PLoS ONE: The NOD-lignende receptor Signalering Pathway i Helicobacter pylori infektion og relaterede Gastric Cancer: En Case-Control Study og Gene Expression Analyser

Abstrakt

Baggrund

I øjeblikket er det velkendt, at kræft opstår i kronisk betændt væv. En række NOD-lignende receptorer (NLRs) danner inflammasomes, intracellulære multiprotein komplekser kritiske til generering modne proinflammatoriske cytokiner (IL-1 og IL-18). Som kronisk betændelse i maveslimhinden er en konsekvens af

Helicobacter pylori

infektion, undersøgte vi rollen af ​​genetiske polymorfier og ekspression af gener involveret i NLR signalvejen i

H. pylori

infektion og relaterede mavekræft (GC).

Materialer og metoder

Fifty-én genetiske polymorfier blev genotype i 310 etniske Chinese (87 ikke-Cardia GC tilfælde og 223 kontroller med funktionel dyspepsi). Derudover blev genekspression af 84 molekyler involveret i NLR signalvejen vurderet i THP-1-celler udfordret med to

H. pylori s

tog, GC026 (GC) og 26.695 (gastritis).

Resultater

CARD8

-rs11672725,

NLRP3

-rs10754558,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs199475867 og

NLRX1

-rs10790286 viste signifikante sammenhænge med GC. På multivariat analyse,

CARD8

-rs11672725 forblev en risikofaktor (OR: 4,80, 95% CI: 1,39-16,58). Endvidere

NLRP12-

rs2866112 øgede risikoen for

H. pylori

infektion (OR: 2,13, 95% CI: 1,22-3,71). Statistiske analyser at vurdere fælles effekt af

H. pylori

infektion og de udvalgte polymorfier afslørede stærke associationer med GC (

CARD8

,

NLRP3

,

CASP1

og

NLRP12

polymorfier). I genekspression analyser blev fem gener, der koder NLRs væsentligt reguleret i

H. pylori

-challenged celler (

NLRC4

,

NLRC5

,

NLRP9

,

NLRP12

og

NLRX1

). Interessant, vedholdende opregulering af

NFKB1

med samtidig nedregulering af

NLRP12

og

NLRX1

blev observeret i

H. pylori

GC026-udfordrede celler. Endvidere NF-KB target gener, der koder proinflammatoriske cytokiner, chemokiner og molekyler involveret i carcinogenese var markant opreguleret i

H. pylori

GC026-udfordrede celler.

Konklusioner

Nye sammenhænge mellem polymorfier i NLR signalvejen (

CARD8

,

NLRP3

,

NLRP12

,

NLRX1

, og

CASP1

) og GC blev identificeret i kinesiske individer. Vores genetiske polymorfier og genekspression resultater fremhæve relevansen af ​​NLR signalvejen i gastrisk carcinogenese og dens tætte samspil med NF-KB

Henvisning:. Castaño-Rodríguez N, Kaakoush NO, Goh KL, Fock KM, Mitchell HM (2014) The NOD-lignende receptor Signalering Pathway i

Helicobacter pylori

Infektion og relaterede Gastric Cancer: En Case-Control Study og genekspression Analyser. PLoS ONE 9 (6): e98899. doi: 10,1371 /journal.pone.0098899

Redaktør: David M. Ojcius, University of California Merced, USA

Modtaget: 2. marts, 2014 Accepteret: 8. maj 2014 Udgivet: 5 juni 2014

Copyright: © 2014 Castaño-Rodríguez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af The Cancer Råd i New South Wales, Australien (Grant No.66 /04). INGEN. Kaakoush understøttes af en tidlig karriere stipendium fra National Health og Medical Research Council, Australien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den samlede incidens af mavekræft (GC) varierer meget mellem landene. Ifølge globale statistikker kræft, skønnes i alt 952,000 nye GC tilfælde og 723.000 GC dødsfald at have fundet sted i 2012, tegner sig for 6,8% af de samlede kræfttilfælde og 8,8% af de samlede dødsfald kræftrelaterede [1]. Over 70% af nye tilfælde og dødsfald sker i udviklingslande, med de højeste incidensrater rapporteres i Østasien, Østeuropa og Central- og Sydamerika [2].

