PLoS ONE: KRAS Genotype korrelerer med proteasominhibitoren Ixazomib aktivitet i præklinisk in vivo modeller af Colon og ikke-småcellet lungekræft: Potentiel rolle Tumor Metabolism

Abstrakt

I ikke-kliniske undersøgelser, den proteasominhibitoren ixazomib hæmmer cellevækst i et bredt panel af faste tumorcellelinier

in vitro

. I modsætning hertil antitumorvirkning i xenotransplantattumorer er modelafhængig, med nogle faste tumorer, der ikke viste reaktion på ixazomib. I denne undersøgelse undersøgte vi faktorer, der ixazomib følsomhed eller resistens ved hjælp af musen xenograftmodeller. En undersøgelse af 14 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og 6 kolon xenografter viste en slående sammenhæng mellem ixazomib aktivitet og

KRAS

genotype; tumorer med vildtype (WT)

KRAS

var mere følsomme over for ixazomib end tumorer huser

KRAS

aktiverende mutationer. For at bekræfte sammenhængen mellem

KRAS

genotype og ixazomib følsomhed, vi brugte SW48 isogen tyktarmskræft cellelinjer. Enten KRAS-G13D eller KRAS-G12V mutationer blev indført i KRAS-WT SW48-celler til generering af celler, der stabilt udtrykker aktiverede KRAS. SW48 KRAS WT tumorer, men hverken SW48-KRAS-G13D tumorer eller SW48-KRAS-G12V tumorer, var følsomme over for ixazomib

in vivo

. Eftersom aktiveret KRAS vides at være forbundet med metabolisk omprogrammering sammenlignede vi metabolit profilering af SW48-WT og SW48-KRAS-G13D tumorer behandlet med eller uden ixazomib. Forud for behandlingen var der signifikante metaboliske forskelle mellem SW48 WT og SW48-KRAS-G13D tumorer, der afspejler højere oxidativ stress og glukoseudnyttelse i KRAS-G13D tumorer. Ixazomib behandling resulterede i signifikant metabolisk regulering, og nogle af disse ændringer var specifikke for KRAS WT tumorer. Udtømning af frie aminosyrer pools og aktivering af GCN2-eIF2α-veje blev observeret både i tumortyper. Der blev dog observeret ændringer i lipid beta-oxidation i kun KRAS WT tumorer. De ikke-kliniske data præsenteres her viser en sammenhæng mellem

KRAS

genotype og ixazomib følsomhed i NSCLC og kolon implanteret og give nye beviser for regulering af centrale metaboliske veje ved proteasomhæmning

Henvisning:. Chattopadhyay N, Berger AJ, Koenig E, Bannerman B, Garnsey J, Bernard H, et al. (2015) KRAS Genotype korrelerer med proteasominhibitoren Ixazomib Aktivitet i Prækliniske

In vivo

modeller af Colon og ikke-småcellet lungekræft: Potentiel rolle Tumor Metabolisme. PLoS ONE 10 (12): e0144825. doi: 10,1371 /journal.pone.0144825

Redaktør: Mariola J. Edelmann, University of Florida, USA

Modtaget: 23, 2015; Accepteret: November 23, 2015; Udgivet: December 28, 2015

Copyright: © 2015 Chattopadhyay et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Takeda Pharmaceuticals International Co. Desuden Takeda Pharmaceuticals ydet støtte i form af løn til forfattere (NC, AJB, EK, BB, JG, HB, PH, AML, YY, JD, KJ, ST, BS, CX, GK, MM, og BA). Metabolon Inc. ydet støtte i form af løn til forfatteren NR, men havde ikke nogen yderligere rolle i beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse blev finansieret af Takeda Pharmaceuticals International Co . Forfattere NC, AJB, EK, BB, JG, HB, er PH, AML, YY, JD, KJ, ST, BS, CX, GK, MM, og BA ansat af Takeda Pharmaceuticals. NR er ansat af Metabolon Inc. Patent information: En patentansøgning på dele af dette arbejde er blevet indgivet (WO2013071142 A1) under titlen “Biomarkører respons på proteasominhibitorer” af Millennium Pharmaceuticals Inc., et helejet datterselskab af Takeda Pharmaceutical Company Limited. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

