PLoS ONE: Optimeret Pre-analytiske metoder Forbedre KRAS Mutation Detection i cirkulerende tumor DNA (ctDNA) fra patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC)

Abstrakt

Introduktion

Ikke -invasive mutation test ved brug cirkulerende tumor DNA (ctDNA) er en attraktiv forudsætning. Dette kunne gøre det muligt for patienter uden tilgængelig tumor prøve at få adgang til flere behandlingsmuligheder

Materialer Metoder

Perifert blod og matchede tumorer blev analyseret fra 45 NSCLC-patienter. Vi undersøgte effekten af ​​præ-analytiske variabler på DNA udbytte og /eller

KRAS

mutation afsløring:. Prøvetagning rør type, inkubationstid, centrifugering trin, plasma input volumen og DNA udvinding kits

Resultater

2 timer inkubationstid og dobbelt plasma centrifugering (2000 xg) reducerede samlet DNA udbytte medfører, lavere niveauer af forurenende genomisk DNA (gDNA). Reduceret “forurening” og øget

KRAS

mutation afsløring blev observeret ved hjælp af celle-fri DNA Blood Collection Tubes (cfDNA BCT) (Streck), efter 72 timer efter blodprøve forhold til EDTA-rør. Plasma-input volumen og anvendelse af forskellige DNA udvinding kits påvirket DNA udbytte.

Konklusion

Denne undersøgelse viste, at en vellykket ctDNA genopretning for mutation detektion i NSCLC er afhængig af pre-analytiske trin. Udvikling af standardiserede metoder til påvisning af

KRAS

mutationer fra ctDNA prøver anbefales at minimere virkningen af ​​præ-analytiske trin på mutation afsløring satser. Hvor hurtig prøve behandling ikke er mulig brug af cfDNA BTT rør ville være fordelagtigt

Henvisning:. Sherwood JL, Corcoran C, Brown H, Sharpe AD, Musilova M, Kohlmann A (2016) Optimeret Pre-Analytiske metoder Forbedre

KRAS

Mutation Detection i cirkulerende tumor DNA (ctDNA) fra patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). PLoS ONE 11 (2): e0150197. doi: 10,1371 /journal.pone.0150197

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: December 24, 2015; Accepteret: 10. februar, 2016 Publiceret: 26 feb 2016

Copyright: © 2016 Sherwood et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af AstraZeneca. Den bidragyder ydet støtte i form af lønninger til alle forfattere, men havde ikke nogen rolle i undersøgelsen design, indsamling eller analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne: JLS, CC, HB, AS, MM og AK er medarbejdere i og ejer aktier i AstraZeneca, hvis selskab finansierede denne undersøgelse. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Behovet for nøjagtig mutation afsløring fra ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tumorvæv har etablere sig, sammen med behovet for at identificere potentielle respondenter til personlig medicin som tyrosinkinasehæmmere (TKI’er); f.eks.

EGFR

TKI’er, erlotinib, gefitinib og T790M instrueret TKI osimertinib) [1]. Imidlertid evaluerbare tumorvæv er ikke altid til rådighed for NSCLC-patienter [2]. For eksempel i den seneste Iressa Opfølgning Measure (IFUM) undersøgelse, tumor mutation status ikke var i stand til at blive bestemt i 19% af de støtteberettigede patienter [3]. I Storbritannien kun 71% af patienter med lungecancer har en histologisk bekræftelse af deres sygdom [4].

På grund af mangel på egnede vævsprøver, cirkulerende tumor DNA (ctDNA) bliver stadig vigtigere som en alternativ kilde til påvisning af handlingsrettede mutationer [5]. Der vil være en større efterspørgsel efter biomarkør test på prøver især i lungekræft, hvor mere målrettede lægemidler er i udvikling [6] såsom MEK1 /2-hæmmere; selumetinib [7], cobimetinib (GDC-0973, XL-518) og trametinib og T790M instrueret EGFR TKI’er, osimertinib (AZD9291) [8] og rociletinib (CO-1686) [9]. Mutation test af plasma tilbyder også en minimalt invasiv mulighed for at karakterisere metastatisk og /eller resistente sygdomsmekanismer, når væv eller re-biopsi eller utilgængelig.

