PLoS ONE: Prostata Cancer Associated Lipid signaturer i Serum studeret af ESI-Tandem Mass Spectrometryas Potentielle nye biomarkører

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) er en blandt de mest almindelige cancersin vestlige mænd. Incidensrate ofPCa er stigende på verdensplan. Nærværende undersøgelse omhandler theserum lipidome profilering af patienter diagnosticeret med PCa at identificere potentielle nye biomarkører. Vi ansat ESI-MS /MS og GC-MS til identifikation af signifikant ændrede lipider i kræft patientens serum sammenlignet med kontroller. Lipidomic data viste 24 lipider ændres væsentligt i kræft patinet serum (n = 18) i forhold til normal (n = 18) med ingen historie PSA. Ved at bruge hierarkisk klyngedannelse og principal komponent analyse (PCA) vi kunne tydeligt adskilte kræftpatienter fra kontrolgruppen. Korrelation og partition analyse sammen med Formel Concept Analysis (FCA) har identificeret, at PC (39: 6) og FA (22: 3) kunne klassificere prøver med højere sikkerhed. Både lipider, PC (39: 6) og FA (22: 3) kunne påvirke katalogisering af patienter med 100% sensitivitet (alle 18 kontrolprøver klassificeres korrekt) og 77,7% specificitet (af 18 tumorprøver 4 prøver fejlklassificeres) med

s

-værdi på 1,612 × 10

-6 i Fischers eksakte test. Endvidere udførte vi GC-MS for at betegne fedtsyrer ændret i PCA patienter og fandt, at alfa-linolensyre (ALA) niveauer ændres i PSA. Vi udførte også en

in vitro

proliferation assay til bestemmelse af virkningen af ​​ALA i overlevelse af klassiske humane PCA cellelinier LNCaP og PC3. Vi rapporterer hermed, at den ændrede lipider PC (39: 6) og FA (22: 3) tilbyder et nyt sæt af biomarkører i tillæg til de eksisterende diagnostiske test, der væsentligt kunne forbedre sensitivitet og specificitet i PCa diagnosen

. Henvisning: Duscharla D, Bhumireddy SR, Lakshetti S, Pospisil H, Murthy PVLN, Walther R, et al. (2016) Prostata Cancer Associated Lipid signaturer i Serum studeret af ESI-Tandem Mass Spectrometryas Potentielle nye biomarkører. PLoS ONE 11 (3): e0150253. doi: 10,1371 /journal.pone.0150253

Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, UNITED STATES

Modtaget: 10 juni, 2015; Accepteret: 11 februar 2016; Udgivet: 9 mar 2016

Copyright: © 2016 Duscharla et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. projektet er støttet af Institut for Bioteknologi (DBT), Ministeriet for Videnskab of Technology, Indien. Grant No: 6242-P- 54 /RGCB /PMD /DBT /RHUN /2015. DD anerkender Rådet for videnskabelig og industriel forskning (CSIR), Indien for CSIR-JRF fællesskab og AcSIR til registrering som kandidatstuderende

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser: PCA, prostata kræft; ALA, Alpha linolensyre; ESI-MS, Electrospary ionisationsmassespektrometri; GC-EIMS, Gas kromatografi med elektron ionisationsmassespektrometri

Introduktion

På trods af de store fremskridt, der er opnået i diagnosticering og behandling af PCa, stadig det er den næstmest årsag til kræft-relaterede dødsfald, næste til lungekræft blandt mænd [1]. Obduktion undersøgelser har vist, at 30% af mænd over 50 år og 80% af mænd over 70 år har tegn på forekomst PCa [2]. Tidlig diagnose og aggressiv behandling er den eneste mulighed for at helbrede PSA. Biomarkører spiller en vigtig og afgørende rolle i tidlig diagnosticering af PSA. Til dato, screening af til PCA omfatter digital rektal undersøgelse (DRE) og det specifikke antigen (PSA) blodprøve prostata. Men disse to tests er i brug for PCa diagnosen er sub-optimale, fordi PSA rigeligt produceret af prostata epitel og også udskilles af epitelet af periurethrale kirtler. PSA-ekspression er ikke specifikt for vævet eller køn, vil det blive udskilt af både godartede og cancerceller af prostata [3]. Avancerede “omik” teknologier har identificeret ændret genom, transkriptom- og proteomanalyse relateret til PSA. Disse undersøgelser har givet en række potentielle genomiske og proteomiske biomarkører for diagnostiske formål. Men ingen af ​​disse markører omsættes til rutinemæssige diagnostiske og /eller prognostiske anvendelser. Derfor er der utallige muligheder for enten mere end diagnosticering af patienter med begrænset potentiale for kræft eller under diagnosticering af patienter, der allerede lider af sygdommen. Således mangler nuværende diagnostiske metoder for prostata sygdomme understreger behovet for forbedringer på dette område.

