Abstrakt
phosphoinositid 3-kinase (PI3K) signalvejen er kritisk for flere vigtige cellulære funktioner, og er en af de mest almindeligt ændrede veje i humane kræftformer. Vi har tidligere udviklet en musemodel hvori coloncancerformer blev initieret ved en dominerende aktiv PI3K p110-p85 fusionsprotein. I denne model, vel-opdelte mucinøse adenokarcinomer udviklet inden tyktarmen og indledte gennem en ikke-kanonisk mekanisme, der ikke er afhængig af WNT signalering. At vurdere den potentielle relevans af PI3K mutationer i humane cancere, søgte vi at bestemme, om en af de fælles mutationer i den humane sygdom også kunne indleder tilsvarende coloncancerformer. Mus blev genereret udtrykker
Pik3ca
H1047R
mutation, den analoge af en af tre menneskelige hotspot mutationer i dette gen. Mus, der udtrykker en konstitutivt aktiv PI3K, som et resultat af denne mutation, udvikle invasive adenocarcinomer slående lighed med invasive adenocarcinomer fundet i humane coloncancerformer. Disse tumorer dannes uden en polypoid mellemled og mangler også nuklear CTNNB1 (β-catenin), hvilket indikerer en ikke-kanonisk mekanisme tumorinitiering medieret af PI3K pathway. Disse kræftformer er følsomme over for dual PI3K /mTOR inhibering indikerer afhængighed af PI3K pathway. Tumorvævet bliver tilbage efter behandling viste reduktion i cellulær proliferation og inhibering af PI3K-signalering
Henvisning:. Yueh AE, Payne SN, Leystra AA, Van De Hey DR, Foley TM, Pasch CA, et al. (2016) Colon Cancer tumorigenese Indledt af H1047R Mutant PI3K. PLoS ONE 11 (2): e0148730. doi: 10,1371 /journal.pone.0148730
Redaktør: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, UNITED STATES
Modtaget: September 18, 2015; Accepteret 22. januar 2016 Publiceret: 10. februar, 2016
Copyright: © 2016 Yueh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer
Finansiering:. Dette projekt blev støttet af National Institutes of Health (https://www.nih.gov/) P30 CA014520 (Core Grant, University of Wisconsin Carbone Cancer center); opstart fonde (D-A-D) fra UW Carbone Cancer Center, UW Institut for Medicin, UW School of Medicine og folkesundhed, og UW Graduate School gennem Wisconsin Alumni Research Foundation; Funk Out Cancer (https://www.funkoutcancer.com/) og UW Carbone Cancer Center Gastrointestinal Disease Oriented arbejdsgruppe. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Tyktarmskræft er en heterogen sygdom med flere undertyper kendetegnet ved deres mutation profiler. Tumorgenese er almindeligt menes at opstå i colon sekundært til den sekventielle erhvervelse af mutationer i de epitelceller, der beklæder bunden af krypten. Ændringer i
adenomatøs polypose Coli Hotel (
APC
) tumorsuppressorgen menes at være den initierende begivenhed i de fleste sporadiske humane kolorektal kræft med ca. 80-90% af humane coloncancerformer huser somatiske mutationer i
APC
[1-3]. Efter tabet af APC, tumorer udvikle sig inden tyktarmen hovedsagelig gennem den kanoniske adenom-til-carcinom sekvens [4]. Under denne proces præmaligne adenom erhverver mutationer i andre gener, herunder
KRAS
,
TP53
,
PIK3CA
, og
BRAF
resulterer i den endelige dannelse af en invasiv adenokarcinom og mangfoldighed i den molekylære profil [5]. Ikke-kanoniske mekanismer i tyktarmskræft indledning er også blevet beskrevet herunder den takkede polyp-carcinom vej [6].