bakterielt patogen

Helicobacter pylori

er en væsentlig ætiologisk faktor for GC (IARC, 1994), men tidligere undersøgelser tyder på, at der ud over

H. pylori

infektion og kostfaktorer, host genetik bidrager til GC [3]. Genetiske polymorfier er opstået i de seneste år som determinanter for sygdomsmodtagelighed og sværhedsgrad, hvilket er især tilfældet i gastrointestinal malignitet [4]. Derfor kan polymorfier i gener involveret i medfødte og adaptive immunitet spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​

H. pylori

infektion og udvikling af

H. pylori

-relaterede komplikationer, herunder GC.

Kim-line kodet receptorer kaldet mønster-genkendelse receptorer (PRRS) er en del af det medfødte immunsystem og er afgørende for påvisning af invariante mikrobielle motiver kendt som patogen associeret molekylære mønstre (PAMPs). PRRS er blevet inddelt i fem forskellige genetiske og funktionelle clader: nukleotid-bindende Oligomeriseringsdomænet (NOD) -lignende receptorer (NLRs), Toll-lignende receptorer, C-type lectin-receptorer, retinsyre-inducerbart gen (RIG) -I-lignende receptorer og fraværende i melanom 2 (AIM2) -lignende receptorer [5] [6].

NLR familien ikke kun anerkende PAMPs men også skade-associerede molekylære mønstre (dæmper) i cytoplasmaet, som er endogene ligander fremstillet efter vævsbeskadigelse eller celledød [7]. Den NLRs karakteristiske struktur indbefatter en central nukleotid-bindende og oligomerisering (NACHT) domæne, som er til stede i alle NLR familiemedlemmer, en C-terminal leucin-rige gentagelser (LRRs) og en N-terminal caspase rekruttering (CARD) eller pyrin (PYD ) domæne. Baseret på fylogenetisk analyse af Nacht domæner, blev det bestemt, at NLR familien omfatter tre underfamilier: 1) NOD familie, som omfatter NOD1-2, NOD 3 /NLRC3, NOD4 /NLRC5, NOD5 /NLRX1 og CIITA, 2) de NLRPs herunder NLRP1-14 (også kendt som NALPs), og 3) IPAF underfamilien, som består af IPAF (NLRC4) og NAIP [7]. NLRP3 Inflammasome, den mest fuldstændigt karakteriseret inflammasome, består af NLRP3 scaffold protein, hvilken apoptose associeret plet-lignende protein (ASC) og caspase-1. NLRP3 interagerer og rekrutterer adapteren ASC via PYD-PYD interaktion [8]. Denne interaktion fører til rekruttering af caspase-1, en intracellulær aspartat specifikke cystein protease, som efterfølgende vil føre til modning og frigivelse af proinflammatoriske cytokiner såsom IL-1β og IL-18.

I

H. pylori

infektion, de første fire fysisk-kemiske barrierer er slim lag, gastriske epitelceller, de TLRs og NLRs. Et begrænset antal studier har vurderet samspillet mellem NLR signalvejen og

H. pylori

. For eksempel kan en indledende undersøgelse af Basak et al. [9] viste, at ikke kun

H. pylori

lipopolysaccharid (LPS) aktiverer caspase-1, men at denne caspase-1-aktivering er involveret i LPS-induceret IL-1β modning. Senere Hitzler et al. [10] viste, at

H. pylori

infektion aktiverer caspase-1, hvilket fører til IL-1β /IL-18 behandling og sekretion, både i dyrkede dendritiske celler (DC’er) og

in vivo

. Konsekvent, to nylige undersøgelser, der anvender humane gastriske cellelinjer, bekræftet forøget ekspression af caspase-1, IL-1β og IL-18 i

H. pylori

-inficerede celler [11], [12]. Endvidere en nylig undersøgelse fra Kim et al. [13] har vist, at sekretion af IL-1β ved DC’er inficeret med

H. pylori

kræver TLR2, NOD2 og NLRP3 inflammasome.