Diagnosticering kræft baseret på serum profilering er en attraktiv koncept. En række undersøgelser har beskæftiget proteomisk og genomisk analyse af serumprøver fra cancerpatienter. Kun sparsomme oplysninger er tilgængelige på metabolomet ændringer særligt lipid sammensætning i serum /plasma i forbindelse med PSA. Unormal lipidmetabolisme har vist sig at være associeret med mange sygdomme, såsom inflammation, diabetes, nyre- og hjertesvigt samt mange cancere; hvilket således indikerer, at lipidmetabolitter kunne anvendes som sygdomstilstande biomarkører [4]. Desværre, til vores bedste viden, kun få rapporter er blevet fundet analysere lipider fra PCA patienter er forbundet med sygdomsprogression. Et studie rapporterede, at apolipoprotein og cholesterol sammen diagnosticeret ovariecancer med 97% nøjagtighed [5]. I colorektal cancer, ændret linolsyre (LA), alfa-linolensyre (ALA), arachidonsyre og oliesyre blev vist at være associeret med cancer progression [6]. Men i disse undersøgelser kun få klasser af lipidswere analyseres på grund af de tekniske begrænsninger. To nylige undersøgelser har rapporteret, at thephospholipidalterations er forbundet med PCa [7,8]. Især cancer progression afhænger af spredning og invasion af tumorceller til distale organer. Tumor celler undergår funktionelle og morfologiske ændringer, hvoraf mange starter med cellemembranen frigive deres komponenter i blodet. Lipidomicsapproach er blevet anvendt til at identificere biomarkører og studere rolle lipider i sygdommens progression af mange metaboliske lidelser, såsom asobesity [9], atherosclerose [10], hypertension [11], diabetes [12], cystisk fibrose [13] og cancere [14] . Senest Patel et al. har rapporteret, at en tre lipid signatur (phospholipider) kan skelne PCA patienter fra normale individer [8]. Derfor søgte vi at undersøge komplette lipid profiler dækker forskellige klasser af lipider, herunder fedtsyrer, TG’er, generaldirektorater og phospholipider i serum fra PCA patienter. Disse lipid signaturer kan anvendes til screening af PCA patienter sammen med eksisterende diagnostiske test med bedre specificitet og følsomhed. Desuden mener vi, at lipidomicapproach vil identificere lipider og deres tilknyttede veje, som kan spille en rolle i PCa initiationand progression.

Materialer og metoder

Kemi

Interne standarder (heptadeconoic syre og methyl heptadecanoat) samt mættede og umættede fedtsyrer anvendt i undersøgelsen blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Analytisk rene opløsningsmidler blev anvendt til at fremstille stamopløsninger af fedtsyrer. Ethanol blev købt fra kommercielle alkoholer, Canada. Methanol anvendes i ESI-MS analyser blev indkøbt fra Merck, Mumbai, Indien. Diazomethan i ether anvendes til forestring (methylering) af fedtsyrer ved kendt metode.

kliniske prøver og etiske retningslinjer

De serumprøver og efterfølgende patologiske data blev indsamlet efter opnåelse af patientens samtykke ved at fylde samtykkeerklæringer som blev udarbejdet og godkendt af institutionelle etiske komité. Den institutionelle etik og bio sikkerhedsudvalget af Nizam s Institut for Medicinsk Videnskab (NIMS) Hospital, Hyderabad, godkendt Indien nærværende undersøgelse. For lipidomics, udtoges blodprøver fra patienter med høje serum PSA værdier og patologisk undersøgelse forud for enhver kemoterapi eller kirurgi. Serumprøver adskilt fra helblod blev opbevaret ved -80 ° C indtil de samlede lipider blev isoleret under anvendelse af procedure ekstraktionsopløsningsmiddel.