ubiquitin proteasom Systemet behandler størstedelen af ​​cellulære proteiner, herunder proteiner, der er involveret i vækst, cellecyklusregulering og apoptose [1,2,3]. VELCADE (bortezomib) er den første i sin klasse proteasominhibitoren (PI), godkendt til behandling af patienter med myelomatose (MM) [4] og kappecellelymfom [1,5,6]. Ixazomib er et testpræparat oral PI, i øjeblikket i fase III kliniske forsøg med patienter med MM og let kæde amyloidose. PI’er har demonstreret en lang række virkninger på MM-celler og deres knoglemarvens mikromiljø. Dette omfatter virkninger på cellecyklus, NF-KB-inhibering, og apoptotiske regulatorer samt induktion af den integrerede stress respons, inhibering af IL-6-produktion og signaler, og mange andre [7,8]. Som meget sekretoriske antistof-producerende celler, MM celler har en forhøjet behov for protein kvalitetskontrol og kan have en større afhængighed af proteasomfunktion for overlevelse i forhold til andre celletyper [9].

Selvom PI er blevet testet i forskellige fast tumor kliniske forsøg, er ingen PI dag godkendt til behandling af faste tumorer. Præklinisk aktivitet af ixazomib og andre proteasehæmmere er blevet demonstreret i et begrænset antal faste tumor xenograftmodeller [10,11,12], men præklinisk identifikation af genetiske og fænotypiske determinanter for fast tumor følsomhed over for PI’er har manglet.

i denne undersøgelse rapporterer vi en slående sammenhæng mellem

KRAS

genotype og ixazomib følsomhed i et panel af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og kolon xenograftmodeller. Ixazomib viste signifikant bedre antitumoraktivitet i vildtype (WT) KRAS xenografter end i xenotransplantater med aktiverende KRAS-mutationer. Især blev denne forening ikke observeret

in vitro

. Ca. 25-30% af humane tumorer anslås at huse aktiverende RAS mutationer [13]. Af de tre RAS isoformer (KRAS, nationale tilsynsmyndigheder og HRAS),

KRAS

oftest muteret i maligniteter.

KRAS

mutation er især fremherskende i colon (40-45%), NSCLC (16-40%) og pancreatisk ductal carcinoma (69-95%) [14]. RAS-proteinerne er GTPaser som regulerer en række cellulære processer, herunder proliferation, overlevelse, vækst, migration, differentiering og metabolisme. Mutationer i

KRAS

onkogen er kendt for at modulere en række større metaboliske veje, herunder glykolyse, tricarboxylsyre (TCA) cyklus, pentosephosphatvejen (PPP), membran biogenese samt glukose transport [15,16 , 17]. For at karakterisere den mekanisme af KRAS-associerede

in vivo

modstand mod ixazomib sammenlignede vi den metaboliske profil ved baseline og efter ixazomib behandling i isogene KRAS WT og mutant SW48 implanteret. Vi identificerede flere vigtige metaboliske veje, som er forskelligt påvirket af KRAS-status, ixazomib behandling, eller begge dele. Data tyder på, at disse metaboliske veje kan spille en rolle i fastlæggelsen af ​​følsomhed over for proteasominhibitoren i solide tumorer.

Metoder og materialer

Cellelinjer og reagenser

SW48 og SW48- KRAS-G13D og SW48-KRAS-G12V celler blev opnået fra Horizon Discovery Ltd. Cambridge, UK og opretholdt i McCoys 5A medium suppleret med 10% serum.

De 8 andre cellelinjer, der anvendes som xenotransplantater blev opnået fra ATCC , Manassas, VA.

for

in vitro

brug, blev ixazomib formuleret i DMSO og fortyndes i medierne til den ønskede koncentration.

antistoffer

Kanin antistoffer mod human GLUT1, GLUT 4 blev GCN2, pGCN2 (T899) og eIF2α opnået fra Abcam, Cambridge, MA. FASN, pACC (S79), ACC, CPT-1-antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA og muse-antistof mod humant peIF2α (S52) blev opnået fra Invitrogen, Grand Island, NY. Alle antistoffer blev anvendt ved 1:. 1000 fortynding

In vivo-undersøgelser i xenograft bærende mus

Alle de dyr forskning og dyrlægebehandling, der blev udført på Takeda Boston, blev udført under en godkendt Takeda Boston Institutional Animal Care og brug udvalg (IACUC) protokol i en associering for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkrediteret facilitet. Immunkompromitterede mus blev huset i et kontrolleret miljø og modtaget foder og vand ad libitum. Nærmere oplysninger om xenograftmodeller herunder indikation, antal celler implanterede og værtsstammen er specificeret i S1 tabel.

