PLoS ONE: Tetraspanin CO-029 Hæmmer Kolorektal Cancer Cell Movement ved at deregulere Cell-Matrix og celle-celle Adhesions

Abstrakt

Ændringer i tetraspanin CO-029-ekspression er forbundet med progression og metastaser af kræft i fordøjelsessystemet. Men hvordan CO-029 fremmer kræft metastaser er stadig dårligt forstået. For at bestemme den mekanisme, vi tavshed CO-029-ekspression i HT29 kolon kræftceller og fandt, at CO-029 knockdown betydeligt reduceret celle vandrende evne. Den formindskede cellemigration blev ledsaget af opreguleringen af ​​både integrin-afhængig celle-matrix-adhæsion på laminin og calcium-afhængig celle-celle adhæsion. Celleoverfladen niveauer af laminin-bindende integrin α3β1 og fibronectin-integrin α5β1 blev forøget, mens niveauet af CD44 blev reduceret på CO-029 lyddæmpning. Ændringerne bidrager til den ændrede celle-matrix adhæsion. De deregulerede celle-celle adhæsion resultater, i det mindste delvist, fra øget aktivitet af cadheriner og reduceret niveau af MelCAM. Afslutningsvis CO-029 fungerer som en regulator af både celle-matrix og celle-celle-adhæsion. Under tyktarmskræft progression, CO-029 fremmer kræftcelle bevægelse ved deregulering celle sammenvoksninger

Henvisning:. Guo Q, Xia B, Zhang F, Richardson MM, Li M, Zhang JS, et al. (2012) Tetraspanin CO-029 Hæmmer Kolorektal Cancer Cell Movement ved at deregulere Cell-Matrix og celle-celleadhæsioner. PLoS ONE 7 (6): e38464. doi: 10,1371 /journal.pone.0038464

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Modtaget: Juli 8, 2011; Accepteret: 6 maj 2012; Udgivet: 5 juni 2012

Copyright: © 2012 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health CA096991. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

colorektal cancer, en af ​​de mest almindelige cancertyper, har høj dødelighed [1]. Patienter med metastase til fjerne organer, såsom lever og lunger lider ekstremt dårlig prognose. Derfor forstå de cellulære og molekylære mekanismer i kolorektal cancer progression er afgørende for at udvikle nye strategier til at forbedre prognosen og overlevelsesrater for patienter med tarmkræft.

Tetraspanins regulere en række fysiologiske og patologiske processer, og nogle tetraspanins er associeret med cancer progression og metastase [2] – [11]. Menneskelig tetraspanin CO-029 og dens rotte homolog, D6.1A, blev oprindeligt rapporteret som en tumor-associeret antigen udtrykt i gastrisk, tyk- og bugspytkirtelkræftceller og udøve tumorprogression-fremmende aktivitet [12]. CO-029-ekspression ofte opreguleret i hepatocellulært carcinom [13]. Ekspressionsniveauet af D6.1A er markant forøget i forhold til en i en differentieret parental linie, i en dedifferentierede rotte hepatom cellelinie [14]. Den samtidige ekspression af integrin α6β4 og D6.1A i nonmetastasizing rotte pancreas adenocarcinom cellelinie BSp73AS letter levermetastaser af denne linje [15]. CO-029 udviser også en højere udtryk niveau i metastatiske coloncarcinomceller, i forhold til niveauet i primære kolon kræftceller [16]. En mulig mekanisme for prometastatic aktivitet af CO-029 er dens forening med integriner eller tetraspanins, som begge påvirker celle motilitet. D6.1A er forbundet med integriner α3β1, α6β1, og α6β4 efter proteinkinase C (PKC) aktivering [15], [17]. I metastatiske pancreas og kolorektal karcinom cellelinjer, aktivering af PKC øger colokalisering af CO-029 og tetraspanin CD151 med integrin α6β4 i tumorceller, fremmer internalisering af denne integrin-tetraspanin kompleks, falder celle-matrix vedhæftning på laminin 332, og øger cellemigrering [18]. Endvidere D6.1A overudtrykker tumorceller frigiver exosomer der indeholder D6.1A, og disse exosomer inducerer angiogenese at lette tumor formidling [19]. En nylig undersøgelse viste, at E-cadherin og p120-catenin modvirke CO-029 fremmet migration af Isreco tyktarmskræft celler [20]. Disse undersøgelser antyder kraftigt en vigtig rolle for CO-029 i progression og metastase af tumorer i fordøjelsessystemet. For at bestemme den mekanisme, hvormed CO-029 fremmer tumorprogression og metastase, vi tavshed udtryk for CO-029 i HT29 humane kolon adenocarcinomceller. Ved at kombinere in vitro og in vivo forsøg, fandt vi, at tabet af CO-029 signifikant svækket cellemotilitet og ændret balancen i celle-celle og celle-matrix-adhæsioner, der fører til nedsat metastatiske potentiale af tumorceller.