Udvælgelse af patienter og prøvetagning

I den foreliggende undersøgelse serumprøver blev indsamlet fra 18 patienter med forhøjede PSA niveauer diagnosticeret med PCa fra NIMS hospital prøve arkiv til forskningsformål. Alle patienter udvalgt til denne undersøgelse ikke genstand for nogen behandling og /eller operation før indsamling af blodprøver. For bekræftelse af PCa blev diagnosen for hver patient er oprettet ved histopatologi af prostata biopsier. Hver patients oplysninger, herunder deres alder, serum PSA værdi og patologisk diagnose, såsom tumor kvalitet og Gleason scoreis i tabel 1. For kontrolgruppen blev 18 serumprøver fra mandlige kontroller fås fra institut apotek, hvor patienterne havde deres rutine check for wellness eller til diagnosticering af andre sygdomme. Vi havde sat et kriterium herunder alder matching uden tidligere diagnosticering af PCa for at indsamle disse kontrolprøver. De serumprøver blev indsamlet fra både tumor- og kontrolgruppen individer på samme måde. Fra hvert individ, blev 5 ml fuldblod opsamlet i en Vacutainer rør indeholdende Trinatriumcitrat. Rørene fik lov til at henstå i 10 min for koagulation og derefter centrifugeret ved 3000 rpm for at indsamle serum. Den klare supernatant fra overfladen blev opsamlet og opbevaret som separate portioner ved -80 ° C indtil brug.

De kliniske parametre af tumorer Gleason score og PSA-værdierne er forudsat.

Isolering /ekstraktion af totale lipider fra serumprøver

Total lipider fra prostatacancer og normale serumprøver blev ekstraheret som tidligere rapporteret af Bligh og Dyerwith mindre modifikationer [15]. Kort beskrevet blev lipider ekstraheret fra serumprøver ved at erstatte chloroform med dichlormethan (DCM) [16,17]. En 30 pi alikvot af serum blev tilsat withan intern standard (1,5 pi 50 pM methyl heptadecanoat for positiv ion ESI-MS analyse eller heptadeconoic syre for negative ion ESI-MS-analyse), og der blev tilsat 190 pi MeOH. De mixturewasvortexed i 30 sek og derefter 380 pi DCM blev tilsat til blandingen, og igen hvirvlet i 30 sek. Endelig, for at forbedre separationseffektiviteten af ​​to faser, 120 pi vand blev tilsat og blandet ved hvirvelbehandling i 15 sek. Blandingen fik derefter lov at komme i ligevægt ved stuetemperatur i 10 minutter og underkastet centrifugering ved 8000 g i 10 minutter ved 10 ° C til separation af faser. Det øvre lag blev forsigtigt fjernet. Den nedre lipid-rige DCM laget blev opsamlet i en separat 1,5 ml mikro tubeandthe opløsningsmidlet blev afdampet i centrivap under vakuum ved 4 ° C. Endelig blev de tørrede lipidekstrakter rekonstitueret i 100 pi puffer (ACN /IPA /H

2O i 65: 30: 5 v /v /v) før den udsættes for direkte ESI-MS-analyse. For GC-MS-analyse af tørrede lipid-ekstrakt blev yderligere udsat for methylering hjælp diazomethan.

Elektrospray Ionisering massespektrometri (ESI-MS) analyse

blev udført Eksperimenterne ved hjælp af en kvadrupol tid-of- flyvning massespektrometer (QSTAR XL, Applied Biosystems /MDS Sciex, Foster City, CA, USA) udstyret med en ESI kilde, erhverve data ved hjælp Analyst QS software (Applied Biosystems). Alle prøverne blev indført i kilden ved flow injektion (10 pi sløjfe) anvendelse af methanol som den mobile fase ved en strømningshastighed på 0,03 ml /min. Prøverne blev analyseret under positive og negative ESI betingelser. De typiske positive ion ESI var: kapillær spænding, +5 kV; declustering potentialer (DP1), 60 V; DP2, 10 V; fokusering potentiale, 250 V. De typiske negative ion ESI var: kapillær spænding, -4.5 kV; DP1, 60 V; DP2, 10 V; fokus potentiale, blev 250 V. Full scan masse spektre optaget over massen vifte af