Den kliniske anvendelighed af påvisning af TKI sensibiliserende

EGFR

mutationer i ctDNA er blevet bevist ved behandling af patienter med gefitinib [3] i NSCLC og med erlotinib i kolorektal cancer (CRC) [10]. Screening for

KRAS

mutationer i CRC og bugspytkirtelkræft hjælp ctDNA er også blevet undersøgt sammen med

BRAF

i melanom prøver [11-14]. ctDNA er typisk nedbrudt til en længde på 166 basepar, hvilket sandsynligvis skyldes de nucleolytiske processer, der forekommer under apoptose [15,16]. Der er noget der tyder på ctDNA mens i omløb har en halveringstid mellem 16 minutter [17] og omkring 2 timer [18,19], men med betydelig variation mellem sager. Dette skyldes sandsynligvis blod båret nukleaseaktivitet som nedbryder fragmenterne [20] i 10 basepar intervaller [18], og leveren rydder også fragmenter fra kredsløbet [21]. Påvisning af mutationer i ctDNA er vanskelig på grund af den lave mængde mutante alleler i en baggrund af vildtype-DNA. Det er til stede i meget lave niveauer ( 1%) [22], og kan variere fra patient til patient som følge af komplekse biologiske processer, såsom genamplifikation set med

EGFR

[23]. Følsomme metoder er absolut nødvendigt at give pålidelige resultater. Pre-analytiske variabler såsom perifert blod indsamling, behandling, forsendelse og opbevaring metoder kan påvirke afsløring satser.

I øjeblikket tumor væv forbliver den anbefalede guldstandarden prøvetype på grund af den relativt lave opdagelse sats i ctDNA sammenlignet med tumor væv [3,24]. Påvisning af ctDNA spænder fra 62% til 65,7% sensitivitet for

EGFR

mutationer i NSCLC [3,25], og fra 25% til 41% sensitivitet for

KRAS

mutationer i CRC [26,27 ].

En af de største udfordringer i detektering af handlingsrettede mutationer i ctDNA er ustabiliteten af ​​hvide blodlegemer efter samling. Hvide blodlegemer nedbrydes efter blodudtagning, fører til en stigning i gDNA (genomisk DNA) [28,29]. Den øgede forekomst af normale bystander gDNA udvander tumorafledte ctDNA hvilket gør det vanskeligere at opdage handlingsrettede mutationer [30] og kræver, at teknikker mere følsomme end dem, der anvendes til mutation påvisning i vævsprøver anvendes. Tidligere undersøgelser har undersøgt brugen af ​​forbedring metoder, men i begrænset antal prøven [30-32]. Aktuelle anbefalinger til vurdering ctDNA omfatter: plasma frem for serumprøver, brug af EDTA eller cellefrie DNA indsamling rør med forarbejdning i 4 timer, dobbelt centrifugering og ikke mere end tre fryse tø cyklusser af plasmaprøver [31]

formålet med denne undersøgelse var at undersøge forskellige metoder for at forbedre mutationsdetektion i ctDNA fra en standard 10 ml patient blodprøve. Vi undersøgte specifikt anvendelsen af ​​forskellige blodopsamlingsrør. Brug plasma fra 45 NSCLC patienter med matchende tumorblokke vi vurderede også indvirkningen på DNA udbytte og /eller

KRAS

detektering under følgende betingelser: 1) inkubationstid ved stuetemperatur før plasma isolation; 2) enkelt eller dobbelt centrifugering; 3) plasma input volumen og 4) diverse DNA ekstraktion kits.

Materialer og metoder

Etik Statement

Etik godkendelse udvalg ikke var påkrævet i tilfælde af denne specifikke arbejde som prøverne blev indsamlet kommercielt fra Manchester Cancer Research Centre (FRK) Biobank, UK eller Asterand Bioscience Royston, UK, som har generisk etik godkendelse: https://www.asterandbio.com/company/ethics/. Fuld skriftligt informeret samtykke blev opnået for alle prøver, der anvendes i denne undersøgelse

FRK Biobank er licenseret af humant væv Authority (licensnummer: 30004) den. Og er blevet etisk godkendt som forskning vævsbank af South Manchester Forskning etiske komité (Ref: 07 /H1003 /161 + 5). En suite af standard Patient datablade samt Patient samtykkeformularer er blevet udviklet og godkendt, og vil altid indhentes informeret patient samtykke, før patientprøver er taget. Den Biobank holder hvad der er kendt som generiske etik godkendelse

Dette giver godkendelse til alle, der bruger prøver fra FRK Biobank, så forskerne ikke behøver at få deres egen etisk godkendelse til relevante projekter ved hjælp Biobank prøver:. Http: //www.mcrc.manchester.ac.uk/Biobank/Ethics-and-Licensing.

