PLoS ONE: fritagelse for Invasiv, Cancer Stem-Like glioblastoma Xenografter Brug Lentiviral Vector-medieret Selvmord Gene Therapy

Abstrakt

Baggrund

Glioblastoma er den hyppigste og mest ondartede primær hjernetumor med en dårlig prognose. Oversættelsen af ​​terapeutiske strategier for glioblastom fra forsøgsfasen ind på klinikken har været begrænset af utilstrækkelige dyremodeller, som mangler vigtige elementer i humane tumorer. Lentiviral genterapi er en attraktiv terapeutisk mulighed for menneskelig glioblastom, som vi valideret i et klinisk relevant dyremodel.

Metode /vigtigste resultater

Vi brugte en gnaver xenograftmodel der rekapitulerer den invasive og angiogene funktioner i humant glioblastom at analysere transduktion mønster og terapeutiske effektivitet af lentivirale pseudotype vektorer. Både lymfatisk choriomeningitisvirus glycoprotein (LCMV-GP) og vesikulær stomatitis-virus glycoprotein (VSV-G) pseudotype lentivirusvektorer meget effektivt transducerede humane glioblastom celler

in vitro

og

in vivo

. I modsætning hertil pseudotype gammaretroviral vektorer, der ligner dem evalueret for klinisk terapi af glioblastom viste ineffektiv genoverførsel

in vitro

in vivo

. Både pseudotype lentivirusvektorer transducerede cancer stamceller-lignende celler karakteriseret ved deres CD133-, nestin- og SOX2-ekspression, evnen til at danne sfæroider i neural stamcelle medium og udtrykke astrocytiske og neuronal differentiering markører under serum betingelser. I en terapeutisk tilgang med selvmord gen herpes simplex virus thymidinkinase (HSV-1

-tk

) fusioneret til eGFP begge lentivirusvektorer formidlede en komplet remission af solide tumorer, som ses på MR resulterer i en meget signifikant overlevelse benefit (p 0,001) sammenlignet med kontrolgrupper. I alle tilbagevendende tumorer, overlevende eGFP-positive tumorceller blev fundet, anbefale prodrug ansøgning for flere cykler for at selv forbedre og forlænge den terapeutiske effekt.

Konklusioner /Betydning

Som konklusion, lentivirale pseudotype vektorer er lovende kandidater til genterapi af gliom hos patienter. Den ineffektive gen-levering af gammaretroviral vektorer er i overensstemmelse med de opnåede resultater i klinisk terapi for GBM og dermed bekræfter høj reproducerbarhed af den invasive gliom dyremodel for translationel forskning

Henvisning:. Huszthy PC, Giroglou T, Tsinkalovsky O, Euskirchen P, Skaftnesmo KO, Bjerkvig R, et al. (2009) fritagelse for invasive, Cancer Stem-Like glioblastoma Xenografter Brug Lentiviral Vector-medieret Selvmord Gene Therapy. PLoS ONE 4 (7): e6314. doi: 10,1371 /journal.pone.0006314

Redaktør: Chris Jones, Institut for Cancer Research, England

Modtaget: Marts 9, 2009; Accepteret: 23 juni 2009; Udgivet: 20 Jul 2009

Copyright: © 2009 Huszthy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Rådet for Norge (bevilge 186.492 til HM) Forskning, det norske Cancer Society, Helse Vest, Haukeland Universitetshospital, Bergen Translationel forskning, Europa-Kommissionens 6. rammeprogram (Contract 504.743) og af Koeln Fortune Program på universitetet i Köln (tilskud 28/2006 til HM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glioblastoma er den hyppigste og mest ondartede primære hjernesvulst. Trods fremskridt i neurokirurgi, stråling og kemoterapi, prognosen for patienter forbliver fattige med en median overlevelse på 14 måneder [1].