Materialer og fremgangsmåder Salg

cellekultur, antistoffer, ekstracellulære matrixproteiner, og andre reagenser

HT29 human colorektal adenocarcinom-cellelinje blev opnået fra ATCC (Manassas, VA) og dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin.

antistofferne anvendt i denne undersøgelse blev intergrin α1 mAb TS2 /7, intergrin α2 mAb IIE10, intergrin α3 mAb A3X8, intergrin α5 mAb BIIG2, intergin α6 mAb A6BB, intergrin β1 mAb TS2 /16, intergrin β4 mAb 439-9B (BD Pharmingen, San Diego, CA), CD9 mAbs C9BB [21] og Mab7, CD63 mAb 6H1 [22], CD81 mAb M38, CD82 mAb M104, CD151 mAbs 5C11 og TS151r [23], CO29 mAb NS1116 (venligst stillet til rådighed af Dr. Dorothee Herlyn af Wistar Institute), E-cadherin mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), EpCam mAb VU1D9 (Cell Signaling, Danvers, MA), EWI2 mAb 5E8 (venligst stillet til rådighed af Dr. T. Schweighoffer af Novartis Institute for Biomedical Research), og MelCam mAb P1H12 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). En mus IgG2b blev anvendt som en negativ kontrol-antistof (Sigma, St. Louis, MO). De sekundære antistoffer anvendt i denne undersøgelse var peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-muse-IgG-antistof (Sigma, St. Louis, MO) og fluoresceinisothiocyanat-konjugeret gede-anti-mus eller -rotte IgG-antistof (Biosource International, Camarillo, CA) .

den ekstracellulære matrix proteiner blev rekonstitueret mus basalmembranen Matrigel (BD Biosciences, Mountain View, CA), mus laminin 111 (Invitrogen, San Diego, CA), og humant plasma fibronectin (Invitrogen, San Diego, Californien ). Andre reagenser var fra Sigma, hvis kilden ikke er angivet.

RNA-interferens og Retrovirus Forberedelse og transduktion

CO-029 lille hårnål RNA (shRNA) (TGCTGTTGACAGTGAGCGATGAATGAAACTCTCTATGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCATAGAGAGTTTCATTCACTGCCTACTGCCTCGGA), som er rettet mod TGAATGAAACTCTCTATGAA sekvens af menneskelig CO-029 mRNA, og kontrol shRNA (RHS1703) blev opnået fra OpenBiosystems (Huntsville, AL). En anden CO-029 shRNA retter sig mod en anden del af CO-029 mRNA sekvens blev opnået fra OpenBiosystems (Materialer og amp; Metoder S1). Det vesikulære stomatitis-virus (VSV) -G proteinekspressionsvektor pVSV-G (venlig at give af Dr. C. Stipp, University of Iowa) og shRNA blev transduceret ind i GP293 pakkeceller af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, CA). Efter 48 timer blev viruspartiklen-holdige kultursupernatant høstet, og cellerester blev fjernet ved at lede supernatanten gennem et 0,45-mmol /l sprøjtefilter. Den rensede virale lager blev inkuberet med HT29-celler til transduktion, og HT29-celler transduceret med kontrol eller CO-029 shRNA blev udvalgt med puromycin. De puromycin-resistente celler i CO-029 shRNA transduktant blev sorteret ved flowcytometri til at berige CO-029-lyddæmpet cellepopulation.

flowcytometri

Celler blev løsnet med 0,5% trypsin-EDTA , vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) to gange, blokeret med 5% gedeserum i DMEM ved 4 ° C i 1 time, inkuberet med primært mAb, og derefter farvet med FITC-konjugeret gede-anti-muse-IgG ved 4 ° C i 1 time. Farvede celler blev analyseret på en FACScan flowcytometer (BD Biosciences).