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen (1964, ændret i 1975, 1983, 1989, 1996 og 2000 ) af World Medical Association og alle patientprøver indsendt til analyse blev gjort med fuld informeret samtykke af patienterne.

alle kliniske data og prøver blev modtaget anonymt.

patienter

To samlinger af NSCLC prøver bestående af formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv og matches plasma blev anvendt i denne undersøgelse (figur 1). Til vurderingen af ​​forskellige stabilisering plasma metoder, en samling af matchet plasma og FFPE væv vægtet til kaukasiske patienter med adenocarcinom og med en rygning historie blev brugt (n = 20; FRK Biobank samarbejde NHS Trusts). Matchet plasma og FFPE væv blev brugt til at sammenligne forskellige mængder plasma (n = 15; Asterand Bioscience, Royston, UK) og sammenligne forskellige plasma DNA-ekstraktion kits (n = 10; Asterand Bioscience)

Diagram. eksperimentel arbejdsgang for de forskellige prøve årgange. Panel A. Sammenligning af Streck Cell Gratis (BCT) og EDTA-rør i tillæg til enkelt og dobbelt centrifugering på DNA udbytte og mutation afsløring. B. Sammenligning af forskellige plasma volumen og ctDNA udvinding kits på DNA udbytte og mutation afsløring.

Blood indsamling, plasma isolation og opbevaring

Til vurderingen af ​​forskellige stabilisering plasma metoder, 10 ml perifert blod blev opsamlet i et EDTA-blodopsamlingsrør (Vacutainer K2EDTA) (Becton, Dickinson, Oxford, UK) og 10 ml i et cellefrit DNA ™ BTT (cfDNA BCT) (Streck, Omaha, NE) for 20 patienter, i henhold til brugsanvisningen (invertere 10 gange). Hver 10 ml volumen blev derefter opdelt i 2 x 5 ml portioner og derefter inkuberet ved stuetemperatur i enten 2 timer eller 72 timer. Plasma blev derefter isoleret fra blodprøven ved at udføre en 2000 x g centrifugering i 10 minutter og omhyggeligt fjerne plasmaet. Den fjernede plasma blev derefter centrifugeret igen ved 2000 x g i 10 min før fjernelse af supernatanten plasma til ctDNA ekstraktion. Til 5 af de 20 patienter yderligere 10 ml blodprøve blev opsamlet i et EDTA-rør og opdelt i 2 x 5 ml volumener. Blodet blev derefter inkuberet ved stuetemperatur i enten 2 timer eller 72 timer før et ensomt centrifuge centrifugering ved 2000 x g for at isolere plasma (Fig 1A). For langtidsopbevaring, var alle plasma opbevaret ved -80 ° C i 1 ml prøver før DNA-ekstraktion.

Til sammenligning af forskellige plasma mængder og forskellige DNA ekstraktion kits, blev blod opsamlet i EDTA-rør og centrifugeres én gang i 10 minutter ved 1300 x g. Plasma blev høstet i 1 ml prøver og opbevaret ved -80 ° C inden for 1 time af blodprøvetagning. Alikvoter fra den samme patient blev tøet på is og puljet per patient at generere 6 ml totalt. Samlet plasma blev derefter blandet grundigt og dispenseret i 1, 2 og 3 ml volumener til sammenligningen undersøgelse plasmavolumen (n = 15), og 3 x 2 ml portioner til DNA-ekstraktion kit sammenligning undersøgelse (n = 10) (Fig 1B) . Alle plasmaprøver blev derefter nedfrosset ved -80 ° C.

Alle væv samlinger blev udført samtidig selv dem, indsamlet af Asterand Bioscience blev gennemført under de begrænsninger af tilgængeligheden af ​​de matchede prøvesæt, derfor nogle indsamling parametre var ikke ideel for cfDNA fx samling med et centrifugering skridt som ovenfor.