En væsentlig ulempe i translationel hjernekræft forskning har været manglen på egnede dyremodeller. Syngeneic- eller xenotransplantattumorer baseret på glioblastom cellelinjer dyrket som monolag vokse som afgrænset og yderst angiogene læsioner

in vivo

[2], mangler de invasive tumorceller, som udgør et vigtigt element i den menneskelige glioblastom. De invasive celler migrere væk fra den første tumormasse og kan forårsage tilbagevendende tumorer i forskellige regioner af hjernen. Således er disse celler udgør en stor terapeutisk mål.

En nyligt etableret model, hvor glioblastoma biopsi-baserede sfæroider er serielt passeret i hjernerne hos nøgne rotter viser stærkt invasive og angiogene egenskaber [3]. Derfor er denne model velegnet til undersøgelse af nye terapeutiske strategier. Alligevel rapporter ved hjælp af denne eller andre klinisk relevante modeller for eksperimentel terapi er knappe. For nylig har vi analyseret det terapeutiske potentiale af HSV-1-baserede onkolytiske Herpes vektor G207 i biopsi klumpformet-baserede GBM model. Tumorvolumenet i behandlede dyr var reduceret sammenlignet med kontrolgrupper, men der var ingen signifikant overlevelsesfordel [4]. Derimod samme behandling var mere effektiv i en celle linje-baseret dyremodel [5] og som følge heraf i øjeblikket undersøges i et fase I klinisk /II undersøgelse [6]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi den invasive xenograft model til evaluering transduktion og terapeutiske virkning lentivirale pseudotype vektorer.

Gammaretroviral vektorer afledt fra Moloney leukæmivirus (MMLV) har været de mest anvendte retrovira til genterapi af hjernetumorer [7] – [10]. Trods lovende resultater i dyremodeller, kliniske forsøg med retrovirale vektor supernatanter eller retrovirale pakkeceller er mislykkedes [11] – [13]. En væsentlig ulempe ved gammaretroviral vektorer er den eksklusive transduktion af delende celler, eftersom i humane gliomer, at flertallet af tumorceller ikke dele inden for en given vindue behandling. Derfor, for at lentivirusvektorer med deres evne også transducere ikke-delende celler er attraktive kandidater til behandling af kræft i hjernen. I tidligere undersøgelser har vi udviklet gammaretroviral og lentivirusvektorer pseudotypet med glycoproteiner (GP) af lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV) [14], [15]. Disse vektorer har et bredt værtsområde og kan koncentreres ved ultracentrifugering for

in vivo

applikationer. Desuden er LCMV-GP ikke cytotoksisk, og kan etableres stabile rekombinante pakkecellelinier [16], [17]. For nylig viste vi, at lentivirale LCMV-GP pseudotyper leveres effektivt transgener til rottegliomceller

in vivo

, mens hjemmehørende neuroner ikke blev transduceret [18]. Desuden viste vi en betydelig terapeutisk effekt af LCMV-GP pseudotype lentivirusvektorer i cellen internetbaserede 9L rotte gliom model ved hjælp af selvmord gen HSV-1-

tk

. VSV-G lentivirale pseudotyper viste også en signifikant effekt, svarende til den i LCMV pseudotyper, som hovedsagelig blev medieret af en tilskuer-virkning af transducerede normale hjerneceller [19].

I det præsenterede arbejde viste vi, at både , VSV-G og LCMV-GP pseudotype lentivira effektivt transducerede humane gliom celler

in vitro

in vivo

, mens gammaretroviral transduktion var ineffektiv. Den genoverførsel til gliomceller var effektiv for både lentivirale pseudotype vektor typer. Det var dog mere specifik anvendelse af LCMV-GP pseudotype vektorer, som VSV-G pseudotyper også transduceret vært hjerneceller i invasive områder. Analyse af transducerede tumorceller viste, at begge lentivirusvektorer målrettet CD133-positive såvel som CD133-negative cancerceller. Desuden transducerede glioblastomaceller udtrykte stamcelle markører nestin og SOX2. Vigtigt er det, når evalueret for terapeutisk anvendelse ved hjælp HSV-1-

tk

som et transgen begge lentivirusvektorer medieret komplet tumorregression ved MR, hvilket resulterer i en meget signifikant overlevelsesfordel (p 0,001) sammenlignet med kontrolgrupperne .

