL-28, CHP-134, SH-SY5Y, og Jurkat-celler som målt ved LDH-frigivelse-assay. Hver cellelinje blev inkuberet med stigende koncentrationer af SEAM 3 i 16 timer. LDH-frigivelse blev målt og procent cytotoksicitet blev bestemt ved anvendelse spontan frigivelse og maksimal frigivelse efter behandling med Triton X-100. (B), Analyse af SEAM 3-medieret apoptose mod SK-MEL-28-melanomceller ved flowcytometri. SK-MEL-28-celler blev inkuberet med et irrelevant IgG2b mAb (5 ug /ml), DMSO, 0,1 uM Staurosporin, eller 5 pg /ml SEAM 3 til 12 eller 24 timer. Celler blev derefter farvet med fluorescerende mærket annexin V og propidiumiodid og fraktionen af ​​levende (åbne søjler), apoptotiske (cross-skraverede søjler), og døde celler (sorte søjler) blev målt ved flowcytometri.

SEAM 3 binding inducerer apoptose i Jurkat og SK-MEL-28 celler

for at afgøre, om SEAM 3 cytotoksicitet skyldtes apoptose Jurkat og SK-MEL-28 celler, vi sammenlignet effekten af ​​SEAM tre bindende for cellerne til virkningen af ​​staurosporin, en generel kinase inhibitor, som er et klassisk inducer af apoptose [37]. I eksemplet vist i figur 7B eksempel blev SK-MEL 28-celler inkuberet i 12 og 24 timer med det irrelevante mAb, DMSO, staurosporin eller SEAM 3, og antallet af levende, apoptotiske og døde celler blev kvantificeret under anvendelse af et flowcytometrisk assay der målte udseendet af phosphatidylserin på celleoverfladen gennem annexin V binding og DNA-indhold ved propidiumiodidfarvning. Som vist i figur 7B, behandling med SEAM 3 eller staurosporin steg procentdelen af ​​apoptotiske og døde celler efter 12 timer og 24 timer sammenlignet med de IgG2b og DMSO kontrol hhv. Resultaterne for Jurkat-celler inkuberet med 10 pg /ml SEAM 3 svarede til dem vist for SK-MEL 28-celler i figur 7B (data ikke vist).

Discussion

vides kun lidt om ekspressionen af ​​de-N-acetyl sialinsyreholdige antigener i normale eller syge humane væv. Undersøgelser offentliggjort til dato har præsenteret evidens for ekspression af gangliosiderne GM3 og GD3 indeholder Neu i nogle cancer cellelinjer og Neu-holdige GD3 i primære humane melanom tumorer [23], [24], [26]. Vores laboratorium har vist, at NmB stammer og protozoparasitten

Leishmania store

udtrykker NeuPSA [19], [20], [38], [39], som ikke tidligere er blevet beskrevet for enhver organisme. [40].