DNA-ekstraktion fra plasma

Til sammenligning af stabilisering blod og plasma volumen QIAamp cirkulerende Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) blev anvendt. Derudover blev en sammenligning af tre DNA-ekstraktion kits udført på lige volumener af plasma (2 ml hver) (fig 1B). De følgende kits blev anvendt: PME frit cirkulerende DNA Extraction Kit protokol (Analytik Jena, Jena, Tyskland) i 2-5 ml ekstraktioner hjælp lysis løsning GS /Bindende løsning VL-system og DSP Virus /Pathogen Midi Kit udført på QIAsymphony (Qiagen) og QIAamp Cirkulerende Nucleic Acid Kit (QIAGEN). QIAsymphony ekstraktioner blev udført på Qiagen applikationer lab (Hilden). Alle plasmaprøver blev forarbejdet i overensstemmelse med producentens protokoller med undtagelse af PME kit, hvor en indledende 20 minutters inkubation i stedet for 10 min blev udført, og plasma centrifugeringstrin blev udført ved 3750 x g vs 4500 x g. Alle DNA blev elueret i 80 pi inden for det område, kittet.

DNA ekstraktion fra FFPE væv

DNA blev ekstraheret fra 2 x 5 um nyslået FFPE vævssnit ifølge producentens protokol under anvendelse af QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) og elueret i 100 pi puffer.

DNA kvantificering

All eluerede DNA blev blandet grundigt (vortexes) før målingen ved kvantitativ PCR (qPCR ), som blev udført under anvendelse af ABI TaqMan® RNase P Detection Reagents Kit og TaqMan® Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) på en Quantstudio Dx instrument (Life Technologies, CA. USA). Reaktioner blev fremstillet ved anvendelse af 10 pi af Master Mix, 1 pi Assay Mix, 5 pi af DNA og 4 pi nuklease frit vand (Qiagen, Hilden, Tyskland). Cyklingsbetingelser var 95 ° C i 10 minutter, derefter 94 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minut cykluser 40x. En serie på 10 serielle fortyndinger af human genomisk DNA (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) fra 100 ng /pi til 0,195 ng /pl blev anvendt i duplikat til frembringelse af standardkurven. Den amplikonstørrelse af RNase P-analysen var 87 basepar, hvilket er passende til brug på ctDNA.

KRAS

test

KRAS

mutation status blev karakteriseret fra FFPE vævsafledt DNA under anvendelse af

TheraScreen KRAS Salg RGQ PCR-kittet (Qiagen) ifølge producentens protokol. Den TheraScreen kit beskæftiger forstærkning ildfast mutation systemet (ARMS) PCR-teknologi kombineret med Scorpions afsløring teknologi [33]. Mutationen status for en given prøve er etableret ved sammenligning af den specifikke

KRAS

mutation assay mod en kontrol assay i

KRAS

exon 4 til at generere en ændring i cyklus Threshold (ACt). Den ACt er resultatet af at trække kontrol CT fra mutation assay CT. Den ACt sammenlignes derefter med de validerede afskåret kriterier for ACt for at fastslå mutation status.

KRAS

mutation detektion blev udført på samme måde på ctDNA prøver fra patienter med

KRAS

mutationer fundet i den matchende FFPE vævsafledt DNA. Prøver behandles af forskellige præ-analytiske metoder blev analyseret i samme RotorGeneQ (RGQ) løb. Plasmaprøver blev kun vurderet for de kendte

KRAS

mutation som opnået i den matchede væv.

Statistisk analyse

blev udført Statistisk analyse ved hjælp parret Students

t

-test i Microsoft Excel, hvor p 0,05 blev anset for signifikant. Lineær regressionsanalyse og beregningen af ​​R

2 blev udført på GraphPad Prism (Version 6.01) og p-værdier blev beregnet på grundlag af afvigelse fra nul. Grafer blev genereret i GraphPad Prism.