Materialer og metoder

Etik Statement

indsamlingen af ​​menneskelige biopsi væv blev godkendt af den regionale komité. Håndteringen af ​​de dyr og de kirurgiske procedurer blev udført i overensstemmelse med den norske Animal Act og den lokale etiske komité har godkendt protokollen.

Cellelinjer

humane embryonale nyre cellelinje 293T (ATCC CRL-11268) og TE671-cellelinien blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og holdt i Dulbbeco modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% glutamin. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

Tissue kultur

tumorfragmenter fra patienter med glioblastom multiforme blev opnået under kirurgi. Vævsprøver blev taget fra levedygtige tumor områder, der svarede til regioner med kontrastforstærkning på præoperativ MR-scanninger. Prøverne blev overført til reagensglas indeholdende komplet vækstmedium og sfæroider blev fremstillet som tidligere beskrevet [20]. Den samme metode blev anvendt for tumor materiale passeret i nøgne rotter. Kort fortalt blev vævsprøverne hakket i -0,5 mm fragmenter og anbragt i 80 cm

2 vævskulturkolber (Nunc, Roskilde, Danmark) bund-overtrukket med 0,75% agar (Difco, Detroit, MI). Sfæroiderne blev holdt i et standard vævskultur inkubator med 5% CO

2 og 100% relativ fugtighed ved 37 ° C. Mediet blev ændret en gang om ugen. Sfæroider med diametre mellem 400 og 600 um blev udvalgt til

in vitro Salg eksperimenter og for intracerebral implantation.

Dissociation af tumorer

Tumorer blev dissocieret ved anvendelse af Neuronal Dissociation Kit (Miltenyi , Bergisch-Gladbach, Tyskland) ifølge producentens protokol

Flowcytometrisk analyse og cellesortering

Celler blev analyseret og sorteret på en MoFlo cellesorterer (Beckman Coulter, USA;. tidligere Cytomation, USA), udstyret med en sammenhængende Enterprise 621 argon-ion-laser indstillet til 488 nm (bruges ved 180 mW), og 635 nm Diode (25 mW). To ug /ml propidiumiodid – PI (Molecular Probes) blev tilsat til prøverne før flow sortering at lette døde diskrimination celle. GFP og PI var begejstrede ved 488 nm og fluorescens blev målt gennem 530/40 BP og 613/20 BP optiske filtre (alle filtre fra Omega Optical, Brattleboro, VT, USA), hhv. Dubletter blev diskrimineret ved anvendelse af en fremadrettet lysspredning (FSC) versus impulsbredde. FL3 kanal (i logaritmisk tilstand) med FSC blev brugt til at vise og gate ud PI positive /døde celler. FSC og side lysspredning (SSC) signaler blev detekteret og vist i lineær tilstand. GFP + -celler blev defineret på SSC versus FL1 (i logaritmisk funktion) punktdiagram efter udelukkelse af døde celler og nedbrudt materiale som beskrevet ovenfor.

Til analyse af CD133 ekspression celler blev farvet med allophycocyanin (APC) konjugeret monoklonalt CD133 /1 (AC133) antistoffer (Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Tyskland) ifølge producentens generelle protokol for immunfluorescensfarvning (i 10 minutter i mørke ved 4 ° C). CD133-APC blev ophidset ved 635 nm, blev fluorescens målt gennem 670/30 BP optisk filter, og levende CD133 + celler blev defineret på SSC versus FL6 (i logaritmisk tilstand) dot plot. Ikke-farvede cellesuspension blev anvendt som kontrol.