Immunofluorescens

Celler blev fikseret med 3% paraformaldehyd ved stuetemperatur (RT) i 15 minutter, permeabiliseret med 0,1% Brij 98 ved stuetemperatur i 2-5 min, blokeret med 20% gedeserum ved 4 ° C i 1 time og inkuberet med primære mAb’er ved 4 ° C i 1 time, efterfulgt af farvning med et sekundært antistof ved 4 ° C i 1 time. Efter hvert antistof inkubation blev cellerne vasket tre gange med PBS. For immunfluorescerende analyse blev cellerne undersøgt med et Axiophot-fluorescensmikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY), og billeder blev taget med et Optronics digitalkamera.

Immunfældning og Western blot

Immunopræcipitationer var udført som tidligere beskrevet [24]. Cellerne blev lyseret med 1% Nonidet P-40 lysisbuffer ved 4 ° C i 1 time. I nogle eksperimenter blev celleoverfladen mærket med 0,5 mg /ml EZlink sulfo-NHS-LC biotin (Pierce) før cellelyse. Efter fjernelse af det uopløselige materiale ved centrifugering ved 14.000 x g og to kørsler af præ-clearance, blev lysater inkuberet med primært mAb-absorberet protein A- og G-Sepharose-perler (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) fra 3 timer til natten over ved 4 ° C. Immunopræcipitaterne blev vasket med lyseringspuffer tre gange, opløst i Laemmli-prøvebuffer, opvarmet til 95 ° C i 5 min, separeret ved SDS-PAGE, og derefter elektrisk overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranerne blev sekventielt blottet med primær Ab og peberrodsperoxidase-konjugeret andet Ab (Sigma) i immunoblot forsøg eller peberrodsperoxidasekonjugeret extravidin (Sigma) i biotinyleringsbetingelserne eksperimenter, efterfulgt af kemiluminescens (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).

celleadhæsionsassays

Cell-matrix adhæsion assay blev udført som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [25]. Kort fortalt blev 96-brønds mikrokulturplader (BD Bioscience) overtrukket med muse laminin 111 eller fibronectin ved 4 ° C natten over og derefter blokeret med 1% varmeinaktiveret bovint serumalbumin (Sigma) ved 37 ° C i 1 time. Laminin 332 blev fremstillet ved dyrkning af RAC-11P-celler ved konfluens i 96-brønds plader i 3 dage som beskrevet tidligere [26]. Celler blev trypsinbehandlet og suspenderet i serum-frit DMEM medium ved en densitet på 1 x 10

4 celler /ml og 0,1 ml af cellesuspensionen blev derefter tilsat til hver brønd. Efter inkubation i 1 time ved 37 ° C blev ikke-bundne celler fjernet ved skylning fire gange med PBS. De vedhæftede celler blev visuelt talt.

celle-celle adhæsion blev undersøgt ved anvendelse af hængende dråbe-aggregation assay som tidligere beskrevet [27]. Celler blev løsnet med 0,5% tripsin-EDTA og vasket med PBS to gange, derefter gjort til enkeltcelle-suspension ved tre blide passager gennem en 27-gauge nål. Den encellede suspension af 1 × 10

4-celler i 30 pi opløsning blev suspenderet som en hængende dråbe fra låget af en 24-brønds dyrkningsplade og lades aggregere natten over ved 37

oC i 5% CO

2 med fugtighed. Komplet DMEM blev anvendt til måling af total celle-celle-klæbeevne, mens calcium-frit DMEM var for calcium-uafhængig celle-celle klæbeevne. For at analysere modstand celle-celleadhæsion til mekanisk belastning blev cellerne udsat for forskydnings- kraft ved at lede dem gennem en 200-pi pipettespids 10 gange. Calcium-uafhængig celle-celle-adhæsion blev også målt under relativt mild mekanisk spænding [28]. Kort fortalt, efter vask med Puck saltvand (5 mM KCI, 140 mM NaCl, 8 mM NaHCO3, pH 7,4), single-cellesuspensionen (1 x 10