Resultater

Kvantificering af DNA efter forskellige plasma behandling trin

For at forstå, om metoderne til plasma behandling kan påvirke niveauet af forurenende gDNA stede vi opsamlede blod fra 20 NSCLC-patienter og behandles plasmaet under forskellige betingelser (fig 1A og figur 2). EDTA opsamlingsrør og længere inkubationstid var signifikant (p 0,01) forbundet med øget DNA udbytte, middelværdi ± SD: EDTA rør /2 timers inkubation (2,49 ± 1,60 ng /pl) versus EDTA rør /72 timers inkubation (15.12 ± 16,44 ng /pl) (fig 2A). En lav men signifikant (p 0,01) stigning i DNA udbyttet blev også observeret med celle-fri DNA Blood Collection rør (cfDNA BTT) på 72 timer (3,31 ± 1,82 ng /uL) i forhold til cfDNA BCT /2 time (2,39 ± 1,42 ng /pl) (fig 2B). Der var ingen signifikant forskel i total DNA udbytter observeret når plasma blev behandlet inden 2 timer under anvendelse af enten rør-type (Fig 2C). DNA Udbyttet fra plasma behandlet efter 72 timer ved hjælp cfDNA BTT rør var signifikant (p 0,01) lavere end plasma behandles ved hjælp af EDTA-rør (Fig 2D) “

Fuldblod blev indsamlet fra 20 NSCLC patienter og behandles med. forskellige rørtyper, inkubationstider og centrifugeringstrin en undergruppe af disse patienter (n = 5) havde fuldblod behandlet til vurdering af en enkelt vs. dobbelt centrifugeringstrin DNA blev målt ved anvendelse af ABI TaqMan® RNase P Detection Reagent Kit a:.. Blood blev indsamlet ved brug EDTA-blod opsamlingsrør (EDTA) og forarbejdet efter 2 timer eller 72 timer B:. blod blev opsamlet under anvendelse af cellefri DNA blodopsamlingsrør (cfDNA BCT) og forarbejdet efter 2 timer eller 72 timer C:. blod blev opsamlet under anvendelse af EDTA eller cfDNA BTT rør og behandles efter 2 timer D:. Blod blev indsamlet ved brug EDTA eller cfDNA BTT rør og behandles efter 72 timer E:. Blod opsamles i EDTA-rør efter 2 timer inkubation og behandles ved hjælp af enten enkelt eller dobbelt centrifugering F.: blod opsamlet i EDTA-rør efter 72 timers inkubation og behandles med enten enkelt eller dobbelt centrifugering. Resultaterne vises for hver patient. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en parret t-test, hvor; ** P. 0,01

En undergruppe af disse patientprøver (n = 5) blev yderligere vurderet for påvirkning af en enkelt eller en dobbelt centrifugering skridt på DNA-udbytter (Fig 2E og 2F). Når behandlet inden 2 timer, centrifugering plasma prøver to gange ikke havde en signifikant effekt på DNA udbytte i forhold til enkelt træk (fig 2E). Men når de behandles efter 72 timer, en dobbelt centrifugering skridt resulterede i nedsat betyde DNA udbytte (19,35 ± 24,3 ng /uL) i forhold til enkelt centrifugering behandling (35,47 ± 32,1 ng /uL). En reduktion i udbytte blev observeret i 4 ud af de 5 analyserede prøver (Fig 2F) men dette ikke var statistisk signifikant (p = 0,058). Tilsammen viser disse resultater, at de niveauer for DNA udbytter kan variere afhængigt af den metode, som plasma behandles med ikke-optimale metoder.

KRAS

mutation afsløring efter forskellige plasma behandlingstrin

Anvendelse af de forskellige plasma forarbejdningsmetoder blev også undersøgt for

KRAS

mutation afsløring i 20 patientprøver (fig 1A). Forud for udførelse af

KRAS

mutationspåvisning på enhver plasma afledt DNA, blev den tilsvarende matchet FFPE væv screenet ved hjælp af

TheraScreen KRAS

RGQ PCR kit til at identificere patienter med mutation positive tumorer (n = 10 /20; data ikke vist). I denne kohorte, 50% (n = 5) havde

KRAS

mutationer identificeret i matchede plasma forarbejdet i cfDNA BTT indsamling rør inden 2 timer og 40% (n = 4) på ​​72 timer. Men denne opdagelse faldt, når der sammenlignes med en betragtes som ikke-optimale metode, fx EDTA opsamlingsrør efter 2 timer, 40% (n = 4) af mutationer blev påvist faldt til 20% (n = 2) efter 72 timer (tabel 1) i de samme prøver. Individuelle (CT) værdier, alt amplificerbart KRAS DNA (KRAS kontrol) og ACt-værdier for alle 10 plasmaprøver er vist i S1 tabel. Det skal bemærkes, at

KRAS

mutation status blev etableret ved hjælp af Qiagen TheraScreen

KRAS

RGQ PCR håndbog, ACt afskåret Værdierne går 6,6-8 for de påviste mutationer. På grund af det lave antal prøver med

KRAS

mutationer, der var påvises i ctDNA, er det ikke muligt at vedhæfte statistisk signifikans.

