PLoS ONE: aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1) er en potentiel markør for Cancer Stamceller i Embryonale Rhabdomyosarcoma

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) defineres som en lille population af kræftceller med egenskaberne for høj selvfornyelse, differentiering, og tumor-initierende funktioner. Nyere undersøgelser har vist, at aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) er en markør for CSCS hos voksne kræftformer. Selvom CSCS er blevet identificeret i nogle forskellige typer af pædiatriske solide tumorer, har der ikke været nogen undersøgelser vedrørende effekten af ​​ALDH1 som markør for CSCS. Derfor, for at belyse, om ALDH1 kan anvendes som en markør for CSCS af pædiatrisk sarkom, vi undersøgte karakteristika for en population af celler med en høj ALDH1 aktivitet (ALDH1

høje celler) i rhabdomyosarcom (RMS), den mest fælles bløddelssarkom hos børn. Vi brugte de menneskelige embryonale RMS (ERMS) cellelinier RD og Kym-1, og sorteres cellerne i to subpopulationer af ALDH1

høje celler og celler med lav ALDH1 aktivitet (ALDH1

lave celler). Derfor fandt vi, at de ALDH1

høje celler omfattede 3,9% og 8,2% af den samlede cellepopulation, henholdsvis og viste en højere kapacitet til selv-fornyelse og tumordannelse end ALDH1

lave celler. Med hensyn til kemoresistens blev overlevelsesraten for de ALDH1

høje celler sig at være højere end for de ALDH1

lave celler efter behandling med kemoterapeutiske midler til RMS. Endvidere ALDH1

høje celler udviste en højere grad af pluripotens og genekspression af Sox2, som er en af ​​de stamcellemarkører. Tilsammen de ALDH1

høje celler besad karakteristika CSCS, herunder kolonidannelse, kemoresistens, differentiering og tumor initiation evner. Disse resultater antyder, ALDH1 er en potentielt nyttig markør for CSCS i Erms

Henvisning:. Nakahata K, Uehara S, Nishikawa S, Kawatsu M, Zenitani M, Oue T, et al. (2015) aldehyddehydrogenase en (ALDH1) er en potentiel markør for Cancer Stamceller i embryonale rhabdomyosarcoma. PLoS ONE 10 (4): e0125454. doi: 10,1371 /journal.pone.0125454

Academic Redaktør: David M. Loeb, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: 26 september, 2014 Accepteret: 21 marts 2015; Udgivet: 27 April, 2015

Copyright: © 2015 Nakahata et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af JSP’er KAKENHI Grant Number 23592630 (SU) og 25.861.668 (KN). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft stamceller-lignende celler (CSCS) defineres som en lille population af kræftceller med egenskaberne af høj tumor-igangsættende, selv-fornyelse og differentiering funktioner [1]. Desuden CSCS er resistente over for standardbehandlinger, såsom kemoterapi og strålebehandling, og dermed ansvarlig for tumor tilbagefald efter behandling samt invasion og metastase [2, 3].

rhabdomyosarcoma (RMS) er den mest almindelige bløddelssarkom hos børn. Trods betydelige forbedringer i overlevelsen i de seneste årtier, mere end en tredjedel af RMS patienter fortsat dø af sygdommen [4]. Patienter med metastatisk eller refraktære tumorer udviser en særlig alvorlig prognose [5]. Forstærke konventionelle regimener har ikke signifikant forbedret overlevelse, og forskning for CSCS af RMS er meget vigtigt for at forbedre prognosen, da disse celler formodes at inducere tilbagefald og metastase. Selvom CD133 (prominin-1) er blevet rapporteret at være en markør for CSCS [6], den findes også på normale stamceller, og det er nødvendigt at identificere andre markører for RMS.

Nylige undersøgelser har vist, at aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1) er en markør for CSCS hos voksne cancere [7, 8, 9]. Selvom CSCS er blevet identificeret i mange forskellige typer af pædiatriske solide tumorer [10, 11], der er i øjeblikket ingen undersøgelser vedrørende effekten af ​​ALDH1 som markør for CSCS inden for pædiatrisk onkologi.