5 celler /ml) blev inkuberet i 5% CO

2 ved 37 ° C natten over med omrøring ved 80 rpm på en orbitalryster. Celler blev fotograferet enten før eller efter mekanisk belastning. Celle-celle klæbeevne efter forskydningsspænding blev kvantificeret som i) procentdelen af ​​aggregerede celler og /eller ii) det område, som aggregater. Baseret på tælling af enkeltceller, blev procentdelen af ​​aggregerede celler beregnet ved anvendelse af formlen% aggregering = [1- (antal enkeltceller /antal totale celler)] x 100. Overfladearealet dækket af aggregaterne blev målt ved hjælp af ImageJ software til at skildre graden af ​​celleaggregering. Celleaggregat er defineret som en celle klump indeholdende fire eller flere celler.

cellemigrering Assays Salg

sårheling assay blev udført som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [29]. Kort fortalt blev cellerne podet i individuelle brønde i en 24-brønds kulturplade. Når cellerne nåede konfluens, blev en celle monolag først behandlet med 10 ug /ml mitomycin C i 30 minutter for at blokere mitose og tillader således analyse af cellemigrering i fravær af celleproliferation. Derefter cellemonolaget blev såret med en steril, 200 pi pipettespids. Mediet og cellerester blev fjernet og genopfylder 2 ml frisk medium. Celler blev fotograferet af fasekontrastmikroskopi hver 24 timer efter sårdannelse. Til bedømmelse “sårlukning” blev fem områder langs såret tilfældigt udvalgt til beregning af gennemsnitlig bredde for hver brønd. Billeder blev taget på forskellige tidspunkter af et Olympus inverteret-fasekontrastmikroskop.

Transwell cellemigrationsassay blev udført som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [30]. Kort fortalt blev 8-um porestørrelse, 24 brønde Transwell inserts (BD Bioscience, Bedford, MA) belagt med 10 ug /ml laminin 111 eller fibronectin på undersiden af ​​indsatserne ved 4 ° C natten over og blokeret med 0,1% varmeinaktiveret bovint serumalbumin (BSA) ved 37 ° C i 1 time. I alt 2 × 10

4-celler i serum-frit DMEM indeholdende 0,1% varmeinaktiveret BSA i et volumen på 300 pi blev tilsat til det øvre kammer, og 500 pi DMEM indeholdende 1% FBS blev tilsat til det nederste kammer . Cellerne i transbrøndene blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C. Cellerne tilbage på den øvre overflade af indsatserne blev fjernet ved aftørring med en vatpind, og de celler, der transmigrated gennem porerne blev fikseret og farvet med Diff-Quik Stain Kit (Dade Behring, Inc., Newark, DE). Migration blev kvantificeret ved at tælle cellerne på den nedre overflade af indsatsen.

Statistiske analyser

Alle forsøg blev udført mindst fire gange. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Statistisk analyse blev udført ved Students

t

-test, og

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

The Silence of CO. -029 Expression i HT29 tyktarmscancerceller

for at bestemme de mekanistiske roller tetraspanin CO-029 i tumor progression, vi etableret en stabil transduktant i HT29 humane kolon adenocarcinomceller [31], hvor CO-029-ekspression var slået ned af shRNA. De dæmpende virkninger på det totale cellulære og celleoverflade CO-029-proteinekspression blev vurderet ved hjælp af Western blot og flowcytometri henholdsvis (figur 1). Sammenlignet med den transduktant udtrykkende kontrol eller nonsilencing (NS) shRNA, den transduktant udtrykkende CO-029 shRNA (KD) udviste en væsentlig reduktion af CO-029-ekspression ved celleoverfladen (figur 1A), der spænder fra ca. 60% til 90%, afhængigt af cellekonfluens status i hvert enkelt eksperiment, og et stort tab af totale cellulære CO-029-proteiner (figur 1B), typisk ca. 90%. Stilheden som følge af CO-029 shRNA var specifik til CO-029, fordi udtryk for mange andre overfladeproteiner, især andre medlemmer af tetraspanin superfamilien, ikke blev reduceret (se nedenstående).