Dyreforsøg, der blev udført på Oncotest blev GmBH udført i overensstemmelse med retningslinjerne i den tyske Animal Welfare Act (Tierschutzgesetz ).

i cellelinje xenotransplantater, et defineret antal celler (med eller uden Matrigel, BD Biosciences, Bedford, MA) blev subkutant inokuleret i højre flanke af mus og tumorvækst blev monitoreret med skydelære måling. Når den gennemsnitlige tumor nået et vist omfang (mellem 120-250mm

3, afhængigt af modellen) blev dyrene randomiseret i forskellige behandlingsgrupper på 8-10 dyr pr. Primære humane tumor xenograftmodeller annoteret med PHTX blev udviklet på Takeda. De patientprøver blev opnået fra enten den nationale Disease Research Interchange, Philadelphia, PA eller Cooperative humant væv Network, NCI. Kirurgisk fjernet patientprøver blev subkutant implanteret i mus og passeret flere gange (ikke mere end 10), før du bruger i undersøgelser af effekten. Primære tumorer annoteret med LX blev udviklet og afprøvet på Oncotest GmbH, Tyskland.

Ixazomib for

in vivo

brug blev formuleret i 10% HP-β-CD (hydroxypropyl-beta-cyclodextrin) og doseres på dens maksimale tolererede dosis (MTD) for den angivne musestamme og model (mellem 11 til 14 mg /kg, IV, BIW i 3-4 uger).

Antitumoraktivitet blev bestemt ved at beregne behandling i forhold til kontrol (T /C) forholdet tumor volumen ved slutningen af ​​studiet.

Enten ved afslutningen af ​​hver undersøgelse, af hvis alle dyr nåede en human endepunkt, dyrene blev aflivet med CO

2 efterfulgt af cervikal dislokation eller anden sekundær fremgangsmåde til eutanasi er godkendt af lACUC protokollen.

Cellelevedygtighed assay

Celler blev dyrket i deres respektive vækstmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum og podet på 384 brønde poly- D-lysin (PDL) -belagt sorte, klare-bundplader (BD BioCoat

™) og inkuberet 24 timer ved 37 ° C, 6% CO

2. Celler blev derefter behandlet med ixazomib ved forskellige koncentrationer i 72 timer. Levedygtighed blev bedømt med CellTiter-Glo

® cellelevedygtighed reagens ifølge producentens anvisninger (Promega, Madison, WI). Salg

2D Kolonidannelse assay

5000 celler pr brønd af vildtype eller KRAS muterede (G12V eller G13D) SW48 linjer blev udsået i 12-brønds plader (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) og inkuberet natten over. Celle blev derefter behandlet med 0-500 nM ixazomib i 11 dage og fikseret i 4% PFA, før farvning med 0,5% krystalviolet i 25% methanol. Areal af kolonierne blev målt ved hjælp Metamorph software og IC

50 blev bestemt ved at beregne den koncentration, hvor den procentvise gennemsnitlige koloni område nåede 50% i forhold til kontrol køretøj.

3D kolonidannelse analyse for 20 primær patient afledte NSCLC-tumorer blev beskrevet i [18].

Analyse af tumor farmakokinetik (PK) og 20S proteasom aktivitet

tumor PK og 20S assays er beskrevet tidligere [10]. Kort fortalt blev tumorprøver høstet på forskellige tidspunkter efter køretøj eller lægemiddelindgivelse og homogeniseret i museplasma for PK anaylsis. Koncentration af ixazomib i tumorerne blev bestemt ved hjælp af LC /MS /MS-metoder.

20S proteasom β5 enzymatisk aktivitet blev målt efter homogenisering tumorprøver i buffer indeholdende HEPES og DTT under anvendelse af en Covaris sonikator.

mutationsanalyse

DNA fra xenotransplantattumorer blev amplificeret og analyseret ved Sequenom assay som beskrevet i [19]. Genet Panelet indgår i OncoCarta

™ V1 og brugerdefinerede panel leveres i S2 tabel. For

KRAS

gen, de testede mutationer er G12 A /C /D /F /R /S /V, G13 A /C /D /R /S /V, L19F, Q22K, T58I, A59T /V, G60D, Q61 E /H /K /L /P /R og A146T.