m /z

50-2000 bruge en time-søgning (TOF) analysator med en opløsning på 10.000 Fuld bredde Half Maximum. Nitrogen blev anvendt som curtain gas og kollisionen gas, mens luft blev anvendt som forstøver. Til identifikation struktur blev kollision-induceret dissociation (CID) spektre registreret ved at vælge precursor ion af interesse ved anvendelse af kvadrupol, så de kan fragmentet i kollisionscellen, og adskillelse af produkt-ioner ved TOF analysatoren. De kollisionsenergier blev anvendt, var mellem 5 til 25 eV. De anvendte forsøgsbetingelser for prøverne er så samme som for referencestandarder. Alle spektrene rapporteret var gennemsnit af 25 til 30 scanninger. Elemental sammensætninger af alle precursor-ioner samt produkt-ioner blev indhentet fra de nøjagtige masse værdier ved hjælp af Analyst software.

GC-EIMS analyse

GC-EIMS analyser blev udført ved hjælp af en Agilent 6890 gaskromatograf (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) udstyret med en 5973N masse selektiv detektor (MSD). HP-5MS kapillarkolonne (30 m x 250 um, i.d: 0,25 um filmtykkelse) blev anvendt til kromatografisk separation af fedtsyremethylestere (FAME) derivater. 1 pi af prøven portion blev injiceret i GC-MS instrument i splitless type injektion mode. GC ovn var programmeret til at stige fra 50 ° C til 280 ° C ved en hastighed på 10 ° C /min rampe og indledende og afsluttende temperaturer blev holdt i 2 minutter og 5 minutter hhv. Samlet løbetid var 30 min. Helium blev anvendt som bæregas ved en konstant strømningshastighed på 1 ml /min. Indløbet og GC-MS-interface temperaturer blev holdt ved 250 ° C og 280 ° C. EI kilde og kvadrupol analysator blev holdt ved 230 ° C og 150 ° C. Databehandling blev gjort ved hjælp MSD ChemStation software (Agilent Technologies, USA). Massespektrometret blev drevet i både fuld scanning og måling af udvalgte ioner (SIM) tilstande. Massespektrometret blev scannet fra

m /z

29-600 i fuld scanning af analysen.

Methylering af fedtsyrer til GC-EIMS analyse

Ekstraktionsmetode af den samlede lipider fra serumprøve var samme som beskrevet ovenfor undtagen det sidste rekonstituering trin. Til GC-MS-analyse, blev tørret serum lipidekstrakter direkte underkastet methylering under anvendelse af diazomethan reagens, hvorved de ikke-flygtige fedtsyrerne i serumprøverne blev omdannet til flygtige FAME’er. Prøven hætteglas indeholdende tørrede lipid ekstrakter blev tilsat 1 ml frisk fremstillet diazomethan i etheropløsning. Hætteglassene blev hurtigt hvirvlet i 10 sekunder og efterladt ved stuetemperatur i 10 min. Prøverne blev opkoncentreret til 50 pi under anvendelse ScanVac. Faste fedtsyrer i ethanol (0,3 ml af 5 uM) underkastet methylering under anvendelse af ovennævnte procedure efter afdampning ethanol. Til identifikation af forbindelser, blev de samme forsøgsbetingelser opretholdes for prøver og referencestandarder.

Database søgning

De nøjagtige masse værdier for alle de fundne toppe (

m /z

) i både positive og negative former for ESI-MS-analyse af ekstrakter blev taget i betragtning, og de blev søgt i metabolit databaser med en masse tolerance på 5-10 ppm. Databaserne omfatter Lipid Maps, Metlin (https://metlin.scripps.edu/index.php) og Human metabolomet Database (HMDB) (https://www.hmdb.ca./spectra/ms/search) [18 ]. Databasen hits (med mindre ppm værdier) sammen med isotop distributionsmønstre blev brugt til peak identifikation. Nogle af de kritiske metabolitter blev yderligere bekræftet af MS /MS-analyse. MS /MS spektre blev sammenlignet med de tilgængelige i litteraturen såvel som den amerikanske Oil Chemists Society (AOCS) lipid bibliotek (https://lipidlibrary.aocs.org/ms/ms16/index.htm) data [7]. Enkelte lipider blev også bekræftet fra GC-MS-data ved at sammenligne enten retentionstiderne for standarder eller EI massespektre rådighed i AOCS lipid bibliotek.