Samlet amplificerbart

KRAS

DNA (

KRAS

kontrol) påvisning i alle prøver viste en lignende tendens som observeret for DNA udbytte (qPCR) i figur 2 (S1 tabel). Et fald i CT-værdi blev demonstreret for ikke-optimale metoder indikerer større kontaminerende DNA-koncentration; middelværdi CT ± SD: EDTA rør /2 hr inkubation (29,0 ± 1,0), EDTA rør /72 timer inkubation (25,5 ± 1,5), cfDNA BCT /2 hr inkubation (29,4 ± 1,1), og cfDNA BCT /72 timers inkubation (28,5 ± 1,0) henholdsvis (S1 tabel). Disse resultater viser, at både

KRAS

mutation afsløring og også total amplificerbart

KRAS

DNA kan påvirkes afhængigt af metoden af ​​plasma behandling anvendes.

Kvantificering af DNA efter forskellige plasma input

Som forventet blev en betydelig stigning i DNA udbytte observeret med stigende prøvevolumen (p 0,01) fra 15 patienter (Fig 3). En stigning i udbytte vil øge koncentrationen og de absolutte kopi antal ctDNA rådighed til analyse og dermed gøre mutationspåvisning mere sandsynligt. Den gennemsnitlige DNA udbytte ud fra 3 ml plasma var 4,39 ± 4,55 ng /pl sammenlignet med 3,03 ± 3,24 ng /pl (2 ml plasma) og 1,79 ± 1,81 ng /pl (1 ml plasma). Ud fra disse 15 patienter, syv havde

KRAS

mutationer i tilsvarende matchet væv I denne kohorte, en patient (nummer 23) havde en påviselige

KRAS

mutation i plasma for alle tre bind de resterende patientprøver have ACt værdier uden for afbrød kriterier for test (S2 tabel). Dette kan skyldes denne særlige samling af matchede plasmaprøver blive trukket ind i almindelige EDTA-rør, med kun et enkelt træk afspejler den sædvanlige opdagelse sats, der opstår i ikke-optimale metoder [34]. Endvidere disse specifikke prøver blev primært afledt af trin I eller II NSCLC (13/20), som kunne indeholde lavere niveauer af ctDNA fra tumoren [35]. Interessant,

KRAS

forstærkning kontrol viste en lignende tendens til DNA udbytte (qPCR) i figur 2. Sænk betyder CT værdier for

KRAS

kontrol blev observeret med øget plasmavolumen. De lavere Ct-værdier viste en signifikant stigning (p 0,001) i

KRAS

kontrol detektion (middelværdi CT ± SD) i 3 ml plasma (26,5 ± 1,7) sammenlignet med 2 ml plasma (27,1 ± 1,8) og 1 ml plasma (28,1 ± 1,7) prøver (S2 tabel). Disse data viser, at varieret input plasmavolumen kan påvirke DNA udbytte og total amplificerbart

KRAS

. For

KRAS

mutationsdetektion imidlertid et større kohorte af påviselige mutantprøverne kræves til yderligere analyse.

Tre volumener plasma (1 ml, 2 ml og 3 ml) blev behandlet fra hver prøve i en kohorte af 15 NSCLC-patienter. DNA blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp CNA Kit og blev målt ved qPCR anvendelse af ABI TaqMan® RNase P Detection Reagent Kit. Resultaterne vises for hver patient. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en parret t-test, hvor; ** P. 0,01

Mens nogen konklusion kan foretages fra en enkelt prøve, alle prøver steg i DNA udbytte som forventet. De øgede antal af

KRAS

amplificerbare DNA-kopier opnået ved ekstraktion af flere plasma, kunne påvirke opdagelse sats i disse prøver, hvis mere følsomme metoder, f.eks digital PCR blev anvendt.