CO-029 shRNA og nonsilencing shRNA blev stabilt udtrykt i HT29-celler. (A) Flow cytometri af CO-029-ekspression på overfladen af ​​HT29-celler, der blev transficeret med nonsilencing (NS) eller CO-029 shRNA (KD) konstruktioner. Den negative kontrol mAb var murine IgG, og CO-029 mAb var NS1116. Mean fluorescerende intensitet (MFI) af CO-029 på KD celler var 62% mindre i forhold til, at der på NS celler. (B) Western blot analyse af CO-029 proteiner i NS og KD HT29-celler. KD celler viste en 90% reduktion i CO-029 proteiner. β-actin:. lastning kontrol

The Silence of CO-029 Expression Nedsat Migration af HT29 Celler

Vi først vurderede effekten af ​​CO-029 lyddæmpning på kræft celle migration. At sammenligne cellen migreringsevnen af ​​NS og KD transduktanter, udførte vi 1) sårheling assay til analyse af kollektive cellemigrering, dvs. celle-celle adhæsion-afhængig cellevandring, og 2) transwell migration assay til analyse ensomme cellemigrering, dvs. celle-celle-adhæsion-uafhængig celle migration. I sårhelingen forsøg blev repopulation sats eller helingsproces af sårede monolag markant reduceret i CO-029 KD transduktant celler, og en sådan reduktion varede flere dage (figur 2A og figur S1a). Det reducerede sårheling blev ikke skyldtes langsommere celle proliferation af KD celler, fordi forsøgene blev udført i nærvær af mitomycin. Den forringet evne KD celler i celle migration kunne også observeres i transwell migration analysen. Cellemigrering gennem porer membranfilter på ekstracellulære matrixproteiner såsom laminin 111 og fibronectin blev reduceret betydeligt på inaktivering af CO-029-ekspression (figur 2B og figur S1B). Disse resultater indikerer, at stilhed CO-029 dæmper den generelle evne til celle migration og at ekspressionen af ​​CO-029 er nødvendig for stærk eller robust celle migration.

(A) sårheling assay. Sammenlignet med NS celler, blev sårlukning væsentligt forringet i KD celler ved 72 timer efter oprettelsen af ​​sår i sammenflydende cellemonolag. (B) Transwell migration assay. KD celler viste forringet motilitet i Transwell migrationseksperimenterne. Data er vist som gennemsnit ± SD, n = 4. *

P

. 0,05

Ud over celle migration på 2-dimensional matrix, celle invasion er en vigtig parameter til måling cellemotilitet gennem 3-dimensional (3D) mikromiljø for invasive og metastatiske cancerceller. Cellulær invasionsevne blev målt ved evnen af ​​HT29-transduktant celler at invadere gennem matrigel, et 3D matrix ligner basalmembran eller type I collagen gel, et 3D matrix ligner bindevæv. Vi fandt ingen signifikant invasion af enten gruppe af HT29-KD celler gennem en af ​​disse 3D matrix miljøer (data ikke vist), hvilket antyder, at HT29 celler er ikke invasive, i det mindste i denne invasion assay og under

in vitro

test tilstand.

CO-029 Reguleret Cell-matrix og celle-celle adhæsion

Tumor celle-matrix og celle-celle sammenvoksninger anses for at være de vigtigste begivenheder, der regulerer metastatisk kaskade [ ,,,0],32] – [34]. For at vurdere effekten af ​​CO-029 lyddæmpning på celle-matrix adhæsion, vi analyseret og sammenlignet cellematrixkonstruktionen klæbeevne KD og NS transduktanter på laminin og fibronektin. Som vist i figur 3A, HT29-NS og -KD celler udviste forskellige vedhæftning evner. KD-celler udviste forøget klæbeevne på ekstracellulære matrixproteiner laminin 111 og laminin 332, hvilket antyder, at CO-029 fastholder celleadhæsion på basalmembranen, hvilket er matricen miljø beriget med lamininer. Cellen vedhæftning på fibronectin, udviste imidlertid ingen forskel mellem NS og KD-celler (figur 3A). Vi undersøgte også celleadhæsion på hyaluronan, en større proteoglycan af ekstracellulære miljø og liganden af ​​CD44, på grund af nedsat CD44-ekspression ved overfladen af ​​HT29-KD-celler. Men HT29-celler syntes ikke at klæbe til hyaluronan, selvom en etableret protokol blev fulgt i dette assay [35].