Statistisk og bioinformatik analyse

t-test blev udført for at sammenligne koncentrationerne af identificerede lipidtype mellem cancerpatient og kontrol (uden PCA) grupper. De lipid signaturer viser forskelle med mere end 1,5 gange forøgelse eller falde med observeret

s

værdi 0.05were betragtes som forskelligt regulerede lipider blandt PCA patienter. Yderligere en un-overvåget analyse blev udført for at identificere de bedste lipid signaturer, der kunne diskriminerer normale og tumor prøve grupper. Hierarkisk klyngedannelse analyse (HCA), principal komponent analyse (PCA), har korrelationskurver og partition analyse er anvendt til kvantificering opnåede data. Desuden, på grundlag af den overflod af lipider individuelt og /eller i kombinationer, blev formelt koncept analyse (FCA), der anvendes til at forudsige klassifikation af prøver. FCA metode er hensigtsmæssig at finde ud af signifikante forhold mellem ændrede lipider og kliniske data for patienter matematisk ved grafisk illustration [19]. Disse illustrationer couldenvisagetheoretical hierarki på tværs af prøver og dermed producerede data kan bruges til at finde ud af data afhængighed mellem prøve attributter (kliniske data og ændrede serumlipider). For nylig, er FCA almindeligt anvendt til teoretisk klyngedannelse at identificere kombinatoriske biomarkører og samregulering af gener, proteiner og metabolitter [20,21]. I den foreliggende undersøgelse blev den FCA anvendte metode til at identificere en sammenhæng mellem overflod af serumlipider og klassificeringen (tumor og kontrolgrupper) af prøver. I FCA analyse teoretiske gitre blev bygget på grundlag af lav eller høj overflod af lipider til at forstå afhængighed af serum lipider overflod med PCa og normale prøver. De gitre blev trukket i kombinationer eller enkelt lipid arter klassificeret prøve grupper med forskellige forhold.

Cell proliferation assay

De humane PCA cellelinjer LNCaP (androgenafhængige celler) og PC3 (androgen uafhængige celler) blev opnået fra ATCC og opretholdt i normalt vækstmedium (RPMI-1640 (Sigma) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) sammen med 100 enheder /ml penicillin og streptomycin). Både cellelinierne blev dyrket i befugtet inkubator ved 37 ° C med en konstant tilførsel af 5% CO

2. Mycoplasma kontaminering af celler i kultur blev reguleret ved regelmæssige test under anvendelse af specifikke primere i RT-PCR. For at bestemme virkningen af ​​alfa-linolensyre på proliferation af PCA cellelinier, blev LNCaP og PC3-celler podet i 12 brønds plader (1,0 x 10

6 celler pr brønd) i komplet medium. Celler lodes vokse i 24 timer, så de kan fastgøres på brøndens overflade. Derefter blev cellerne behandlet med angivne koncentrationer af ALA (0-25 uM) eller vehikelkontrol (opløsningsmiddel, i hvilket ALA fremstilles). For at måle celletal blev celler høstet ved angivne tidsintervaller og cellelevedygtigheden blev vurderet ved anvendelse af grevinde (Invitrogen) i cellernes levedygtighed analysator (Invitrogen). Både tidsafhængig samt koncentrationsafhængig effekt af ALA på cellelevedygtighed bestemtes i proliferationsassays. Effekten af ​​ALA på cellemorfologi blev bestemt ved billeddannelse cellerne under mikroskop (Olympus Xi72, Japan).

Resultater

De serumprøver fra normale (kontrol) og kræftpatienter blev behandlet på samme måde som beskrevet i det eksperimentelle afsnit. De prøvealiquoter blev derefter udsat for direkte høj opløsning ESI-MS-analyse under positive og negative ion modes.