DNA ekstraktion kit sammenligning

Lige store volumener (2 ml) af plasma fra 10 patienter blev underkastet DNA-ekstraktion ved anvendelse af tre forskellige metoder. Alle tre metoder demonstrerede vellykket ekstraktion af DNA (figur 4) med Qiagens QIAamp Cirkulerende Nucleic Acid kit giver den højeste DNA udbytte, dvs. middelværdi ± standardafvigelse (3,03 ± 2.19ng /pl) sammenlignet med Analytisk Jena s PME frit cirkulerende DNA Extraction Kit Protocol ( 0,83 ± 0.88ng /uL; p 0,001) og sammenlignet med Qiagen s DSP virus /Pathogen Midi Kit udført på QIAsymphony (0,53 ± 0.53ng /uL; p 0,01). De manuelle kits er enkel at bruge og velegnet til små til mellemstore seriestørrelser mens QIAsymphony kræver særlig uddannelse, men er mere egnet til high throughput og kontinuerlig behandling.

Lige dele af plasma (2 ml) fra 10 NSCLC patienter blev bearbejdet under anvendelse af tre forskellige DNA-ekstraktionsmetoder: QIAamp Cirkulerende Nucleic Acid Kit (Qiagen CNA Kit); PME frit cirkulerende DNA Extraction Kit (Analytik Jena) og DSP Virus /Pathogen Midi Kit udført på QIAsymphony (QIAsymphony). DNA blev målt ved qPCR anvendelse af ABI TaqMan® RNase P Detection Reagent Kit. Resultaterne vises for hver patient. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en parret t-test, hvor; ** P 0,01, *** p 0,001

Diskussion

Personlig terapi i kræft ofte stoler på test for DNA-mutationer ved hjælp af en kammerat diagnostisk assay til at identificere patienter, der vil. mere sandsynligt svare målrettede behandlinger. På nuværende de mest almindeligt anvendte model til påvisning af handlingsrettede DNA mutation ændringer er tumorvæv, typisk FFPE væv. Men en vævsprøve er ikke altid tilgængelig [3] enten på grund af udtynding af den diagnostiske blokken for andre molekylære patologi undersøgelser eller fordi patienten er aldrig blevet biopsi for andre kliniske årsager. Hvor væv tilgængelighed er et spørgsmål omhyggeligt valg af meget parallelle diagnostiske platforme såsom Next Generation Sequencing (NGS) eller Matrix Assisted Laser desorption /Ionisering Time of Flight (MALDI-TOF), kan forsinke nedbrydningen af ​​blokken [36].

Flydende biopsier (f.eks plasma) et alternativ, tidsmæssige og mindre invasive mulighed for præcis mutation test. Tidligere undersøgelser har vist at mutation test af ctDNA har høj specificitet ( 95%), men følsomheden er lavere (60%) sammenlignet med væv [3,37]. Det meste af den dokumentation i NSCLC til dato vedrører

EGFR

test. Nogle undersøgelser har undersøgt

KRAS

mutationer fra ctDNA i kolorektal cancer patienter [12,26,34].

Teknologier og metoder, som kan forbedre isoleringen af ​​ctDNA og reducere vildtype DNA-kontaminering er nye [31]: undgå heparin rør [38], brug af plasma i stedet for serum [39] og undgåelse af indefrysning prøver [28]. Disse omfatter trinvise ændringer i plasma behandling for eksempel centrifugeringstrin (hastighed og antallet af spins) [40] og mere sofistikerede forbedringer såsom en specialiseret indsamling rør, dvs. celle fri DNA blodopsamlingsrør der stabiliserer de hvide celler i blodet [30, 32]. Selvom den potentielle kliniske anvendelighed af

KRAS

mutation afsløring fra plasma er også blevet undersøgt [41] i NSCLC, effekten af ​​disse behandlinger ændringer på

KRAS

mutation afsløring i NSCLC har endnu ikke været specielt undersøgt.

Formålet med denne undersøgelse var at identificere optimale præ-analytiske behandlingstrin at opnå ctDNA fra plasma fra patienter med lungecancer. I denne undersøgelse målte vi effekten af ​​disse trin på DNA-udbytter og

KRAS

mutation afsløring satser.

Kvantitativ PCR (qPCR) blev anset for at være den mest hensigtsmæssige DNA kvantificering metoden som det kendetegner amplificerbart DNA-molekyler kun [28]. Den anvendte metode anvendt en 87 basepar amplicon, som ville forstærke ctDNA som typisk nedbrydes til 166 basepar (40). Det skal dog bemærkes, at anvendelsen af ​​andre metoder er passende, når der anvendes som en del af en tidligere valideret metode.