I denne undersøgelse vi hypotese, at en delpopulation af celler med en høj ALDH1 aktivitet (ALDH1

høje celler) ville vise karakteristika CSCS i RMS og efterfølgende undersøgt karakteristika ALDH1

høje celler i embryonale RMS (ERMS). Vi analyserede embryonale RMS cellelinjer under anvendelse af en ALDEFLUOR assay og fandt, at ALDH1

høje celler havde karakteristika CSCS, herunder kolonidannelse, kemoresistens og tumorinitiering evner, og vurderede mRNA ekspression af ALDH1 isoformer, onkogen og stemness gen.

Materialer og metoder

Cell linje og cellekultur

Den menneskelige embryonal rhabdomyosarcoma cellelinie, RD og KYM-1 blev opnået fra ATCC (Manassas, VA, USA) og JCRB (Ibaraki, Japan), hhv. Cellerne blev holdt i RPMI-1640-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) og dyrket i en befugtet 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C.

ALDEFLUOR assay

aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet blev detekteret ved anvendelse af et ALDEFLUOR assaykit (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev cellerne farvet med BODIPY-aminoacetaldehyd (Baaa) og inkuberet i 40 minutter ved 37 ° C. En specifik inhibitor af ALDH1, diemethylamino-benzaldehyd (DEAB), blev anvendt til at kontrollere for baggrundsfluorescens. De farvede celler blev analyseret ved anvendelse af FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og sorteres i ALDH1

høje celler, der blev fundet på den grønne fluorescens kanal (515-545 nm), og en subpopulation af celler med et lavt ALDH1 aktivitet (ALDH1

lave celler). Dataene blev analyseret ved anvendelse af FACS DIVA softwareprogram (BD Biosciences). For at udelukke ikke-levedygtige celler, blev 7-AAD (BD Biosciences) tilsat ved en slutkoncentration på 0,25 ug /ml.

Kolonidannelse assay

De sorterede celler blev suspenderet i 10 ml RPMI-1640 og 10% FBS og 1 x 10

4-celler blev udpladet i dyrkningsskåle med 3 ml methylcellulose indeholdende RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, ifølge protokollen af ​​Rahadiani et al. [8]. Cellerne blev farvet med krystalviolet (0,05% vægt /volumen), for at visualisere kolonier, og antallet af kolonier blev talt efter to måneder.

Cellelevedygtighed assay

For at vurdere cellernes levedygtighed blev de sorterede celler udpladet med 5 x 10

3 celler pr plader med 96 brønde (Corning, Corning, NY, USA) i én dag og derefter inkuberet med forskellige koncentrationer af vincristin, cyclophosphamid og etoposid (Wako, Osaka, Japan ) i tre dage. Efterfølgende blev graden af ​​cellelevedygtighed undersøgt ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) ifølge producentens protokol.

adipocytdifferentiering assay

I den adipocytdifferentiering assay de sorterede celler blev udpladet ved en densitet på 1 x 10

4 celler pr plade med 6 brønde (Corning, Corning, NY, USA) med 0,1% DMSO i tre dage. Efter otte dage i RPMI indeholdende 1 ug /ml insulin, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthin, 10 mM dexamethason, 1% penicillin /streptomycin og 10% FCS, blev neutralt lipid akkumulering påvises i celler fikseret i 10% formaldehyd faste celler ved hjælp Oil Red O (Wako, Osaka, Japan) i henhold til protokollen af ​​Hwang et al. [12].

Neurogenese assay og immunofluorescens

I den neurogenese assay de sorterede celler blev udpladet ved en densitet på 1 x 10

4 celler pr plade med 6 brønde og behandlet med 100 nM ATRA (all-trans-retinsyre, Wako, Osaka, Japan). Efter tre uger blev cellerne farvet med NCAM (1/200) (123C3, monoklonale, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) via immunofluorescens ifølge protokollen af ​​Walter et al. [6], og kernerne blev modfarvet med DAPI (Dojindo).