Positiv ion ESI-MS-analyse

Den positive ion ESI massespektre udstillet ioner i området af

m /z

100-1000 grund af forskellige metabolitter (fig 1A). Når prøven portioner blev analyseret ved direkte ESI-MS-metode, som undgår kromatografi og afsaltning trin, Na

+ og K

+ ioner til stede i serum forbliver i prøve- alikvoter. Således kunne de detekterede ioner protoneres, sodiated og /eller potassiated molekyler, dvs., [M + H]

+, [M + Na]

+ og /eller [M + K]

+ -ioner , henholdsvis. Derfor blev de fundne ioner i positiv ion-mode søgt i databaserne for alle de mulige ion arter er nævnt ovenfor.

Databasen søgeresultater viser, at thedetected toppe i ESI massespektre omfatter [M + H]

+ ioner af phosphatidylcholiner (pc’er), sphingomyeliner (SMS), og phosphatidylethanolamin (PSE); [M + K]

+ ioner af fedtsyrer (FAS), diglycerider (GD’er), triglycerider (TG) og phosphatidsyre (PA); [M + Na]

+ ioner af generaldirektorater. Nogle af de vigtigste metabolitter blev bekræftet ved at sammenligne deres MS /MS-data med den for tilsvarende standarder til rådighed i databaserne. Kollisionen energi værdi, der bruges til MS /MS eksperimenter var 28 eV for PES, 30 eV til pc’er og 20 eV til SMS. Hvor forløber ionintensiteter var lavere, blev omkring 100-150 scanninger kombineres (i MCA-tilstand) for at få deres MS /MS spektre. MS /MS-spektre af [M + H]

+ ioner af PC og PE og [M-H] – ion af FA er vist i fig 2A-2C. MS /MS spektre af [M + H]

+ ioner af phosphatidylcholinmolekylerne opnåelse af produktet ion ved

m /z

184 svarende til sin polære hovedgruppe [22]. ESI-MS /MS-spektrum af PC (37: 3) er vist i figur 2A som et eksempel. Spektret viste ion ved

m /z

184, den karakteristiske ion af pc’en, og ion ved

m /z

615, som giver oplysninger om acyldele knyttet til glycerol . Ionen ved m /z 104 i lav masse område svarer til cholingruppe. MS /MS-spektret af PE (42: 4) er vist i fig 2B, som viste den karakteristiske produkt ion på grund af tabet af 141 Da (ethanolaminephosphate) fra [M + H]

+ ion, og dette ion vides at være specifik for PE [23,24]. Det andet produkt ion i spektret optrådte på

m /z

279 indeholder oplysninger om en af ​​acyldelen af ​​PE som FA (18: 3). MS /MS-spektrum af [M-H]

– ion af FA (20: 4) er vist i fig 2C. Dette spektrum matchet godt med MS /MS-spektret af standard FA (20: 4) til rådighed i Metline databasen

Negativ ion ESI-MS-analyse

Den negative ion ESI. massespektre af lipidekstrakter viste [MH]

– ioner af forskellige klasser af lipid arter (fig 1B). Svarende til positive ion ESI-data blev de nøjagtige masse værdier for de fundne toppe søgte mod databaser for peak identifikationer. Baseret på database søgeresultaterne, blev de detekterede toppe i spektrene findes at være det [M-H]

– ioner af fedtsyrer (FAS), generaldirektorater og phosphatidinsyre (PA). Nogle af fedtsyrerne blev yderligere bekræftet af de MS /MS eksperimenter på [M-H]

– ioner. De kollisionsenergier anvendte var 25-30 eV til FA’er. MS /MS-spektret af FA 20: 4 er vist i fig 2D som et typisk eksempel, og spektret viste karakteristiske produkt-ioner på grund af tabet af H

2O (18 Da) og CO

2 (44 Da) fra [MH]

– ioner ud over produktet ion ved

m /z

59 svarende til acetat-ion (CH

3COO

-). [25]