stofskifteprofil

Tumor prøver blev høstet på forskellige tidspunkter efter IV administration af en enkelt dosis af ixazomib. Til kontrol køretøj blev to tidspunkter (1 hr og 8hrs) evalueret. Den tumorlyse og global metabolisk profilering analyse blev foretaget ved Metabolon Inc. Kort fortalt blev prøverne ekstraheret i methanol og inddelt i lige store dele til analyse på GC /MS og LC /MS /MS-platforme. Proprietær software blev anvendt til at matche ioner til en in-house bibliotek af standarder for metabolit identifikation og for metabolit kvantificering af toparealet. Welch to sample t-test og tovejs ANOVA blev anvendt til at sammenligne de to populationers. P-værdier ≤0.05 blev betragtet yderst signifikant og p-værdier mellem 0,05 og 0,1 blev anset for mindre betydelig.

Western blot-analyse

Tumor prøver blev homogeniseret i MPER buffer indeholdende proteaseinhibitorer [10]. 10-20 μgm af proteiner blev påsat 4% til 12% Bis-Tris-geler, eller 3-8% tris-acetat geler til højere molekylvægt proteiner (Invitrogen). Proteiner blev overført til PVDF-membraner FL (Millipore), blokeret og inkuberet med primære antistoffer, efterfulgt af Alexa Fluor 680 mærket sekundært antistof (Molecular Probes). Bånd blev påvist under anvendelse Odyssey infrarød billeddannelse systemet (LI-COR Biosciences, Lincon, NE).

Resultater

KRAS-mutationer korrelerer med nedsat følsomhed over for ixazomib

For at forstå den molekylære faktorer, der bestemmer følsomhed over for ixazomib

in vivo

, vi undersøgte antitumoraktivitet i et panel af kolon og NSCLC xenograftmodeller herunder primære humane xenotransplantater og cellelinie-afledte xenotransplantater. Antitumoraktiviteten af ​​lægemidlet blev udtrykt som T /C-forhold; med T /C på 0 indikerer fuldstændig fjernelse af tumor, og T /C på 1 indikerer ingen virkning. (Fig 1A)

(A) Antitumoraktivitet af ixazomib i 14 ikke-småcellet (NSCLC) og 6 colon xenograftmodeller. Panelet omfattede både cellelinje-afledt og primære humane xenografter huser enten WT eller mutant KRAS. Tumorbærende dyr (n = 8-10 pr gruppe) blev behandlet med enten bærer eller MTD dosis ixazomib (mellem 11 og 14 mg /kg, IV, BIW) i ca. tre uger. T /C blev beregnet ved at dividere gennemsnitlige tumorvolumen af ​​lægemiddelbehandlede dyr ved den for vehikelbehandlede dyr på dag 19-21. Tumor koncentration af ixazomib (B) og 20S proteasomhæmning (β5 site) (C) i forskellige NSCLC og colon-xenotransplantater på forskellige tidspunkter efter en enkelt intravenøs administration af MTD dosis af ixazomib. % 20S β5-inhibering blev beregnet ved at overveje den gennemsnitlige (n = 3 for behandlingsgruppe eller 4 for køretøjets gruppe) tumor 20S aktivitet af bærerbehandlede dyr som 100%. Hver søjle repræsenterer den gennemsnitlige koncentration af ixazomib eller 20S hæmning i tumoren fra 3-4 forskellige dyr +/- SD.

Mutationer i et panel af onkogener og tumor undertrykkere (S2 tabel) blev undersøgt i de tumorxenografter efter Sequenom massespektrometri-analyse. I overensstemmelse med den høje forekomst af

KRAS

mutationer i menneskets tyktarm og NSCLC tumorer, 12 af de 20 modeller evalueret havde

KRAS

mutationer i codon G12, G13, G61 eller A146T, mens ingen

nationale tilsynsmyndigheder

eller

HRAS

mutationer blev påvist. Færre prøver havde mutationer i

PI3KCA

, eller andre kendte onkogener (S3 tabel). KRAS muterede tumorer viste lavere følsomhed over for ixazomib (av. T /C = 0,82) sammenlignet med KRAS WT tumorer (av. T /C = 0,4) (p = 0,002 bestemt ved t-test) (figur 1A).