I immunfluorescensfarvning blev de sorterede celler fikseret i 4% PFA og blokeret i medium indeholdende 3% BSA og 0,1% Triton X-100 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). De sorterede celler blev farvet natten over ved 4 ° C, og Alexa Fluor 488 ged anti-mus IgG (1/1000) (A11001, Life Technologies) antistoffer blev anvendt som sekundære antistoffer. Alle farvning resultater blev analyseret med BZ-9000 enhed (KEYENCE, Osaka, Japan).

xenograft transplantation

De sorterede celler blev opsamlet og resuspenderes i en koncentration på 10

2- 10

4 celler pr 100 pi RPMI-1640 og derefter blandet med 100 pi Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Celle-Matrigel blanding blev efterfølgende injiceret i det subkutane rum i 4 uger gamle ikke-obese diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus (NOD. CB17-Prdkc

scid /J, Charles River Laboratory , Yokohama, Japan) under generel anæstesi. Tumorvækst blev overvåget hver anden dag og kontrolleres, hvis de tumorer blev dannet i to måneder

Forsøgene blev revideret og godkendt af dyreforsøg udvalg Osaka University. (Tilladelse nummer: 23-080-004), og udføres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Immunhistokemi

xenotransplantattumorer af mus og de kliniske prøver blev indlejret i paraffin, faste og analyseret for hæmatoxylin, myogenin (1/200) (5FD , polyklonale, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), desmin (1/200) (H-76, polyklonale, Santa Cruz Biotechnology) og ALDH1 (1/200) (44 /ALDH, monoklonale, BD Biosciences) farvning under anvendelse immunhistokemi (IHC). Som et sekundært antistof blev peberrodsperoxidase (HRP) -mærket kanin-anti-muse-antistoffer (Dako, Glostrup, Danmark), der anvendes. Resultaterne af farvning blev visualiseret med EnVision + Single Reagent-Kit (Dako).

Kvantitativ realtids-PCR-analyse

Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved anvendelse af AB7900HT enhed (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) for at bestemme den relative ekspression af ALDH1 gener (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 og ALDH1L2), ABC transportør gener (ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 og ABCA2), onkogen (c-myc ) og stemness markør (Sox2).

Samlet RNA blev ekstraheret ved anvendelse NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland). Revers transkription blev udført under anvendelse af PrimeScript RT Master Mix (Takara, Shiga, Japan) ifølge producentens protokol.

Real-time PCR reaktioner blev udført i triplikater under anvendelse af Platinum SYBR Green Super Mix med ROX (Life Technologies) på AB7900HT. Husholdning gen, glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), tjente som en intern kontrol, som det udtrykkes stabilt i forskellige væv. Tabel 1 angiver de anvendte primere til real-time PCR. De Ekspressionsniveauerne blev beregnet på grundlag af 2

-ΔΔCT metode.

Statistisk analyse

De statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism6 softwarepakke (GraphPad Software, La Jolla , CA, USA).

P

værdier af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant ifølge Fishers eksakte test for xenograft transplantation og den studerendes

t

-test for de andre eksperimenter

Resultater.

Detection og karakteristika ALDH1

høje celler som CSCS i RD og Kym-1 celler

Vi har forsøgt i første omgang at identificere ALDH

høje celler i RD og Kym-1 celler under anvendelse af et ALDEFLUOR assay. I RD-celler, forholdet mellem ALDH1

høje celler farvet med Baaa var 4,1%, mens den for de, farvet med Baaa og DEAB som en negativ kontrol var 0,2%. Derfor er den ægte forhold mellem ALDH1

høje celler var 3,9% af alle dyrkede RD-celler (Fig 1A). Tilsvarende er forholdet mellem ALDH1

høje celler var 8,2% i KYM-1-celler (Fig 1B)

RD (A) og KYM-1 (B) celler blev farvet med DEAB (kontrol.: venstre panel) eller uden DEAB (højre panel) efter at være blevet farvet med Baaa og derefter analyseret ved anvendelse af FACS Aria II med ALUDEFLUOR assaykit. Andelen af ​​ALDH1

høje celler var 3,9 ± 0,26% i RD-celler og 8,2 ± 0,14% i de KYM-1-celler. Middelværdien ± SD blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Alle ALDH1

høje celler og en delmængde af de ALDH1

lave celler blev sorteret som vist i de rigtige paneler af fig 1A og 1B.