(A) Cell-matrix adhæsion. Adhæsion på laminin 111, laminin 332, og fibronectin af HT29-NS og -KD celler blev analyseret efter inkubation ved 37

oC i 5% CO

2 i 1 time. Vedhæftningen af ​​KD celler på laminin 111 og laminin 332 blev væsentligt forøget i forhold til NS-celler (

P

= .042 om laminin 111 og = .048 om laminin 332). (B) Samlet celle-celle-adhæsion. Celleaggregering blev målt i Ca

++ – holdige medier efter en relativt stærk mekanisk kraft blev påført. (C) Ca

++ – uafhængig celle-celle-adhæsion. Cell sammenlægning blev målt i Ca

++ – frie medier efter relativt stærke eller milde mekaniske kræfter blev anvendt henholdsvis. Aggregeringen af ​​NS og KD celler efter forskydningsspænding blev kvantificeret som beskrevet i Materialer og Metoder.

P Salg værdier er 0,03 for de aggregerede celler i nærvær af Ca

++, 0,001 for det område af aggregater i nærvær af Ca

++, og 0,0004 for mild stress i fravær Ca

++. Billeder af celleaggregater efter shear-stress behandling blev opnået under fase-kontrast mikroskopi. Alle data forventes som gennemsnit ± SEM (n = 4). *

P

0,05, **

P

. 0,01

For at vurdere effekten af ​​CO-029 lyddæmpning på celle-celle-adhæsion udførte vi celleaggregering assay. Først undersøgte vi celleaggregering i nærvær af Ca

++ [28], som afspejler det samlede celle-celle-klæbeevne herunder både cadherin-afhængige og -uafhængige celle-celle klæbeevne. Silencing CO-029 resulterede i øget evne til at danne de celleaggregater, der er resistente over for relativt stærk mekanisk belastning, sammenlignet med NS-celler (figur 3B). Derefter undersøgte vi celle-celle aggregering i fravær af Ca

++, hvilket afspejler cadherin-uafhængig celle-celle klæbeevne som den medieret af IgSF proteiner. Ca

++ – uafhængig celle-celle-adhæsion viste ingen forskel efter relativt stærk mekanisk belastning blev påført, men blev nedreguleret i KD-celler efter relativt milde mekanisk kraft blev påført (figur 3B). I HT29-celler, Ca

++ – afhængig celle-celle-adhæsion gør et stort bidrag til den samlede celle-celle-adhæsion, baseret på en sammenligning mellem størrelsen af ​​Ca

++ – afhængige og -uafhængige aggregater efter stærk mekanisk stress behandling (figur 3B). Sammen CO-029 begrænser total og Ca

++ -. Afhængig celle-celle adhæsion

CO-029 Silencing Ændret celleoverfladeekspression Profil af adhæsionsmolekyler

Ændringerne i overfladen ekspression af tetraspanins, integriner og celleadhæsionsproteiner er involveret i tumorudvikling og metastase [17], [36] – [42]. For at bestemme den mekanisme, hvorved CO-029 regulerer celle-celle- og -matrix adhæsioner, vi målt og sammenlignet ekspressionsniveauerne af celleadhæsionsproteiner på overfladen af ​​HT29-NS og -KD celler. For celle-matrix adhæsionsproteiner, laminin receptor integrin α3 og fibronectinreceptor integrin α5 blev opreguleret efter lyddæmpende CO-029. Integriner β1, β4, α1, α2, og α6 forblev uændret, mens hyaluronanreceptor CD44 markant blev nedreguleret ved celleoverfladen (figur 4A). For at bestemme om CO-029 lyddæmpning påvirker integrin aktivering, vi måles og sammenlignes steady state niveauer af aktive Ø1 integriner i HT29-NS og -KD celler med flowcytometri ved hjælp af β1 integrin mAb AG89. Den β1 integrin mAb AG89 genkender kun de p1 integriner i aktiv tilstand [43]. Selv om niveauet af aktive p1 integriner blev signifikant forøget på celleoverfladen af ​​HT29-KD-celler (figur 4B venstre histogram), forblev uændret efter at være kalibreret med niveauet af totale p1 integriner på celleoverfladen (figur 4B højre histogram). For celle-celle-adhæsionsmolekyler, blev niveauet af E-cadherin proteiner ikke ændret på celleoverfladen (figur 4C). Vi undersøgte også andre celle-celleadhæsionsmolekyler relateret til CO-029 og /eller tetraspanins såsom EpCAM, MelCAM, og EWI2, der deltager i Ca

++ – uafhængig celle-celle-adhæsion og hvoraf nogle hører til IgSF . Kun MelCAM blev markant nedreguleret ved celleoverfladen (figur 4C). Tetraspanins CD9, CD63, CD81, CD82, og CD151 udviste ingen signifikant ændring på celleoverfladen ved CO-029 silencing (figur 4D).