GFP + tumorceller blev sorteret i “oprense 1” mode i polypropylen rundbundede Falcon-rør (Becton Dickinson Labware Europe, Frankrig) indeholdende dyrkningsmedier, der blev placeret på is. Alikvoter fra nogle prøver i slutningen af ​​sorteringen blev fjernet analyseres igen til styring af den slags renhed, der var større end 98%.

Kultur af sorterede celler

Sorterede celler var enten dyrket i Neurobasal medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) med B27 supplement (20 pl /ml; Invitrogen), Glutamax (10 pl /ml; Invitrogen), fibroblastvækstfaktor 2 (20 ng /ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ), epidermisvækstfaktor faktor (20 ng ml; Peprotech) eller overført til DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% glutamin og dyrket på dækglas i 24 brønds plader

Immunofluorescens-farvning af sfæroider /adhærente celler

Sfæroider /adhærerende celler blev farvet med human-specifikt muse-anti-nestin antistoffer (Millipore, Billerica, MA), gede-anti-Sox2 antistoffer (R synsfelt, 3,2 cm matrix størrelse, 256 x 256, 20 skiver). Under scanning blev dyrene holdt under anæstesi med 1,5% isofluoran (Schering-Plough, Kenilworth, NJ) blandet med 50% luft og 50% O2.

Statistisk analyse

Overlevelse blev analyseret ved en log-rank test baseret på Kaplan-Meier test med SPSS software. Forskelle mellem par af grupper blev bestemt af Students

t

-test.

P

værdier 0,05 blev betragtet signifikant

Resultater

Lentiviral pseudotype vektorer effektivt transducere glioblastom sfæroider

in vitro

Menneskelig glioblastom. sphæroider afledt enten direkte fra patienten (lav generation) eller fra seriel

in vivo

passager i hjernen på nøgne rotter (høj generation), blev inficeret med lentiviral LCMV-GP (5 × 10

4 i 10 pi) eller VSV-G-pseudotype lentivirusvektorer (både 5 × 10

4 partikler i 10 pi) eller med retrovirale MLV-baserede vektorer pseudotype med LCMV-GP (1 × 10

5 partikler i 10 pi). Vektorerne blev fremstillet på samme måde for

in vitro

og

in vivo

eksperimenter (se materialer og metoder). Begge lentivirusvektorer transducerede patientens sfæroider og høj generation sfæroider meget effektivt (figur 1). I modsætning hertil retrovirale vektorer transduceret kun nogle få enkeltceller i høj generation sfæroider (figur 1) og undlod at transducere patientdata sfæroider (data ikke vist). Afslutningsvis begge lentivirusvektorer er langt mere effektive i at transducere humane glioblastom sfæroider

in vitro

end retrovirusvektorer.

humane glioblastom sfæroider afledt fra en patient biopsi eller efter seriepassage i nøgne rotter (høj generation) var smittet af lentivirusvektorer pseudotypet med LCMV-GP (5 × 10

4) eller VSV-G (5 × 10

4) eller ved retrovirusvektorer pseudotypet med LCMV-GP (1 × 10

5). Alle vektorer udtrykte markørgenet eGFP. Sfæroider blev analyseret ved konfokal mikroskopi for eGFP ekspression 7 dage efter infektion. Billeder viser eGFP (grøn), fase kontrast og en overlejring af begge. Lav gen .: sfæroider direkte afledt fra patient materiale (lav generation). Høje gen .: sfæroider afledt af serielle

in vivo

passager i rottehjernen (høj generation). Original forstørrelse 100 ×.