Næste, vi udførte en koloni formation assay til dokumentere selvfornyelse kapacitet i ALDH1

høje celler og ALDH1

lave celler. Derved også antallet af kolonier af ALDH1

høje celler var højere end den for ALDH1

Lav celler (30,3 vs. 14,5 kolonier /brønd, henholdsvis p 0,05) (fig 2A og 2B). De ALDH1

høje celler, derfor havde større kolonidannelse evne end ALDH1

lave celler.

A, Colony formation assay. Antallet af kolonier, der var makroskopisk synlige, afledt af ALDH1

høj og ALDH1

lave celler af RD-celler, blev talt og scorede til to måneder efter plantning. Den gennemsnitlige ± SD blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg (ni boringer for ALDH1

høje eller ALDH1

lave celler i alt). De ALDH1

høje celler dannet betydeligt flere kolonier end ALDH1

lave celler. B, er repræsentative billeder af kolonier vist i venstre panel (ALDH1

høj) og højre panel (ALDH1

lav).

Med hensyn til kemoresistens undersøgte vi overlevelsesraten for de ALDH1

høje celler i RD-celler og KYM-1-celler dyrket med vincristin, cyclophosphamid og etoposid hjælp af Cell Counting Kit-8 (WST-8 assay). Den levedygtighed ALDH1

høje celler efter dyrkning med vincristin, cyclophosphamid og etoposid var signifikant højere end de ALDH1

lave celler behandlet med disse kemoterapeutiske midler, hvilket tyder på, at de ALDH1

høje celler besad en højere kapacitet for kemoresistens end ALDH1

lave celler (fig 3).

ALDH1

høje og ALDH1

lave celler af RD (A) og KYM-1 celler (B) blev behandlet med 100 nM-10 pM vincristin, 5 mM-15 mM cyclophosphamid og 10 pM-100 pM etoposid og cellelevedygtigheden blev målt efter 72 timer ved anvendelse af et WST-8 assay. Levedygtighed af de “ingen behandling” celler blev også målt som en kontrol. Middelværdien ± SD blev beregnet ud fra tredobbelte brønde af et repræsentativt eksperiment, og dataene for tre uafhængige forsøg er vist i figuren. Den levedygtighed ALDH1

høje celler var signifikant højere end de ALDH1

lave celler.

Som CSCS er blevet dokumenteret at udstille pluripotens, vi analyserede differentiering evne ALDH1

høje celler til adipocytter og nerveceller i RD-celler. De ALDH1

høje celler viste sig at være rigere med lipiddråber farvet med Oil Red O end ALDH1

lave celler (Fig 4A), og positive farvninger blev observeret for NCAM i ALDH1

høje celler, vejledende af neuronal differentiering (fig 4B). Disse resultater indikerer, at ALDH1

høje celler af RD-celler har evnen til at differentiere til adipocyter og neuronale celler, hvilket indikerer potentiel pluripotens.

A, adipocytdifferentiering assay. De ALDH1

høje og ALDH1

lave celler af RD-celler blev dyrket i en adipocytdifferentiering medium. Analysen blev gentaget tre gange, og repræsentative billeder af Oil Red O farvning er vist i venstre panel (ALDH1

høj) og i højre panel (ALDH1

lav) (× 40). Lipiddråber af adipocyter farvet røde med Oil Red O. B, Neuronal celledifferentiering assay. De ALDH1

høje og ALDH1

lave celler af RD-celler blev behandlet med 100 nM retinsyre og farvet for NCAM (grøn). Kernerne blev modfarvet med DAPI (blå). Analysen blev gentaget tre gange, og repræsentative billeder af immunfluorescensfarvning vises i venstre panel (ALDH1

høj) og i højre panel (ALDH1

lav).