Derfor tidligere undersøgelser viser klart, at som svar på

H. pylori

, inflammasome-afhængig caspase-1-aktivering er kritisk for generering modne proinflammatoriske cytokiner, som er afgørende for Th1-reaktioner forbundet med gastrisk immunpatologi. I betragtning af at lidt er kendt om den rolle inflammasomes og andre molekyler, der er involveret i NLR signalvejen som reaktion på

H. pylori

infektion, og at funktionelt relevante polymorfier i gener af denne arm af immunsystemet har potentiale til at påvirke størrelsen og retningen af ​​værtens respons mod infektion, undersøgte vi rolle NLR signalvejen, herunder inflammasome- relaterede molekyler, i

H. pylori

-relaterede GC udvikling ved at vurdere 51 genetiske polymorfier i kinesiske individer, en kendt høj risiko population til GC, og behandle genekspression af 84 molekyler involveret i NLR signalveje i en monocytiske cellelinje ved udsættelse for

H . pylori

.

Materialer og metoder

genotypebestemmes Polymorphisms involveret i NOD-lignende receptor Signalering Pathway

Etik erklæring.

Denne undersøgelse var godkendt af human etiske komité (HREC) fra University of New South Wales (UNSW) (HREC 08.115 og HREC 02144). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver enkelt rekrutteret til undersøgelsen.

Undersøgelse fag.

Emner var etniske kinesiske individer, som gennemgik øvre gastrointestinal endoskopi på Changi General Hospital (Singapore) og University Hospital af Malaysia (Kuala Lumpur), mellem januar 2004 og april 2007. Patienter vides at være inficeret med human immundefekt virus, eller som var blevet ordineret non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler, antimikrobielle midler eller syre suppressants i den periode på to måneder forud for ansættelsen, blev udelukket.

Eighty-syv patienter nyligt diagnosticeret med en primær ikke-Cardia GC (International Classification of Diseases, 9

th revision, kode 151) baseret på histologisk bekræftelse blev inviteret til at deltage i Studiet. Kontrolgruppen bestod 223 personer diagnosticeret med funktionel dyspepsi (FD), som blev defineret som vedvarende eller tilbagevendende symptomer (smerte eller ubehag centreret i den øvre del af maven) i fravær af organisk sygdom (herunder på øverste endoskopi), i overensstemmelse med Rom II klassifikationssystem [14].

Helicobacter pylori

afsløring.

H. pylori

IgG-antistoffer i disse kinesiske individer blev bestemt under anvendelse af et internt enzymbundet immunosorbentassay [15] og immunoblot (MPD helico Blot 2,1, MP Biomedicals, Australien).

Polymorphisms markering.

Elektroniske databaser (PubMed, Scopus, Science Direct, Ovid, Biosis Previews, Scirus databaser CINAHL, IMBIOMED, ​​Scielo og syrener) blev søgt op til februar 2013 for polymorfier involveret i NLR signalvejen, der var forbundet med kræft, infektiøs sygdom eller var funktionelt relevant. Halvtreds én polymorfier i 6 gener, som blev rapporteret til at have en mindre allel frekvens . 1% i National Center for Biotechnology Information (NCBI) dbSNP, blev udvalgt til analyse (tabel S1 i tabel S1)

genotypebestemmelse teknikker.

i genotypebestemmelse af de 51 udvalgte polymorfier i NLR signalvejen enkelte indgår i undersøgelsen, genomisk DNA blev ekstraheret fra perifere fuldblodsprøver ved anvendelse QIAamp Blood DNA Mini Kit som beskrevet af fabrikanten (Qiagen, Chadstone, Australien). DNA blev rehydreret i sterilt vand og normaliseret til 10 ng /pl for brugerdefineret SNP genotyping gennem anvendelse af maldi time-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri, den Sequenom MassARRAY IPLEX? Assay (San Diego, CA , USA) [16], [17] ved Australian Genome Research Facility Ltd., St. Lucia, University of Queensland, Australien.