Vi vurderede flere mulige forklaringer for forskelle i ixazomib følsomhed blandt xenotransplantattumorer, startende med farmakokinetisk (PK) og farmakodynamiske (PD) virkningerne af ixazomib

in vivo

efter en enkelt MTD dosis i 5 xenograftmodeller. Ixazomib koncentrationer i KRAS muterede tumorer var enten svarer til eller er højere end i KRAS WT tumorer (Fig 1B), og tumor proteasom β5-site aktivitet blev inhiberet til en lignende grad i både KRAS vildtype og mutant tumorer (Fig 1C). Yderligere beviser på proteasomhæmning og dens downstream konsekvenser blev genereret ved hjælp af en IHC assay for ATF3, som er opreguleret som en del af den integrerede stress respons efter proteasomhæmning [10]. ATF3 opregulering blev påvist i alle modeller, uanset deres

KRAS

mutation status eller følsomhed over for ixazomib (S1 Fig). Således er ufølsomhed KRAS muterede tumorer at ixazomib ikke forklares med lavere tumor eksponering eller mindre mål hæmning.

Interessant nok har KRAS-mutationer ikke identificeret som en indikator for PI modstand i monolag væv levedygtighed kultur assays. For at bestemme om associationen mellem KRAS status og ixazomib følsomhed kunne observeres ved anvendelse af en

in vitro

tredimensional model, et panel af 20 xenograft eksplantater herunder WT KRAS og mutant KRAS blev testet i en blød agar-kolonidannelse assayet. Eksplantaterne omfattede 17 primære humane xenograft tumorer og 3 cellelinie afledt xenotransplantattumorer, og 8 af de 20 er også blevet testet for ixazomib respons

in vivo

. Forskellen i følsomhed set

in vivo

blev ikke påvist

in vitro

. Den mediane IC

50 i kolonien dannelse analysen var 99 nM (interval 34-272 nM) til WT KRAS-modeller, og 73 nM (interval 38-17 5nM) for KRAS muterede modeller (S4 tabel). (P = 0,4). Disse data antyder, at mutant KRAS tilvejebringer en overlevelsesfordel

in vivo

som ikke efterlignes i blød agar-assay-format.

Indførelse af KRAS mutation reverserer in vivo ixazomib følsomhed KRAS WT xenograft

for yderligere at undersøge forbindelsen mellem

KRAS

genotype og ixazomib følsomhed

in vivo

, vi brugte et sæt tyktarmskræft cellelinjer, der afviger i KRAS-status, men er ellers genetisk matchede. Stabile produkter af den SW48 cellelinjen blev afledt ved at indføre en KRAS-G13D eller KRAS-G12V punktmutation via rrAV gen redigering teknologi. Tilstedeværelsen af ​​mutationer og bevarelse af den samlede genomisk profil af de manipulerede celler blev bekræftet ved mutation afsløring og SNP-analyse (data ikke vist). Aktivering af KRAS signalering i KRAS-G13D og KRAS-G12V celler i forhold til deres WT modstykke blev allerede bekræftet. [20]

Alle 3 cellelinier blev ligeledes følsomme over for ixazomib i

I

vitro celleviabilitetstest (fig 2A). KRAS WT og KRAS-G13D celler var lige følsomme i 2D kolonidannelse assayet, mens KRAS-G12V celler blev ca. 2 gange mere følsomt i denne CFA assay (Fig 2A). I modsætning hertil var der en klar forskel i

in vivo

følsomhed over for ixazomib i SW48, SW48-G13D og SW48-G12V xenotransplantattumorer. SW48 xenografter med vildtype-KRAS reagerede på ixazomib behandling med T /C på 0,42 (figur 2B). I modsætning hertil hverken SW48-G13D eller SW48-G12V xenograftmodel var følsomme over for ixazomib (T /C = 1,05 og 0,99), hvilket antyder, at indførelsen af ​​en

KRAS

mutationen er tilstrækkelig til at drive resistens over for PI i tumor xenograftmodeller

in vivo

. De 3 xenograftmodeller viste lignende vækst kinetik i bilens grupper (Fig 2B), hvilket tyder på, at forskelle i ixazomib svar ikke skyldes forskelle i tumor vækst. Desuden resultaterne af en PK /PD undersøgelse foretaget i SW48 og SW48-G13D xenotransplantattumorer indikerer sammenlignelige ixazomib eksponering i xenotransplantaterne (Fig 2C), samt tilsvarende niveauer af tumor proteasomhæmning (Fig 2D), i overensstemmelse med resultater i den bredere panel af xenotransplantater beskrevet i figur 1. således er effekten af ​​KRAS mutation ikke på niveauet af lægemiddel eksponering eller target inhibering.