Lentiviral pseudotype vektorer effektivt og specifikt transducere glioblastomaceller

in vivo

For at sammenligne transduktion effektivitet lentiviral og gammaretroviral vektorer

in vivo

, vi brugte en xenograft model, der afspejler de angiogene og invasive funktioner i den menneskelige glioblastom

in situ

. Xenotransplantatet udtrykker også den neurale stamfader markør nestin og nøje rekapitulerer histologi af patientens tumor (figur 2). Vektorerne blev injiceret i midten af ​​progressivt voksende læsioner under anvendelse mikroprocessorstyret stereotaktisk infusion. De injektion koordinater blev anslået efter at have analyseret MRI-billeder for hver enkelt læsion. Injektionsvolumenet Applied var 2 × 10 pi og vektoren titer 1 × 10

7 /ml for alle vektorer. Transduktionseffektivitet blev evalueret 7 dage efter vektor-injektion. Begge lentivirale pseudotype vektorer viste meget effektiv transduktion af tumorerne (figur 3A, D). Når analyseret ved højere forstørrelse, både LCMV-GP og VSV-G pseudotype lentivirusvektorer viste effektiv transgen levering til nestin-positive tumorceller i fast (figur 3B, E) og invasive tumor områder (figur 3C, F). I modsætning hertil kun den retrovirale vektor transducerede nogle spredte tumorceller nær injektionsstedet (Figur 3 G, H). For en kvantitativ sammenligning af transduktion effektivitet mellem de to lentivirale pseudotype vektorer blev GFP-positive områder målt på histologiske slides (se materiale og metoder). Den samlede mængde af transducerede tumorvæv var 7,05 ± 3,51 mm

3 for LCMV-GP pseudotype vektorer og 4,05 ± 2,04 mm

3 for VSV-G pseudotype vektorer (figur 3I). Selv om der var en forskel i den gennemsnitlige, det ikke var statistisk signifikant (p = 0,269) som følge af høj inter forskelle (standardafvigelser)

Paraffinsnit af patientens tumor og xenograft tumor blev farvet med H E (AD) eller immunfarvet med human-specifikke anti-nestin antistoffer (E, F). Patient tumor (A) og xenograft tumor (B) viser angiogene egenskaber af human glioblastom med palisading nekrose (pil) og vaskulære prolifererer (pilespidser). Større forstørrelse af patienten (C) og xenograft tumor (D) demonstrerer lignende tumor cellemorfologi med polymorfe kerner i nærheden af ​​en tumor nekrose. Patient (E) og xenograft tumor (F) viser stærk nestin ekspression af tumorceller. Enkelt tumorcelle infiltration i den hvide substans observeres i xenograft tumor (F). Patienten biopsi blev afledt fra den faste tumor kerne. A, B, E, F: Original forstørrelse 100 ×. C, D: Original forstørrelse 200 ×

Intrakranielle gliomer blev inficeret med LCMV-GP eller VSV-G pseudotypet lentivirusvektorer eller med LCMV-GP pseudotype retrovirale vektorer, der udtrykker eGFP 3-4 uger efter klumpformet implantation. og analyseret ved fluorescens (A, D, G) eller konfokal scanning laser mikroskopi (B, C, E, F, H) 7 dage efter infektion. De konfokale billeder viser overlejring af eGFP (grøn fluorescens) og human-specifik nestin (rød fluorescens). Tumorer blev effektivt transduceret ved lentiviral LCMV-GP (A-C) og VSV-G (D-F) pseudotype vektorer, mens retrovirale vektorer kun transduceret få spredte tumorceller (G, H; pile). Transducerede gliomceller udtrykte human-specifik nestin i faststof (B, E, H) og invasive tumor områder (C, F, pile). (I) transduktionseffektivitet af lentivirale vektorer blev sammenlignet kvantitativt ved at måle mængden af ​​transduktion på histologiske snit under anvendelse af et fluorescensmikroskop og Nikon imaging software. LCMV transducerede tumorer (n = 3) viste en højere transduktion volumen end VSV transducerede tumorer (n = 3), men forskellen var ikke statistisk signifikant (p = 0,269). A, D: Original forstørrelse 40 ×. C, E, G, H: Original forstørrelse 100 ×. D, F:. Original forstørrelse 200 ×

For at analysere transduktion specificitet blev histologiske snit af invasive tumor områder farvet for rotte specifikke markører NeuN (for neuroner) og nestin (for astrocytter og stamceller). LCMV-GP pseudotype lentivirusvektorer udelukkende transducerede tumorceller i alle invasive områder (figur 4A), mens normale hjerneceller ikke blev transduceret (figur 4B, C). Også VSV-G pseudotype vektorer viste specifik transduktion af tumorceller i nogle invasive områder (figur 4D, E), men de også transduceres et par vært hjerneceller på andre sites (figur 4G, H).