Tumoren -initiating evne ALDH1

høje celler i RD-celler blev undersøgt ved injektion 1 × 10

2, 1 × 10

3 og 1 × 10

4 ALDH1

høje celler i NOD /SCID-mus; ALDH1

lave celler blev også injiceret på samme måde. Derfor blev tumordannelse observeret i to af de syv mus injiceret med 1 × 10

3 ALDH1

høje celler og fem af de seks mus injiceret med 1 × 10

4 ALDH1

høje celler, mens ingen tumorer blev fundet i mus injiceret med ALDH1

lave celler ved enten celletæthed (p 0,05, tabel 2 og figur 5A). Disse resultater viser, at ALDH1

høje celler har en signifikant højere tumor-initierende evne end ALDH1

høje celler.

A, repræsentativt billede af en tumor-bærende NOD-SCID mus. (Til højre: ALDH1

høje celler, venstre: ALDH1

lave celler). B-D, Immunohistokemisk (IHC) farvning af xenograft tumorsektioner. Snittene blev farvet for hematoxylin, myogene markører (desmin (B), myogenin (C)) og ALDH1 (D). De tumorceller var positive for desmin og myogenin mens kun nogle få celler var positive for ALDH1, hvilket tyder på, at ALDH1

høje celler fremmes rabdomyosarkom og blev rekonstitueret at indarbejde hele spektret af heterogenitet.

ALDH1

høje celler demonstrerede en højere tumor-initierende evne end ALDH1

høje celler. Data fra to uafhængige forsøg samlet.

Dernæst udførte vi immunhistokemiske (IHC) farvning af xenograft tumor dele af ALDH1

høje celler. Disse celler blev farvet positive for myogene markører (desmin, myogenin) og ALDH1 (Fig 5B-5D). Tumorcellerne var positive for desmin og myogenin, mens kun nogle få celler var positive for ALDH1, hvilket antyder, at ALDH1

høje celler fremmes rhabdomyosarcom og blev rekonstitueret til at optage den fulde heterogenitet.

Taget sammen, vi konkluderede, at ALDH1

høje celler er beriget med CSCS af RD og KYM-1 celler.

de mRNA niveauer af ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2, ABCB1, ABCG2 og Sox2 blev opreguleret i ALDH1

høje celler af RD-celler

Desuden har vi undersøgte ekspressionsniveauerne af flere medlemmer af ALDH1 familien (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 og ALDH1L2) i RD-celler. Som følge heraf blev ekspressionsniveauerne af ALDH1A3, ALDH1B1 og ALDH1L2, men ikke ALDH1A1, i ALDH1

høje celler steget i forhold til den observeret i ALDH1

lave celler (Fig 6A).

En kvantitativ realtids-PCR-analyse blev udført for at vurdere ekspressionsniveauerne af ALDH1 (A), stemness markører (B) og ABC transportører (C). Gennemsnit ± SE blev beregnet ud fra tredobbelte brønde af et repræsentativt eksperiment, og dataene for en af ​​tre uafhængige forsøg er vist i figuren. Udtrykket af ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2, Sox2 og ABC transportører var signifikant højere i ALDH1

høje celler end i ALDH1

lave celler (p 0,01).

Næste, det undersøgt om ALDH1

høje celler er beriget for ekspressionen af ​​gener menes at spille en vigtig rolle i stemness, såsom c-myc og Sox2. Kvantitativ realtids-PCR viste en øget ekspression af Sox2 i ALDH1

høje celler i forhold til ALDH1

lave celler, hvorimod ingen signifikante stigninger i ekspressionen af ​​c-myc (Fig 6B).

De relative ekspressionsniveauer af tre store narkotika transportører ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 og ABCA2 blev også undersøgt. Interessant, ALDH1

høje celler viste en øget udtryk af alle transportører, hvilket tyder på, at ALDH1

høje celler har en højere capaciity for kemoresistens end ALDH1

lave celler (Fig 6C).

Diskussion

begrebet CSCS har været længe foreslået [13]. CSCS defineres af to vigtige egenskaber, forbedret tumorigenicitet og kapaciteten til selv-fornyelse /differentiering [14]. Derfor er den isolerede CSC befolkning giver ikke kun anledning til de novo tumorer med høj effektivitet, men også rekapitulerer tumoren med både CSC og ikke-CSC populationer. Desuden fleste CSCS udvise resistens over for konventionelle anti-cancer behandlinger ved hjælp kemoterapeutiske stoffer og ioniserende stråling [2]. Til dato har CSCS blevet identificeret i forskellige maligniteter, herunder akut myeloid leukæmi [15], hjernetumorer [16], hepatocellulært carcinom [17], brystcancer [7], lungecancer [18], pancreascancer [19] og ovarie cancer [8].