(A) Oversigtstabel af EF

50, IC

50 og T /C-værdier for SW48, SW48-G13D og SW48-G12V celler og xenotransplantater fra

in vitro

cellelevedygtighed,

in vitro

kolonidannelse og

in vivo Salg antitumoraktivitet assays. EF

50 repræsenterer den gennemsnitlige koncentration af ixazomib (+/- SD), der kræves for 50% celle drab i tre forskellige eksperimenter i cellernes levedygtighed assay. I kolonidannelse assayet (CFA) var den gennemsnitlige koncentration af lægemidlet til at inhibere 50% kolonidannelse blev beregnet i tre forskellige eksperimenter og antallet er middelværdien +/- SD. 13 mg /kg, IV, blev BIW dosis i xenografundersøgelser og T /C blev beregnet som beskrevet tidligere. (B) Antitumoraktivitet af ixazomib i SW48, SW48-G13D og SW48-G12V xenografter. Den tumorvækst over tid præsenteres for køretøjer og ixazomib behandlede dyr bærer SW48, SW48-G13D og SW48-G12V xenografter. Behandlingen startede, da gennemsnitlig tumor volumen nåede ca. 200 mm

3 og der var n = 10 dyr pr arm. T /C blev beregnet på dag 19-21. C og D: Tumor koncentration af ixazomib (C) og 20S proteasomhæmning (D) på forskellige tidspunkter efter en akut intravenøs administration af ixazomib på 13 mg /kg dosis i SW48 og SW48-G13D tumorer. Hvert datapunkt repræsenterer tumorer fra tre forskellige dyr +/- SD

Øget ekspression af GLUT4-receptorer i KRAS muterede tumorer

Forskelle i ixazomib aktivitet

in vitro

in vivo

foreslå faktorer i tumoren miljø

in vivo

, såsom niveauer næringsstoffer, metabolitter eller andre faktorer, kan spille en rolle i fastlæggelsen af ​​følsomhed over for ixazomib. Onkogen KRAS proteiner er blevet rapporteret at inducere celleoverfladeekspression af glucose receptorer (gluts), og derved lette cellulær glucosetransport [4,15,21,22]. Derfor undersøgte vi baseline ekspression af GLUT1 og GLUT4 i en række KRAS WT og mutant tumorer ved Western blot (Fig 3). Vi inkluderede lysater fra KRAS WT og mutant cellelinie-afledte xenografter (NCI-H1650 og A549 og isogene par SW48 og SW48-G13D) og primære xenografter (PHTX132Lu og PHTX192Lu). Selvom udtryk for Glut1 receptorer ikke korrelerer med KRAS-status, viste KRAS muterede xenografter langt højere niveauer af GLUT4 receptor-ekspression i forhold til tumorer med WT KRAS. Øget GLUT4 ville sætte øget glukoseoptagelse, hvilket ville være en fordel i næringsstof-begrænsende miljøer ofte findes i tumorer. Det forhøjede GLUT4 udtryk i KRAS muterede tumorer tyder på, at ændrede glukoseoptagelse og stofskifte kan spille en vis rolle i fastlæggelsen følsomhed over for ixazomib.

Proteiner blev udvundet fra ubehandlede tumorer og 10 ug protein blev lagt i hver bane. Niveauer af Glut1 og GLUT4 proteiner blev bestemt ved Western blot og tubulin blev anvendt som en loading kontrol. n = 3 for hver tumor.

Global metaboliske profil analyse i SW48 isogene tumorer

For yderligere at forstå de metaboliske forskelle mellem KRAS WT og KRAS muterede tumorer og deres reaktion på ixazomib, vi gennemført metabolisk profilering på SW48 og SW48-G13D xenotransplantattumorer høstet på forskellige tidspunkter efter en enkelt IV dosis af køretøj eller ixazomib. Metabolit-niveauer blev målt ved massespektrometri-baserede metoder og rapporteres som en fold-ændring i forhold til definerede kontrolprøver. Der var en række metaboliske forskelle observeret ved baseline (vehikelbehandlede prøver) mellem SW48 og SW48-G13D tumorer, især relaterede til glutathion og glykogen metabolisme og fedtsyre syntese (Fig 4). Både oxideret og reduceret glutathion (GSSG og GSH) blev detekteret ved højere niveauer i KRAS muterede tumorer sammenlignet med KRAS WT tumorer (Fig 4A). Omvendt blev biosyntetiske precursorer for glutathion, såsom glutamat, cystein, glycin, gamma-glutamyl aminosyrer, og 5-oxyprolin detekteret ved lavere niveauer i KRAS muterede xenotransplantattumorer (Fig 4A). Det forhøjede niveau af glutathion-syntese i KRAS muterede tumorer kan fremme øget overlevelse og resistens ved at styrke tumorer evne til at håndtere redox stress [23]