Intrakraniel gliomer blev inficeret med LCMV-GP- eller VSV-G-pseudotype lentivirusvektorer udtrykker eGFP 3-4 uger efter tumorimplantation og analyseret konfokal laser scanning mikroskopi 7 dage efter infektion. Transduktion af invasive tumorceller blev analyseret efter farvning med humane-specifikke nestin antistoffer. Host neuroner og astrocytter blev mærket under anvendelse af antistoffer mod NeuN og GFAP. Invasive områder viste enkelt celle invasion af tumorceller (A-C, E, F) eller en subependymal ophobning af tumorceller (D, G, H). LCMV pseudotype vektorer specifikt transducerede invasive gliomceller (A-C). VSV-G pseudotype vektorer viste specifik transduktion af tumorceller i nogle invasive områder (D-F), men også transduktion af enkelte normale hjerneceller i andre (G, H, pile). Transducerede normale hjerneceller meste opdaget af morfologiske kriterier (flere processer), som farvning (GFAP eller NeuN) ikke altid matches med de transducerede celler. A, D: nestin farvning, forstørrelse 200 ×. B, E, G: GFAP farvning, forstørrelse 200 ×. C, F, H:. NeuN farvning, forstørrelse 200 ×

Lentiviral pseudotype vektorer transducere kræft-stilk-lignende gliom celler

For at analysere potentialet i både lentivirusvektorer at inficere kræft stamceller-lignende celler, transducerede tumorer blev enzymatisk dissocieret og CD133 ekspressionen blev målt ved flowcytometri. Begge vektorer transducerede CD133-positive og CD133-negative celler (figur 5A). Selv om der var høj inter forskelle i den del af de samlede CD133-positive tumorceller i de forskellige xenotransplantater, begge vektorer viste lignende effektivitet i at transducere CD133-positive celler, hvilket var lidt højere end den samlede del af CD133-positive celler (tabel 1) .

Intrakranielle gliomer blev inficeret med LCMV-GP eller VSV-G pseudotypet lentivirusvektorer udtrykker eGFP 3-4 uger efter tumor implantering. Tumorer blev udskåret, når store læsioner optrådte på MRI og blev enzymatisk dissocieret. Transduktionen af ​​CD133-positive celler blev målt ved flowcytometri. (A) LCMV-GP og VSV-G pseudotype vektorer transducerer CD133 positive og negative tumorceller. Fraktionen af ​​transducerede (GFP-positive celler) er lidt højere i CD133-positive celler (højre kolonne) i forhold til CD133-negative celler (midterste kolonne). GFP + -celler blev sorteret, dyrket i nærvær eller fravær af serum og analyseret ved fluorescens (B-G) eller konfokal mikroskopi (H-O). LCMV-GP (B) og VSV-G (E) transducerede celler danner sfæroider upon kultur i serumfrit neurale basalt medium suppleret med EGF og bFGF. Transducerede sfæroider udtrykker den neurale stamcelle markører nestin (C, F) og SOX2 (D, G). Transducerede celler dyrket i serumholdigt medium udtrykke stamcellemarkører nestin (H, L) og SOX2 (I, M), men også den differentieringsmarkører GFAP (J, N) og beta-tubulinIII (K, O). De billeder C, D, E, F, HO show overlay af virus-leveret transgen (eGFP, grøn) og opdaget antigen (Alexa-647, red).