Ekspressionsniveauerne for cellematrixkonstruktion adhæsionsproteiner (A), aktiv β1 integriner (B), celle-celleadhæsionsproteiner (C), og tetraspanins (D) ved overfladen af ​​HT29-NS og -KD transfektantcellerne blev målt ved flowcytometri. De relative niveauer af disse proteiner på KD-celler til NS-celler præsenteres som histogrammer (gennemsnit ± SD, n = 4~8). *

P

0,05, **

P

0,01. I (B), efter normaliseret ved de tilsvarende relative niveauer af total integrin β1, er niveauerne af aktiv integrin β1 i forhold til NS celler præsenteres i histogrammet til højre.

CO-029 og Dannelse af Focal vedhæftning, Stress Fiber, og adherens Junction

for yderligere at vurdere effekten af ​​CO-029 lyddæmpning på celleadhæsion, vi undersøgte omdrejningspunkt vedhæftning og adherens krydset af HT29 transfektantcellerne ved farvning i) vinculin, en markør af fokal adhæsion, og ii) E-cadherin og β-catenin, markører for adherens junction hhv. Vi fandt, at CO-029 nedregulering resulterede i reduceret dannelse af fokal adhæsion, som vist i figur 5A. I mellemtiden, stress fiber dannelse nær den basale overflade af HT29-KD-celler blev også mindre robust sammenlignet med den i HT29-NS-celler (figur 5A). I modsætning hertil synes CO-029 lyddæmpning at have nogen forstyrrende effekt på dannelsen af ​​adherens krydset, baseret på E-cadherin og β-catenin farvning (figur 5B). Det kortikale meshwork af actin langs sidefladen eller adherens junction udviste ingen markant forskel mellem NS og KD transfektantcellerne (data ikke vist).

HT29 transfektanter blev udpladet på dækglas og dyrket i komplette medier i 2 dage (for vinculin og F-actin-farvning, A), eller indtil konfluens (for E-cadherin og β-catenin-farvning, B). Cellerne blev fikseret, permeabiliseret, og inkuberet med primære mAb’er ved 4 ° C natten over, efterfulgt af Alex Fluor 594-konjugeret sekundært Ab-farvning. F-actin blev farvet af Alex Fluor 594-konjugeret phalloidin. Billederne blev taget med konfokal mikroskopi. Bar = 20 um.

Virkningen af ​​CO-029 Silencing på dannelsen af ​​Tetraspanin beriget Microdomain (TEM)

Da CO-029 forbinder med tetraspanins såsom CD9 og CD151 og laminin-bindende integriner [11] undersøgte vi effekten af ​​CO-029 lyddæmpning på stabiliteten af ​​TEM. De sammenslutninger af CD151 med laminin-bindende integriner α3β1, α6β1, og α6β4 forblev stabil under en stringent lyse tilstand, dvs. 1% Triton X100-medieret cellelysis, mens sammenslutninger af CD151 med andre tetraspanins forblev stabil under kun en relativt mild lysis tilstand, dvs. 1% Brij 97-medieret cellelyse [3]. CO-029 lyddæmpning påvirkede ikke immunpræcipitation profiler af CD151 under enten lyse tilstand (figur 6A). Flere laminin-bindende integriner blev co-udfældet med CD151 under 1% NP40 lyse stand ved CO-029 lyddæmpning. Både CD151 og CD9 forbundet med CO-029 under Brij 97 lyse tilstand 1%, som afsløret af CD151 og CD9 immunudfældningsundersøgelser profiler, mens sådanne sammenslutninger blev afbrudt under 1% Triton X100 lyse tilstand, som forventet. Under Brij 97 lyse tilstand 1%, CO-029 immunopræcipitater afslørede også CD9-CO-029 forening, men ingen CD151-CO-029 association på grund af mindre biotinylering af CD151 og co-migration af CD151 med CO-029 (figur 6A).