AC:. Glutathion stofskifte veje (A), glykogen metabolisme ( B) og den relative ekspression af pathway metabolitter i KRAS WT vs KRAS muterede tumorer behandlet med vehikel for 1 og 8 timer. Tallene angiver gange ændring af hver metabolit i KRAS muterede tumorer sammenlignet med KRAS WT tumorer og er gennemsnittet af metabolitter fra 5 forskellige tumorer. C: Relativ udtryk for frie langkædede fedtsyrer, acetyl-CoA, acetylcarnitin og citrat i KRAS mutant vs KRAS WT tumorer. Grønne kasser indikerer et forhold 1, med mørkegrønne kasser som stærkt signifikant (p ≤0.05) og lysegrønne kasser som mindre signifikant (0,05 p 0,1). Røde felter angiver et forhold 1, med mørkerøde kasser som stærkt signifikant (p ≤0.05) og lyserøde kasser som mindre signifikant (0,05 p 0,1). Hvide kasser repræsenterer ingen ændring i udtrykket.

Nedsat niveau af glykogen mellemprodukter, såsom maltotriose, maltose og glucose blev observeret i KRAS muterede tumorer i forhold til KRAS WT tumorer (Fig 4B), hvilket tyder på en hurtig glykogen opdeling i KRAS muterede tumorer at levere glucose. Den relativt lavere niveau af glucose til stede ved baseline i KRAS muterede tumorer er en indikator, glucose hurtigt forbruges i fremme fortsat vækst og overlevelse.

Højere niveauer af frie fedtsyrer i SW48-G13D tumorer sammenlignet med SW48 (Fig 4C) blev påvist. Andre forskelle i komponenter af stofskifte veje blev også noteret fedtsyren; i SW48-G13D tumorer, niveauer af citrat er højere og niveauer af acetylcarnitin er lavere sammenlignet med de SW48 WT tumorer. Tilsammen disse forskelle peger på øget

de novo

fedtsyre syntese i KRAS muterede tumorer, som kunne bidrage til øget membran biosyntese nødvendig for fortsat vækst og spredning i onkogen-drevne tumorer.

Aminosyre udtynding efter ixazomib behandling

Der var en række af metaboliske ændringer observeret efter ixazomib behandling i både SW48 og SW48-G13D tumorer. En af de større ændringer var den akutte fald i niveauerne af mange individuelle aminosyrer følgende ixazomib behandling (figur 5). Figur 5A viser reguleringen af ​​20 aminosyrer ved en og 8 timer efter ixazomib behandling af KRAS WT og mutant SW48 tumorer. En række essentielle og ikke-essentielle aminosyrer faldt 1 time efter ixazomib behandling i både KRAS WT og mutant tumorer. De aminosyre niveauer tilbage tæt på baseline ved 8 timer, hvilket tyder på akut aminosyre udtynding efter ixazomib behandling. Proteasomalaktivitet nedbrydning af proteiner skaber korte peptider, som kan være enzymatisk omdannes til frie aminosyrer; blokerende proteasom aktivitet med ixazomib bør derfor føre til en reduceret pulje af peptider og frie aminosyrer.

(A) Relativ niveau af aminosyrer på 1 time og 8hrs efter ixazomib behandling af SW48 KRAS WT og G13D mutant tumorer. Tallene er udtrykt som relative niveau for hver aminosyre efter ixazomib behandling sammenlignet med bærer behandling på det pågældende tidspunkt. Hvert datapunkt er et gennemsnit af tumorer fra fem forskellige dyr. Farvekodning er ens som beskrevet i figur 4. (B) Ekspression af pGCN2 (T899), GCN2, peIF2α (Ser52) og eIF2α i tumorer fra køretøj eller ixazomib behandling. Prøverne køretøjer blev opsamlet ved 4hrs efter dosering og de ixazomib behandlede prøver blev opsamlet på forskellige tidspunkter (som angivet på figuren) efter lægemiddelbehandling. Tubulin blev anvendt som en loading kontrol. Bemærk: For pGCN2 /GCN2 western blot, blev kun 2 prøver vurderet ved 24 timer tidspunkterne og 3 prøver blev evalueret for alle andre markører og tidspunkter i denne figur (14 prøver, der anvendes i GCN2 /pGCN2 blots og 15 prøver i de andre blots).