ALDH enzymer udgør en familie af enzymer bestående af 19 isoformer lokaliseret i cytoplasmaet, mitokondrier og kerne. ALDHs er ansvarlige for oxiderende aldehyder til carboxylsyrer. Mens mange aldehyder spiller en kritisk rolle ved fysiologiske processer, såsom syn, neurotransmission og fosterudvikling, de fleste aldehyder er cytotoksiske og skal afgiftes, som gennemgået af Marchitti et al [20].

En bredt accepteret metode til identificere CSCS er baseret på påvisning af enzymatiske aktivitet af ALDH1, en afgiftende enzym ansvarlig for oxidationen af ​​intracellulære aldehyder. Den høje aktivitet af ALDH1 i CSCS er blevet anvendt til at isolere CSCS i forskellige maligniteter [6, 7, 8, 16, 18, 21, 22]. Derfor ALDH1

høje celler viser funktioner typisk findes i CSCS, herunder selvfornyelse, differentiering og høje tumor-initierende evner.

Vi bekræftede, at ALDH1

høje celler i RD og KYM- 1-celler besidder karakteristika CSCS og i et andet forsøg under anvendelse af RMS-YM-celler, en Erms cellelinie undersøgte vi ALDH aktivitet. I modsætning til den observeret i RD og Kym-1-celler, der blev ikke konstateret ALDH1

høje celler. Dernæst CSCS er blevet dokumenteret at have evnen til at danne kugler, undersøgte vi kugle-dannende evne af disse celler. Følgelig RD og KYM-1 celler dannede store kugler, mens RMS-YM celler ikke danne sfærer i serum-frit medium (data ikke vist). Disse resultater styrke vores hypotese, at ALDH1

høje celler besidder karakteristika CSCS.

Ifølge Lohberger et al. [23] og Awad et al. [24], ALDH1

høje celler er typisk isoleret fra humane sarkom cellelinier (fibrosarkom, liposarkom, synovial sarkom, chondrosarcoma, og Ewings sarkom). Deres undersøgelse viste, at ALDH1

høje celler er karakteriseret ved en høj grad af spredning, kolonidannelse og udtryk for ABC transportør gener og stemness markører (β-catenin, Sox2 og Nanog). I den aktuelle undersøgelse, ALDH1

høje celler udviste kolonidannelse, samt en øget genekspression af ABC transportører (ABCB1, ABCG2 og ABCA2) og stemness markører (Sox2). Derfor er vores data antyder, at ALDH1 er også en potentiel markør for CSCS i Erms.

ALDEFLUOR assay blev udviklet for at detektere aktivitet af ALDH1 isoformen ved med held at isolere levedygtige stamceller hæmatopoietiske fra humant navlestrengsblod [25 ] og er blevet rapporteret at være specifikke for ALDH1 isoformen fundet i høj overflod i disse celler, ALDH1A1 [26]. Men mens andre individuelle ALDH isoformer gøre vise nogle foretrukne substrat specificitet, de også udviser krydsreaktivitet, hvilket gør det sandsynligt, at ALDEFLUOR analysen registrerer ALDH1 aktiviteten af ​​flere ALDH isoformer udtrykt i cellerne [27]. I den foreliggende undersøgelse, udtryk for ALDH1A3, ALDH1B1 og ALDH1L2 i ALDH1

høje celler blev øget, mens den for ALDH1A1, som menes at spille en vigtig funktionel rolle i stamceller, ikke var steget i ALDH1

høje celler. Marcato et al. [28] rapporterede, at en øget ALDH aktivitet i brystcancerceller stamceller skyldes virkningerne af isoform ALDH1A3, mens Chen et al. [29] rapporterede, at ALDH1B1 er mere dybt udtrykt i adenocarcinomer end ALDH1A1, selvom funktionen og den cellulære lokalisering af ALDH1L2 fortsat ukendt. Da vores data er i overensstemmelse med disse resultater, kan CSCS af RD-celler også har lignende specifikationer som epitel tumorceller.