GFP- positive celler fra tumorer transduceret med LCMV-GP eller VSV-G-pseudotype lentivirusvektorer blev sorteret og dyrket i neurale basalt medium suppleret med EGF og bFGF. Transducerede tumorceller fra begge vektorer var i stand til at danne sfæroider (figur 5B, E). Sfæroider udtrykte stamcellemarkører nestin og SOX2 (figur 5C, D, F, G). Sorterede celler blev også udpladet under serum betingelser. Cellerne fortsatte med at vise signifikant udtryk for stamcelle markører nestin og SOX2, men også for den differentiering markører GFAP og β-tubulinIII (figur 5H-O).

Lentiviral pseudotype vektorer der udtrykker selvmord gen HSV-1 –

tk

mægle en effektiv terapeutisk virkning

in vivo

for at evaluere den terapeutiske effekt af både lentiviral pseudotyoped vektorer i den invasive xenograft model, vektorer der udtrykker selvmord gen HSV1-

tk

fusioneret til eGFP blev injiceret i etablerede tumorer når synlig på MRI anvendelse af den samme fremgangsmåde som beskrevet for

in vivo

tropisme undersøgelse. Dyrene blev behandlet dagligt med 50 mg /kg ganciclovir i 30 dage, begyndende 7 dage efter vektor-injektion. Tumorvækst blev målt hver 7-14 dage ved MRI. Efter 4 ugers behandling, 7 af 8 dyr i både LCMV- og VSV-pseudotype behandlede grupper havde en komplet remission på MRI (figur 6). Et dyr i hver gruppe havde en stabil sygdom indtil udgangen af ​​GC behandling. Alle dyr i kontrolgrupperne udviklede store tumorer i den periode på 30 dage (figur 6) behandling. Både, LCMV- og VSV-pseudotype-behandlede dyr havde en meget signifikant overlevelse fordel (p 0,001) sammenlignet med kontrolgrupper (Figur 7A). Der var ingen statistisk signifikant forskel i overlevelse mellem de to behandlingsgrupper.

repræsentant tredimensional MRI (T2 RARE). (A, F, K, P) Lentiviral LCMV-GP vektorer med ganciclovir behandling. (B, G, L, Q) Lentiviral VSV-G vektorer med ganciclovir behandling. (C, H, M, R) Lentiviral LCMV-GP vektorer uden ganciclovir behandling. (D, I, N, S) Lentiviral VSV-G-vektorer uden ganciclovir behandling. (E, J, O, T) kun ganciclovir behandling. Tidspunkter efter tumorimplantation: (A-E) 1 dag før vektor injektion. (F-J) 1. uge ganciclovir behandling. (K-O) 2. uge ganciclovir behandling. (PT) 4. uge ganciclovir behandling.

Intrakranielle gliomer blev injiceret med LCMV-GP eller VSV-G pseudotypet lentivirusvektorer udtrykker HSV-1-

tk

fusioneret til eGFP 3 uger efter tumorimplantation. 7 dage efter vektor infektion blev dyrene i begge behandlede grupper og i én kontrolgruppe behandlet med ganciclovir i 30 dage. (A) Kaplan-Meier overlevelse kurve. Overlevelsen fordel for begge behandlingsgrupper sammenlignet med kontrolgrupper var statistisk signifikant (

P

0,001; log-rank test). Der var ingen signifikant forskel i overlevelse mellem de to behandlingsgrupper. (B-D) Repræsentant MRI (T2 RARE) af tilbagevendende tumorer i LCMV- (B, C) og VSV-behandlet (D, E) gruppe. (B) Invasiv kontralaterale gentagelse. (C) Invasiv lokale og kontralaterale gentagelse. (D) Mere omskrevne lokalt recidiv. (E) Makroskopisk billede af en rotte hjerne med en gentagelse i lillehjernen (rød cirkel), behandlet med VSV-G pseudotype vektorer og GC. (F-M) Afsnit af tilbagevendende tumorer blev farvet med antistoffer mod human-specifik nestin og analyseret ved fluorescens (F, J) eller konfokal mikroskopi (G-I, K-M).