(A) overfladen biotinyleret HT29-NS og -KD transfektantcellerne blev lyseret med angivne vaskemiddel buffere. Tetraspanins CD9, CD151, og CO-029 blev immunpræcipiteret fra lysaterne, adskilt af SDS-PAGE, og opdaget af forøget kemiluminescens. Niveauerne af p-actin proteiner i lysater blev undersøgt ved Western blot og tjente som lysat input kontrol. (B) Ekspressionsniveauerne for integrin α3β1-ubundet CD151, CD151 total, homoclustered CD9, og total CD9 ved overfladen af ​​HT29-NS og -KD transfektantcellerne blev målt ved mAb TS151r, 5C11, C9BB, og Mab7 henholdsvis hjælp flowcytometri. De relative niveauer af CD151 og CD9 på KD-celler til NS-celler præsenteres som histogrammer (gennemsnit ± SD, n = 3~5).

Nogle af CD151-proteiner på celleoverfladen, binder integrin α3β1 i en direkte protein-protein-interaktion måde [3]. Vi analyserede niveauet af integrin α3β1-ubundet eller “frie” CD151 proteiner, der er anerkendt af CD151 mAb TS151r [23]. På celleoverfladen, blev hverken størrelsen af ​​frit CD151 eller den samlede CD151-normaliseret niveau af gratis CD151 ændret ved CO-029 lyddæmpning (figur 6B). Tilsvarende er CD9 proteiner på celleoverfladen enten homoclustered eller associeret med stemer [21]. Vi fandt, at hverken størrelsen af ​​homoclustered CD9 eller den samlede CD9-normaliseret niveau for homoclustered CD9 blev ændret ved CO-029 silencing (figur 6B). Tilsammen disse observationer tyder, at CO-029 er ikke påkrævet for interaktionen af ​​CD151 og CD9 med mer.

Diskussion

Tetraspanins regulere tumorprogression og metastase. Men mekanismerne stort set ukendte. På det cellulære niveau, tetraspanins modulere celleadhæsion, migration, spredning, og fusion. Klæbeevne og motilitet af tumorceller delvist bestemme tumor metastatisk potentiale. Derfor på celleniveau, tetraspanins sandsynligvis regulere tumor metastasering ved at modulere evner tumorceller at overholde og flytte. På det molekylære niveau, at tetraspanins associerer med integriner, IgSF proteiner, vækstfaktorer og deres receptorer, proteaser, og intracellulære signalproteiner danne TEM [44] – [47]. Derfor på det molekylære niveau, tetraspanins regulere tumorudvikling og metastase sandsynligvis ved ændring af funktionerne af de associerede proteiner [48] -. [51]

Ekspressionen af ​​tetraspanin CO-029 er typisk forbundet med dårlig prognose af fordøjelsessystemet kræftformer [12], [16], [18], [46], [52], [53], CO-029 opreguleres på progression af kolorektal, lever, bugspytkirtel, og esophageal kræft [11], [ ,,,0],46], [54], og den øgede ekspression af CO-029 fremmer lever- eller lunge metastase af disse kræftformer [17], [52], [53], [55]. Tumor celle migration og invasion er uundværlige for metastaser. Bevægelsen af ​​tumorceller er involveret i mindst to faser i metastase kaskade [52]. Den første fase er at tumorceller migrere væk fra den primære tumor og invadere kredsløbssygdomme; den anden fase er at tumorceller migrerer ud af blodkarrene og til målvæv. Den reducerede celle bevægelse på CO-029 lyddæmpning indikerer, at CO-029 er nødvendig for effektiv migration og invasion af kolorektal cancer celler og foreslår, at CO-029 sandsynligvis fremmer begge stadier af tumor metastase.

CO-029 vises at fremme celle bevægelse ved at ændre celle-matrix og-celle sammenvoksninger. Det er velkendt, at celle-celle og -matrix adhæsion direkte bestemmer cellemotilitet. For eksempel tab eller reduktion af E-cadherin ekspression og /eller aktivitet i tumorceller fører til afsendelse af tumorceller fra primære tumormasse [56].