En foreslået mekanisme for kemoresistens af CSCS er baseret på den forøgede ekspression af ATP-bindende kassette (ABC) transportproteiner, som er ansvarlige for narkotika efflux [30]. En høj ekspression af ABC transportører i stamceller sammenlignet med ikke-stamceller resulterer i relativ modstand af stamcellerne til de toksiske virkninger af kemoterapi narkotika. I denne undersøgelse, analyserede vi udtryk for tre narkotika transportører (ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 og ABCA2) af ABC transportør familie og fundet, at alle ABC transportører blev opreguleret i ALDH1

høje celler fra RD. Desuden viste ALDH1

høje celler den forøgede modstand mod vincristin, cyclophosphamid og etoposid, der almindeligvis anvendes som kemoterapeutiske medikamenter af rhabdomyosarcoma. Faktisk vi udførte immunhistokemi ved hjælp af de eksemplarer af Erms, operativt fjernede før og efter kemoterapi, og fandt, at enhederne resekteres efter kemoterapi udstillet en større cytoplasmatisk ALDH1 udtryk end de primære eksemplar (Fig 7A og 7B).

biopsi eksemplar af Erms opnåede forud for kemoterapi (A), og de resektion prøver opnået efter kemoterapi (B) farvede positiv for ALDH1 på immunhistokemi. Disse prøver blev taget fra vagina-stammer Erms væv af en 1-årig pige. De enheder reseceret efter kemoterapi udviste en større cytoplasmatisk ALDH1 ekspression end de primære biopsiprøve.

Disse data antyder, at højere ekspression af ABC transportør observeret i de ALDH1

høje celler forårsager kemoresistens. Desuden er disse resultater ligner side population celler (SP-celler), der udtrykker forskellige ABC transportører ansvarlige for medikamentresistens, herunder ABCG2 (BRCP) [31]. Komuro et al. [32] rapporterede SP-celler blev påvist i RD anvendelse af FACS med Hoechst farvestof. Faktisk ifølge Yasuda et al. [33], SP celler og ALDH1

høje celler overlapper i æggestokkene cancer stamceller. Derfor kan populationer af SP-celler og de ALDH1

høje celler overlapper i rhabdomyosarcom samt.

Dette er den første undersøgelse for at dokumentere, at ALDH1 kan anvendes som en markør for RMS. Vi brugte også en alveolære RMS (våben) cellelinje (RH30) og undersøgte ALDH aktivitet. Selv blev detekteret ALDH1

høje celler RH30 celler, uventet de ALDH1

høje celler af våben ikke danne kolonier eller kugler (data ikke vist). En sandsynlig forklaring på dette fænomen er, at de to store RMS undertyper skyldes forskellige celler oprindelseslande på grund af de betydelige kliniske og biologiske forskelle mellem dem, som tidligere rapporteret af Pressey et al. [34]. Vi er i øjeblikket planer om at undersøge, om ALDH1 kan bruges som en markør i andre våben cellelinjer.

I de seneste år, forskning i inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) har gjort hurtige fremskridt og er blevet anvendt på marken onkologi. Oshima et al. [35] rapporterede dannelsen af ​​inducerede CSCS (iCSCs) ved at indføre definerede faktorer (Oct3 /4, Sox2 og Klf4) i humane kolorektale cancer cellelinjer. Som følge heraf blev ekspressionsniveauerne af ALDH1 steget i de iCSCs. Derfor kan ALDH1 være relateret til CSC egenskaber og funktion som et nyttigt værktøj for forskning i CSCS. Selv teorien cancerstamceller forbliver kontroversiel [36], vores resultater støtter eksistensen af ​​CSCS i Erms, og vi mener, at ALDH1 kan være anvendelige til påvisning CSCS som et terapeutisk mål.

Som konklusion bekræftede vi at de ALDH1

høje celler af Erms besidder karakteristika CSCS, herunder kolonidannelse, kemoresistens og tumorinitiering evner. Disse resultater antyder, ALDH1 er en potentielt nyttig markør for CSCS i Erms.