En polymorfi, der ikke kunne indgå i Sequenom MassARRAY IPLEX assay, kendt som

NLRP3-

42 bp-VNTR blev genotype gennem standard PCR. Primere blev designet med Oligo Primer Analysis Software version 6.71 (Molekylærbiologi Insights, Inc; Colorado Springs, USA). Eksperimenter blev udført ved anvendelse af 2720 termisk cykliseringsapparat (Applied Biosystems, Foster City, USA). PCR-produkter blev underkastet 1,5% agarosegelelektroforese og visualiseret under UV-gennemlysning hjælp af Gel Doc 2000-systemet (Bio-Rad, Hercules, USA). Primersekvenserne og termiske cykelforhold for genotypning af denne polymorfi er beskrevet i tabel S2 i i tabel S1.

Fire polymorfier (

CARD8

-rs2043211,

CARD8

-rs6509368 ,

CARD8

-rs12984929 og

NLRP3

-rs10754558) genotype af MALDI-TOF massespektrometri blev tilfældigt udvalgt til bekræftelse af resultater ved hjælp af real-time PCR. Primersekvenserne og termisk cykling betingelser er angivet i tabel S2 i tabel S1. Som en validering af metoden implementeret til genotypebestemmelse af

NLRP3-

42 bp-VNTR blev sekventering analyser udført i 10% af tilfældigt udvalgte studier prøver på Ramaciotti Center, UNSW, Australien.

Statistisk analyse.

uparret Students

t

-test blev anvendt til at analysere de kliniske karakteristika. Den direkte tælling blev anvendt til at estimere genotype og allelfrekvenserne. Afvigelse fra Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) blev testet ved hjælp af chi-square goodness-of-fit test (χ

2). Bestemmelse af koblingsuligevægt (LD) var baseret på en risiko kvotientkriteriet hvor betydningen af ​​den observerede likelihood ratio findes ved at beregne null fordeling af dette forhold under hypotesen om koblingsligevægt, under anvendelse af en permutation procedure [18]. Haplotype inferens blev udført ved hjælp af forventningen-Maximization (EM) algoritme for multi-locus genotypiske data [19]. De odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CI) blev beregnet ved hjælp af Fishers eksakte sandsynlighedstest (to-halet

s

-værdier). For at korrigere for forstyrrende faktorer, en binær logistisk regression (LR) justeret af

H. pylori

status og køn blev udført.

P

-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Kvalitet filtre til udelukkelse af polymorfier fra den statistiske analyse omfattede kalder på under 95% og afvigelse fra HWE. Dataene blev analyseret ved hjælp af programmer Arlequin version 3.1 [20], GraphPad Prism-version 5.02 (GraphPad Software Inc; San Diego, USA) og SPSS-version 19.0.0. (SPSS Inc., Chicago, USA)

Gene Expression af molekyler involveret i NOD-lignende receptor Signalering Pathway

pattedyr cellekultur

den humane monocytiske leukæmi-cellelinje THP-1 (kode: TIB-202). (American Type Culture opsamlingen Manassas, USA), blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Mulgrave, Australien), 1 mM natriumpyruvat (Invitrogen), 2500 mg /l natriumbicarbonat (Invitrogen ) og 100 ug /ml penicillin-streptomycin-opløsning (Invitrogen). Celler blev holdt i 25 cm

2 vævskulturkolber (Greiner-Bio-On, Frickenhausen, Tyskland).. Ved 37 ° C med 5% CO

2

Bakteriekultur

H pylori

stammen GC026 (

CagA

+,

Cage

+,

CAGL

+,

CAGT

+ ,

Vaca

s1 m1 +,

Baba

+,

oipA

+,

Dupa

+ og

SABA

+) blev isoleret fra en GC patient på University Hospital i Malaysia, Kuala Lumpur [21], [22].

H. pylori

stamme 26.695 (

CagA

+ og

VacA

s1m1 +) blev isoleret fra en patient med gastritis [23] (ATCC kode 700.392). Begge

H. pylori

stammer blev dyrket i to dage på hest blodagarplader (Blood Agar Base No.2 suppleret med 6% steril defibrineret hesteblod (Oxoid, Heidelberg West, Vic., Australien) ved 37 ° C i et anaerobt beholder indeholdende en gas genererer kit (Oxoid) at give en mikroaerob atmosfære af 6% O

2, 10% CO

2 og 84% N

2.