PIK3CA
gen koder for p110 alpha katalytiske underenhed af PI3K og mutationer forekommer i 20-30% af humane kolorektal kræft [7, 8]. Der er tre hotspot mutationer, der forekommer i
PIK3CA
: E542K, E545K, og H1047R, alle resulterer i et konstitutivt aktiv PI3K [9]. Vi har tidligere udviklet en transgen musemodel udtrykker en konstitutivt aktiv PI3K hele distale tyndtarm og tyktarm (
Fc
+
Pik3ca
p110 *
) [10]. Disse mus udviklede invasive mucinous adenocarcinomer i den proximale colon. Disse kræftformer ofte invaderet gennem muscularis propria til serøse overflade. Cancer blev også påvist i de regionale lymfeknuder og som satellit tumor indskud i det tilstødende fedtvæv. Kernelokalisering af CTNNBI (β-catenin) blev ikke identificeret i disse tumorer, hvilket indikerer, at WNT signaleringskaskade ikke afvigende som ville forventes, hvis disse kræftformer udvikles gennem den kanoniske adenom-til-carcinom-vejen. Disse tumorer også udviklet uden en identificerbar polypoid forløber læsion. Mens
Fc
+
Pik3ca
p110 *
modelresultater i en konstitutivt aktiv PI3K, det bruger en p85- p110 fusionsprotein ikke fundet i humane kræftformer. Her undersøger vi, om tumorigenese i tyktarmen kan igangsættes sekundært til H1047R hotspot mutation i
Pik3ca Hotel (
Pik3ca
H1047R
).
Materialer og metoder
mus Husbandry
Alle dyreforsøg blev udført under protokoller godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Wisconsin-Madison, svarer til retningslinjerne i American Association for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care. Homozygot FVB
Fc
+
hunmus (NCI Mouse Repository, stamme nummer 01XD8). Blev krydset til homozygot
Pik3ca
H1047R
hanmus (The Jackson Laboratory, Stock Number 016.977) til at generere
Fc
+
Pik3ca
H1047R
mus anvendt i denne undersøgelse. Mus blev genotype for
Fc
Pik3ca
H1047R
som tidligere beskrevet [11, 12].
Apc
Min /+
mus (C57BL /6J
Apc
Min
/J; The Jackson Laboratory; Stock Number 002.020) blev opretholdt som tidligere beskrevet [13].
Histologi og Immunhistokemi
Ved obduktion blev colon fjernet, skyllet med PBS, et længdesnit og fikseret i 10% pufret formalin i 24 timer . Væv blev derefter opbevaret i 70% ethanol, forarbejdet, indlejret i paraffin og skæres i 5 um snit. Hver tiende sektion blev farvet med hematoxylin og eosin (H 70% med de fleste neoplastiske kerner udstiller Ki67 nuklear ekspression. I modsætning hertil
Apc
Min
tumorer havde en lav proliferativ indeks som demonstreret ved mindre end 25% nukleare udtryk for nuklear Ki67.
Pik3ca
H1047R
resultater i aktivering af PI3K /AKT /mTOR pathway og ERK 1/2 signalering: de epitelceller i
Fc
+
Pik3ca
H1047R
og
Fc
+
Pik3c
en
p110 *
tyktarmskræft demonstrere øget farvning for fosforylering af RPS6 sammenlignet med dem i
Apc
Min
kolon tumorer (figur 2). Desuden blev en stigning i phosphoryleret ERK1 /2 observeret i
Pik3ca
mutante cancere (Fig 2).
Immunblotting demonstrerede aktivering af PI3K signaleringskaskade tværs tumortyper (Fig 3A). En tendens til en stigning i fosforylering af AKT, RPS6, og 4EBP1 blev set i
Fc
+
Pik3ca
H1047R
og
Fc
+
Pik3ca
p110 *
kræftformer (fig 3B). I forhold til
Fc
+
Pik3c
en
p110 *
kolon tumorer, Fc
+
Pik3ca
H1047R
viste en tendens til mindre fosforylering af 4EBP1 (fig 3B).
Immunoblotting demonstrerer robust fosforylering af AKT i
Apc
Min
,
Fc
+
Pik3c
en
p110 *
og
Fc
+
Pik3ca
H1047R
kolon tumorer (A). Øget fosforylering af RPS6 og 4EBP1 ud over den, der ses i
Apc
Min
læsioner observeres i
Fc
+
Pik3ca
H1047R
Fc
+
Pik3c
en
p110 *
kolon tumorer. Jo mere aggressive fænotype ses i
Fc
+
Pik3c
en
p110 *
mus, med et større antal og nedsat latenstid, er forbundet med en øget fosforylering af 4EBP1 forhold til
Fc
+
Pik3ca
H1047R
tumorer (B )
Pik3ca
H1047R
mutationer indlede kræft gennem en ikke-kanonisk mekanisme:. Den mest almindelige mutation i humane kolorektale adenocarcinomer resulterer i en afkortet APC-protein. Trunkering af APC-protein resulterer i tab af tumor suppression. En almindeligt anvendt markør for APC-funktionen er ß-catenin translokation til kernen af de tyktarmen epitelceller. Immunhistokemi af tumorcellerne viste, at nukleare lokalisering af ß-catenin var fraværende i både
Pik3ca
H1047R
Pik3ca
p110
kræftformer, men var rigeligt til stede i
Apc
Min
kolon tumorer (fig 4). Manglen på nukleare ß-catenin indikerer, at APC tab ikke har fundet sted. Hvis disse cancere var opstået selvom den kanoniske mekanisme tumorigenese, ville tab af APC forventes, således disse tumorer udvikler gennem en ikke-kanonisk mekanisme.