Cirkulerende DNA eksisterer naturligt, men er ofte forhøjet hos cancerpatienter [19]. Mængden af ​​ctDNA i en prøve varierer afhængig af sygdom indstilling og fase [35]. Påvisning af mutationer fra ctDNA er stærkt afhængig af stabiliteten af ​​prøven. Der har været en fremkomsten af ​​alternative blodopsamlingsrør der stabiliserer blodlegemer, f.eks CellSave Konserveringsmiddel Tubes (Cell Søg, South Ritan, NJ, USA) og cfDNA BCT (Streck). I denne undersøgelse, vi fokuserede på vurderingen af ​​cfDNA BTT rør, fordi disse var den eneste kommercielt tilgængelige produkt specielt designet til at stabilisere blod for ctDNA vurdering. Den stabiliserende opløsning indeholdt i cfDNA BCT rør ikke påvirker nedstrøms molekylær analyse ved PCR [42], som vi også observeret i denne undersøgelse. Tidligere undersøgelser har vist, at cfDNA BCT rør bevare blod muliggør påvisning af cirkulerende frit DNA under anvendelse af plasma fra raske donorer [30,32] eller plasma tilsat cancerceller [43]. Men til vores bedste overbevisning er der ingen undersøgelser, der har brugt disse rør til at vurdere DNA udbytte og specifikke mutationer i plasma fra NSCLC patienter.

Vi her vist, at ved brug af forskellige forarbejdningsmetoder, såsom en 72 timer inkubation inden forarbejdning, cfDNA BTT rør var bedre til at stabilisere blod i forhold til EDTA indsamling rør set ud fra en reduktion i DNA-udbytter. Derfor bør det ved øjeblikkelig behandling ( 2 timer) af plasma ikke er mulig, cfDNA BCT rør udgør et bedre alternativ til standard EDTA opsamlingsrør. Dette er især vigtigt i en klinisk miljø, hvor blodet opsamles men kan ikke umiddelbart skal kunne behandles

Det er blevet rapporteret, at en første langsom centrifugering ( 1.600 xg i 10 minutter). Efterfulgt af en anden centrifugering, ved høj hastighed ( 16.000 x g i 10 minutter) er nødvendig til isolering af cellefri plasma [40,44], som det ses ved et fald i DNA-udbytte. Vigtigere, tyder kliniske laboratorier ikke altid har mulighed for at udføre en hurtigere anden centrifugering. Vores undersøgelse bekræftede, at gDNA kontaminering var lavere fra plasma isoleret med en dobbelt centrifugering sammenlignet med en enkelt centrifugering understøtter tidligere observationer. Under disse omstændigheder anbefales det, at en anden centrifugering ved lavere hastighed er mere effektive til at fjerne celler end en enkelt centrifugering [45]. Desuden øger plasmavolumen øget DNA udbytte og sænkede

KRAS

kontrol som forventet [45].

Der er en række DNA-ekstraktion muligheder, der kan anvendes til ctDNA analyse fra plasma eller serum (S3 tabel). Vi valgte at sammenligne tre metoder, som alle er specielt designet til ekstraktion af cirkulerende DNA, som gjorde det muligt at anvende 2 ml input plasma. Vi valgte en automatiseret metode (QIAsymphony), en almindeligt anvendt metode (QIAamp CNA kit) og en mindre dokumenteret metode (Analytik Jena). Mens vi observeret, at metoder gav tilstrækkelig DNA for downstream ansøgning dog udbytterne afveg betydeligt fra analyserne. De forskellige udbytter som målt ved qPCR kan skyldes isolering af fragmenter af forskellig størrelsesfordeling på grund af størrelseseksklusion af nukleinsyrer i en given kit. På grund af variationen i udførelsen af ​​kommercielle kits, bør en valideret metode bruges, når man analyserer kliniske prøver. Derfor bør overvejes nøje, når de vælger en optimal ctDNA ekstraktion metode.

Som konklusion, selv om individuelt nogle optimering trin havde en beskeden effekt i denne undersøgelse, ophobning af flere ændringer i sidste ende vil føre til forbedret mutation afsløring satser i ctDNA. Især blev medtagelsen af ​​cfDNA BTT rør vist sig at forbedre stabilisering af perifert blod i forhold til EDTA-rør efter 72 timers inkubation.