Infektion assay.

THP-1-celler blev podet i en 6-brønds dyrkningsplade i en koncentration på 5 × 10

5 celler /ml og efterfølgende differentieret til makrofager med phorbol myrastate acetat (Sigma-Aldrich) i 72 timer [24]. forud for bakteriel infektion blev pattedyrceller inkuberet i antibiotisk medium.

H. pylori

stammerne GC026 og 26.695 blev derefter tilsat til mediet ved en infektionsmultiplicitet på 1, og inkuberet i 6 timer ved 37 ° C og 5% CO

2. Den bakterielle koncentration tilføjet bestemmes på grundlag af en standardkurve og optisk densitet (OD) aflæsninger ved 595 nm ved hjælp af en Bio-Rad mikropladelæser model 550 (Bio-Rad). Den faktiske koncentration tilsat blev bekræftet ved at tælle kolonidannende enheder (CFU) dyrket på hesteblod-agarplader efter seriel fortynding af bakteriesuspensionen. Salg

RNA-ekstraktionsmetoder, cDNA forberedelse og PCR arrays.

Efter infektion, ikke-udfordret og

H. pylori

-challenged THP-1-celler blev anvendt til isolering af mRNA under anvendelse af Qiagen RNeasy Mini Kit, som beskrevet af producenten (Qiagen). Til analysen af ​​genekspressionen af ​​84 molekyler involveret i NLR signalvejen, blev cDNA syntetiseret ud fra 0,8 pg totalt RNA ved anvendelse af RT

2 First Strand cDNA Kit (Qiagen) og yderligere analyseret ved anvendelse af human Inflammasome RT

2 Profiler PCR array (PAH’er-097R) (Qiagen) som anbefalet af producenten. Genekspressionsprofiler blev opnået fra tre uafhængige forsøg i

H. pylori

GC026-smittet,

H. pylori

26.695-inficeret og tilsvarende ikke-inficerede (kontrol) prøver. Forsøgene blev udført ansætte de Rotor-Gene Q cycler (Corbett Life Sciences, Doncaster, Australien).

Til analyse genekspression data blev ΔΔ Ct-baserede metode til relativ kvantificering implementeres ved hjælp af webbaserede RT

2 Profiler PCR Array data Analysis version 3.5 (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). Mindst to-fold ændringer (≥2, ≤0.5) og

P

-værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

SDS-PAGE og Western Blotting

THP -1 celler blev podet, differentieret og inficeret ved en MOI på 1, som tidligere beskrevet. Proteiner blev ekstraheret ved anvendelse af RIPA buffer, separeret på 12% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese geler og overført til methanol-behandlede polyvinylidine difluorid membraner ved anvendelse af Trans-blot-celle transfersystemet (Bio-Rad). Membraner blev immunolabeled med kanin-anti-humane polyklonale antistoffer mod NLRX1 (1:200) eller muse-anti-humane monoklonale antistoffer mod β-actin (1:1000) (Santa Cruz). Gede-anti-kanin og anti-mus IgG antistoffer koblet til HRP (1:2000; Bio-Rad) blev anvendt som sekundære antistoffer, henholdsvis. Membraner blev undersøgt i overensstemmelse med Pierce ECL vestlige blotting Substrat protokol (Thermo Scientific, Scoresby, Australien).

Resultater

kliniske karakteristika

De kliniske karakteristika for forsøgspersonerne herunder køn,

H. pylori

infektion status og median alder er vist i tabel S3 i tabel S1. Mand køn viste sig at være mere fremherskende i GC patienter end i FD kontroller, som viser en positiv sammenhæng med udviklingen af ​​GC i denne etniske kinesiske befolkning (OR: 2,15, 95% CI: 1,29-3,58,

P

-værdi: 0,0036).