Differential analyse Kvantificering af lipider

De relative mængderne af de fundne i kontrol- og patientprøver toppe blev normaliseret baseret på den interne standard intensiteter. De normaliserede værdier blev udsat til bestemmelse differentielt regulerede lipid signaturer med mindst 1,5 gange stigning eller et fald i cancerpatienter i sammenligning med kontrolgruppen. ANOVA blev udført for statistisk signifikans ( 0,05) af ændrede lipider tværs PCA patienterne. HRMS data for de differentielt regulerede lipidtype med tilsvarende fold forskelle er opsummeret i tabel 2. Alle identificerede lipider blev klassificeret i syv forskellige klasser PC, PA, PE, TG, DG, SPL og FA. Bortset fedtsyrer, resterende seks klasser af lipider var højere i patientserumprøver end dem af kontrolprøver. Blandt de enkelte klasser, blev TG’er forhøjede i PCA patienter sammenlignet med normale raske personer.

De identificerede metabolitter i lipid ekstrakter af serumprøver.

Hierarkisk klyngedannelse og partition analyse

Den hierarkiske clustering af prøver baseret på ændrede serumlipider er præsenteret i figur 3. på zonekort, der prøver med højere udtryk farvet rødt, mens prøver med lavere udtryk er farvet grønt. Søjlerne repræsenterer prøver og rækkerne angiver ændrede lipider i kræftpatienter serum sammenlignet med raske individer. Afstandene mellem klyngerne måles ved dendrogrammer mellem klynger. Fra den observerede zonekort to forskellige klynger opdele tumor og normale prøver med kun mindre undtagelse. Ikke desto mindre hierarkisk klyngedannelse afslørede, at 17 af 18 tumorprøver (rød) dannede en diskret klynge. I tilfælde af kontrol, 14 prøver (grøn) grupperet sammen mens de resterende fire prøver blev en del af tumor prøver klyngen. I todimensional klyngedannelse, vi også gjort forsøg på at identificere nogen specifik lipid klasse danner en klynge, der primært bestemmelse af tumor og kontrolgrupper. De observerede dendrogrammer bekræfter, at ingen klynge er udformet med enkelt lipid klasse (FA, PE, PA, DG, PC og TG) (figur 3). Baseret på de observerede klynger, udførtes medhjælper PCA og partition analyse. Fra den opnåede relative forekomst af lipider, et scatterplot med første tre hovedkomponenter viser en god skillevæg mellem kræftpatienter og kontroller (Fig 4A). Fra PCA-analyse er det tydeligt, at alle tumorer dannet en unik bestanddel (blå), kun én tumorprøven blev en del af kontrolgruppen komponent (rød) baseret på 24 identificerede lipider. Men som rapporteret af Lukk et al. kun en enkelt forskellen biomarkør mellem cancer og normale grupper er ikke tilfredsstillende at klassificere kliniske prøver med 100% specificitet og følsomhed [26]. Derfor er udført partition analyse for at bestemme potentielle lipid underskrifter for klassificering af prøver til respektive mærket gruppe. Partition analyse af den relative forekomst værdier fremhævet to lipider, FA (22: 3) og PC (39: 6), der kan klassificere prøver med højere specificitet (Fisher test med

s

-værdi 1.612e-06). Under denne partition funktion, hvis FA (22: 3) er ≥ 0,045 ppm og PC (39: 6) er ≥ 0,145 ppm, 100% følsomhed (18 kontrolprøver klassificeret korrekt PCA) og 77,7% specificitet (af 18 tumorprøver 4 prøver er fejlklassificeres) kunne opnås i klassificering af kræftpatienter fra den tilsvarende normale gruppe (figur 4B). Partition analyseresultater har også tilkendegivet, at de andre identificerede lipider i kombinationer kan klassificere alle prøver korrekt. Ud fra disse resultater er det klart, at mere end en lipid af samme klasse eller en anden klasse kan skelne tumor og kontrolprøver med højere specificitet og sensitivitet.