Histologisk undersøgelse viser, at disse kræftformer er flade uden en polypoid komponent. Lav grad dysplasi (rørformet adenom) er ikke blevet identificeret i disse eller
Fc
+
Pik3c
en
p110 *
mus. Ved højere forstørrelse, kan maligne kirtler over muscularis mucosa kan identificeres som synes at have oprindelse fra krypt baser uden identifikation af overfladen lav kvalitet dysplasi. CTNNB1 farvning viser, at nuklear CTNNB1 er fraværende i både den
Pik3ca
mutant modeller, men er til stede i
Apc
Min
kontroller. Scale bar for lav forstørrelse billede = 1 mm. Stor forstørrelse H B). Desuden var der en tendens til et lille fald i den mediane SUV for disse kræftformer behandlet med PI3K /mTOR inhibitor. I en kontrol mus blev to tumorer observeret på baseline billedbehandling, men ikke fundet på opfølgning PET /CT scanning.
Efter billeddannelse blev musene behandlet igen med NVP-BEZ235 eller kontrol og obduktion udført 1 time senere. Ved obduktion blev 18 tumorer identificeret i kontrol mus i forhold til 12 i
Fc
+
Pik3ca
H1047R
mus behandlet med NVP-BEZ235. Ingen signifikant forskel i median cancer størrelse blev observeret (3,6 vs 3,2 mm, p = 0,59). Tumorer blev fikseret i formalin og indlejret i paraffin. H & E-farvning viste en signifikant behandlingsrespons i de tumorer behandlet med NVP-BEZ235, herunder tab af epitelceller omgiver mucin søer områder af cystisk ændring /degeneration og områder med forøget fibrose, i overensstemmelse med behandlingseffekt (Fig 6). Dual PI3K /mTOR hæmning resulterede i nedsat fosforylering af AKT og RPS6 (figur 6). Nedsat proliferation målt ved Ki67-farvning blev observeret (figur 6). Derudover er det phosphorylerede ERK1 /2 også formindsket med NVP-BEZ235 behandling (Fig 6)
I sammenligning med kontrol, et dramatisk behandlingseffekt blev identificeret på H & E-farvning:. Tab af epitelceller omgiver områder af cystisk ændring /degeneration og områder med forøget fibrose. Et fald i Ki67 farvning og fosforylering af AKT, er RPS6 og ERK1 /2 også set. Scale bar for lavt forstørrelse billeder = 1 mm. Høje forstørrelse paneler er 10x forstørrelser af de områder, der er angivet med rektangler.
Diskussion
PI3K pathway stadig et mål af interesse for udviklingen af nye terapeutiske strategier for mange kræftformer givet betydningen af denne vej for flere vitale cellefunktioner [18]. Det er en af de mest almindeligt afvigende veje i kræft [7]. PI3K delta hæmmere, såsom idelalisib, er blevet anvendt med succes til behandling af blodkræftsygdomme [19]. I solide tumorer, alfa- og beta-isoformer er de fremherskende mediatorer af PI3K signalering, med minimale bidrag fra gamma- eller delta-isoformer. Reaktion på PI3K alfa selektive og pan-hæmmere er blevet observeret i visse indstillinger [20]. Flere tidlige fase kliniske studier undersøger brugen af disse midler i fastsættelsen af
PIK3CA
mutationer [21-23]. For nylig, i en fase I klinisk forsøg en delvis respons blev set i en kolorektal cancer patient behandlet med LY3023414, en dobbelt PI3K /mTOR-hæmmer [24]. Men det bidrag, som
PIK3CA
mutation til biologi disse kræftformer har været under-undersøges, og population af patienter med størst sandsynlighed vil drage fordel af disse midler er endnu ikke fastlagt. Dette gælder især for tarmkræft hvor
PIK3CA
mutationer er mest almindeligt menes at være en sen begivenhed i tumorigenese og den potentielle fordel fra PI3K pathway hæmning er usikker.