Aminosyre udtømning forårsager et overskud af frit tRNA som kan binde til GCN2 og føre til dens autophosphorylering og aktivering [24]. Når den er aktiveret, GCN2 phosphorylerer eIF2αat Serin 52, som hæmmer eIF2α og derved undertrykker protein oversættelse [25,26]. For at spore konsekvenserne af aminosyren udtømning, vi evalueret GCN2 /phospho-eIF2α aksen ved western blot i SW48 WT og SW48-G13D xenotransplantattumorer efter ixazomib behandling. Som vist i fig 5B, ixazomib behandling resulterer i phosphorylering af GCN2 på T899 i både KRAS WT og mutant tumorer i en tidsafhængig måde, med lidt højere niveauer af pGCN2 detekteret efter behandling i SW48 WT tumorer i forhold til deres KRAS mutante modstykker. Niveauer af total GCN2 var ens i begge SW48 og SW48-G13D tumorer. I overensstemmelse med phosphorylering og aktivering af GCN2, observerede vi en stigning i phospho-eIF2α (Ser 52) i den samme tidsramme i både SW48 og SW48-G13D tumorer, selv om baseline niveau af p-eIF2α var højere i SW48-G13D tumorer sammenlignet med SW48 tumorer. Derudover det samlede niveau for eIF2α var lidt højere i SW48-G13D tumorer sammenlignet med SW48 tumorer, men ikke ændre i enten tumor efter ixazomib behandling. Sammen udgør stofskifteprofil og Western blot data tyder ixazomib behandling resulterer i en akut fald i fri aminosyre puljer, som aktiverer GCN2 og resulterer således i phosphorylering og inaktivering af eIF2α, hvilket kunne føre til nedsat globale proteintranslation. Fordi disse ændringer sker i både KRAS WT og mutant tumorer, de ikke forklare forskellen i ixazomib følsomhed mellem KRAS WT og mutant tumorer.

Øget fedtsyre beta oxidation i KRAS WT tumorer efter ixazomib behandling

Anvendelse af fedtsyrer som en alternativ energikilde forekommer, når andre kataboliske veje, såsom aminosyremetabolismen kompromitteres [27]. Frie fedtsyrer kan undergå β-oxidation til frembringelse af acetyl-CoA og ketonstoffer, som beskrevet i fig 6A. I SW48 WT tumorer, detekterede vi forøgede niveauer af frie fedtsyrer, acetyl-CoA, og ketonstoffet 3-hydroxybutyrat (3-BHBA) efter 1 time efter ixazomib behandling (Fig 6B og 6C). Niveauet af disse metabolitter tilbage tæt på baseline niveauer ved 8 timers medicinsk behandling. Stigningen i disse biokemikalier i KRAS WT tumorer er reflekterende af et hurtigt skifte til fedtsyre β-oxidation efter ixazomib behandling. I modsætning hertil KRAS muterede tumorer viser ikke tegn på øget β-oxidation efter PI behandling, med de fleste frie fedtsyrer, acetyl-CoA og 3-HBA niveauer forbliver uændrede efter ixazomib behandling.

metabolitter er involveret i fedtsyre beta-oxidation pathway. (A) tabel over frie fedtsyrer i tumorprøver. Tallene angiver gange ændring i lægemiddelbehandlede tumorer end vehikelbehandlede tumorer ved 1 og 8hrs tidspunkter. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af tumorer fra fem forskellige dyr. Tabel sammenfatter niveauerne af acetyl Co-A og 3 Hydroxy butyrat på 1 time efter ixazomib behandling. Tallene indikerer gange ændring i ixazomib behandlede tumorer end vehikelbehandlede tumorer, n = 5 pr datapunkt. Ændringer i CPT-1-protein plan efter ixazomib behandling i SW48 og SW48-G13D tumorer.