På zonekort patienterne blev vist horisontalt mens lipider lodret. I den øverste farve bar de kræftpatienter er markeret med rødt, er kontrollerne vist med grønt. I siden farve bar hver farve repræsenterer en specifik klasse af lipider. De dendrogrammer repræsenterer afstanden mellem klyngerne

(A) Principal Component Analysis (PCA):. Scatter plot af de øverste tre vigtigste komponenter i PCA fra den relative forekomst af lipid data fra kræft og normal individer. De blå kugler indicatePCa patienter, mens røde kugler viser ikke kræft individer. (B) Formel Concept Analysis at visualisere sortering af prøver baseret på den relative forekomst af PC (39: 6) og FC (22: 3) i PCa (røde firkanter) sammenlignet med kontrolgrupper (sorte firkanter). Disse data afhængig visualisering er blevet udført for at vise partition effektivitet af lipider individuelt og /eller i kombination for at identificere signatur lipider af biomarkør potentiale.

For bedre at forstå variationen af ​​lipider, der ændres i PCA patienter, en korrelationsanalyse blev udført i en parvis måde at visualisere afhængighed mellem overflod niveauer af identificerede lipider og serumprøver. Korrelation analyse muliggør identifikation af co-regulerede lipider og identificerer relationer mellem prøverne i en undersøgelse. De resulterende korrelation varme kort over log-transformerede overflod niveauer af lipider ved hjælp af Pearson korrelationskoefficienter klart adskilles større antal kræftpatienter med kun én undtagelse (figur 5). Ud over prøve-prøve korrelation, har sammenhæng mellem lipider bestemmer deres samregulering identificeret en stor klynge af lipider der indeholder 3 PSE, 2 pc’er, 3 TG’er og en GD. Især både pc’er og PEs grupperet sammen viser god co-regulering af deres serum overflod (figur 6).

Clustering på korrelationskoefficienter tydeligt viser prøver gruppe (tumor eller normal) baseret på overflod niveauer af differentierede lipider.

Gas kromatografi med elektron ionisering massespektrometri (GC-EIMS) analyser

fedtsyrer kan analyseres ved GC-MS efter derivatisering (f.eks forestring, silylering etc. ). I det foreliggende arbejde, blev fedtsyrer methyleres af diazomethan og FAME’er blev udsat for GC-MS-analyser under elektron ionisering (EI) betingelser. EI massespektre af FAME’er er tilgængelige i AOCS lipid biblioteket (https://lipidlibrary.aocs.org/ms/ms16/index.htm). Spektrene rådighed omfatter karakteristiske struktur vejledende fragmentioner. De spektre er også tilgængelige i kommercielle EI biblioteker (Wiley og NIST) samt i de tidligere offentliggjorte rapporter [27]. Derfor er det let at identificere de FAME’er i GC-MS-analyse ved at søge målet spektre mod EI biblioteket. Vi har benyttet EI biblioteket og /eller standarder for at identificere de fedtsyrer. I den foreliggende undersøgelse, som forventet, viste de mættede fedtsyrer overvejende to karakteristisk fragment-ioner på

m /z

74 og 87 mens flerumættede fedtsyrer viste fragmentet ion ved

m /z

79 i lav masse region af spektre. EI-spektrene for methylestere af heptadecansyre (17: 0), linolensyre (18: 3) og arachidonsyre (20: 4) er vist i S1A til S1B Fig. Vi kunne nemt karakterisere høje rigelige fedtsyrer fra deres EI massespektre (fuld scanning analyse). I tilfælde af lav rigelige fedtsyrer, har vi udført GC-MS eksperimenter i SIM-tilstand ved at udvælge specifikke fragmentioner af mål-fedtsyrer. I denne type analyse, parametre fastholdelse af målforbindelser er afgørende. Derfor før SIM eksperimenter, de retentionstid for target fedtsyrer blev bekræftet ved hjælp af standarder. Ved at anvende GC-MS (SIM) metode, har vi bekræftet tilstedeværelsen af ​​linolensyre og arachidonsyre i lipidekstrakt prøver. Methylestere af linolensyre (18: 3) og arachidonsyre (20: 4) blev elueret ved retentionstiderne for 20,9 og 22,3 min (fig 7). Tilstedeværelse af disse to fedtsyrer blev yderligere bekræftet ved at tilsætte standarderne i lipid ekstrakt og udføre GC-SIM-analyse efter forestring, hvor disse to fedtsyrer optrådte på de samme RTs som for prøve (figur 7).

<

Be the first to comment

Leave a Reply