Først for nylig har virkningerne af en dominerende aktiv PI3K pathway blevet udforsket i pattedyrs tarmen. Vores gruppe var den første til at beskrive udviklingen af hyperplasi og invasive mucinøse adenokarcinomer udviklingslande i den proksimale colon som følge af ekspressionen af en dominerende aktiv PI3K (
Pik3ca
p110 *
) [10]. De kræftformer i denne model udviklet gennem en ikke-kanonisk vej uden identifikation af en polypoid mellemmand og uden aktivering af WNT signalering. At afgøre, om lignende tumorer kunne indledes i fastsættelsen af et hotspot mutation i
PIK3CA
almindeligt stødt i humane kræftformer, udviklede vi den
Fc
+
Pik3ca
H1047R
musemodel. Her demonstrerer vi, at
Pik3ca
H1047R
mutation resulterer i hyperplasi og udvikling af mucinøse adenokarcinomer i tyktarmen skelnes fra
Fc
+
Pik3ca
p110 *
mus. Den fremherskende forskel mellem disse to modeller er latensen i hvilken disse tumorer udvikle sig. I
Fc
+
Pik3ca
p110 *
model, ~ 75% af musene havde invasive kræftformer med 40 dage af alder [10], mens der i
Fc
+
Pik3ca
H1047R
mus ingen tumorer blev identificeret ved 50 dage gamle, og kun 65% af musene havde tumorer ved obduktion (alder 97-310 dage). Disse kræftformer synes at udvikle gennem en lignende mekanisme med aktivering af PI3K pathway og uden aktivering af WNT signalering. Den øgede ventetid i udviklingen af kræft i
Fc
+
Pik3ca
H1047R
mus synes relateret til et lavere niveau af aktivering af PI3K pathway sammenlignet med
Fc
+
Pik3ca
p110 *
mus.
Interessant nok blev forøget ERK1 /2 phosphorylering observeret i både
Fc
+
Pik3ca
p110 *
Fc
+
Pik3ca
H1047R
tumorer sammenlignet med
Apc
Min
kolon tumorer. I disse cancere synes det ikke at være en mekanisme af resistens over for PI3K pathway inhibering, selv om dette er blevet påvist i visse miljøer [25, 26]. Aktivering af ERK1 /2 signalering er blevet observeret i andre modeller med
PIK3CA
mutationer herunder
PIK3CA
mutant bryst og pancreascancer [27, 28]. Aktivering af ERK1 /2 synes at være stort set uafhængig af RAS i disse
Pik3ca
mutant tumorer [27]. Den er i stedet potentielt medieret af Rac1 /CRAF /MEK /ERK-vejen. Phosphorylering af ERK1 /2, i modellerne præsenteres her, er sandsynligvis nedstrøms for PI3K-signalering, da det er formindsket med PI3K /mTOR inhibering.
Vi hypotesen, at der er en subpopulation af patienter, der har cancere indledt af eller afhængig af PI3K signaleringskaskade. De kræftformer i dette subpopulation kan være særdeles modtagelige for mange af de hidtil ukendte PI3K-inhibitorer ligner NVP-BEZ235. I en nylig patologisk serie, aktiverende mutationer i
PIK3CA
blev observeret oftere hos mucinøse tyktarmskræft hos mennesker, der ligner vores model, og var forbundet med forværret prognose [29]. Interessant i denne samme undersøgelse, aktiverende mutationer i
PIK3CA
blev omvendt forbundet med den nukleare translokation af β-catenin [29]. Translokation af β-catenin kunne forventes, hvis disse tumorer blev initieret ved aberrerende WNT signalering som en del af de tidligere beskrevne kanoniske mekanismer tumorigenese i tyktarmskræft [30]. Tilsammen disse observationer tyder på, at en undergruppe af humane kolon kræft kan opstå i fastsættelsen af PI3K, som det ses i vores model.
Støtte Information
S1 Fig. Yderligere eksempler på baseline og efter behandling 18F-FDG PET /CT-scanninger af
Fc
+
Pik3ca
H1047R
. mus behandlet med NVP-BEZ235 (35 mg /kg /dag) eller kontrol én gang dagligt ved oral sondeernæring i 14 dage
pile betegne tumorer før og efter behandling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0148730. S001
(PDF)
S1 tabel. Karakteristik af
Apc
Min /+
,
Fc
+
Pik3c
en
p110 *
, og
Fc
+
Pik3ca
H1047R
mus.
doi : 10,1371 /journal.pone.0148730.s002
(PDF)
S2 tabel. Forbehandling volumen af tumorer afbildet med PET /CT
doi:. 10,1371 /journal.pone.0148730.s003
(PDF)
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.