H. pylori

infektion blev fundet at være til stede i 68,7% af personer i denne undersøgelse (73/87 GC patienter og 140/223 FD kontroller). Sammenligning af forekomsten af ​​

H. pylori

infektion i GC patienter og FD kontroller viste, at

H. pylori

infektion var en risikofaktor for udvikling af GC (OR: 2,38, 95% CI: 1,41-3,99,

P

-værdi: 0,0001). Selvom emner i denne undersøgelse blev matchet efter 5-års aldersgrupper, median alder af GC patienter (65,3 år) var signifikant højere end for FD kontrol (54,3 år) (

P

-værdi: . 0,0001)

polymorfier i gener involveret i NOD-lignende receptor signalering pathway er forbundet med mavekræft i etniske kinesiske Personer

Fifty-én polymorfier i gener involveret i NLR signalvejen var genotype i 310 etniske kinesiske individer (87 GC tilfælde og 223 FD kontroller). Opkaldet på alle de valgte polymorfier var 97-100% i denne undersøgelse. Alle polymorfier i NLR signalvejen viste sig at være i HWE i kontrolgruppen viser ikke-signifikant χ

2 værdier undtagen

CARD8

-rs12984929 (χ

2: 35,98),

CARD8-

rs4802445 (χ

2: 5,87) og

CARD8-

rs6509368 (χ

2: 5,43). Tyve én polymorfier i

NLRP3

(n = 5),

NLRP12

(n = 3),

NLRX1

(n = 3),

ASC

(n = 4) og

CASP1

(n = 6) blev fundet at være ikke-polymorfe i denne etniske kinesiske befolkning (tabel S1 i i tabel S1).

allel og genotypefrekvenser som samt yderste periferi og 95% CI for de resterende 27 polymorfier er vist i tabel 1 og tabel S4 i tabel S1.

CARD8

-rs11672725 TT genotypen viste en stærk sammenhæng med GC i bivariate statistiske analyse (OR: 4,80, 95% CI: 1,39-16,58). Ud over

CARD8

-rs11672725 viste yderligere fire polymorfier grænsetilfælde resultater i bivariate analyse (

NLRP3

-rs10754558,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs199475867 og

NLRX1

-rs10790286) (tabel 1). Yderligere multivariate statistiske analyser, justerer for

H. pylori

infektion og mandlige køn, viste, at

CARD8

-rs11672725 TT genotypen forblev en risikofaktor for GC i denne etniske kinesiske befolkning (Tabel 2).

Haplotype-baserede analyser er en effektiv metode til at dissekere arkitekturen af ​​komplekse sygdomme. I den aktuelle undersøgelse, EM-algoritmen identificeret 25 haplotyper med en frekvens 0,01 i GC tilfælde (tabel S5 i tabel S1). Brug den store haplotype i kontrolgruppen som reference haplotypen, to

CARD8-NLRP12 Hotel (Hap1 og Hap8), en

NLRP3

(Hap3) og tre

NLRX1-CASP1

(Hap21, 23 og 24) haplotyper viste sig at øge risikoen for GC i denne etniske kinesiske befolkning. Interessant, Hap1 huser

CARD8

-rs11672725 T-allelen, og Hap21 og Hap23 havnen

NLRX1

-rs10790286 C allel, der viser sammenhæng med de opnåede resultater fra allelen og genotype analyser.

polymorfier i gener involveret i NOD-lignende receptor Signalering Pathway er associeret med

Helicobacter Pylori

Infektion i etniske kinesiske Personer

Da

H. pylori

vides at være en væsentlig risikofaktor i forbindelse med GC, blev foretaget yderligere undersøgelser for at vurdere sammenhængen mellem genetiske polymorfier involveret i NLR signalvejen og

H. pylori

infektion. Interessant, viste vores etniske kinesiske case-kontrol undersøgelse, at

NLRX1

-rs10790286,

NLRP12

-rs2866112,

NLRP12

-rs4419163 og

ASC

-rs8056505 var forbundet med en signifikant øget risiko for

H. pylori

infektion i disse individer (Tabel S6 i tabel S1). Multivariat statistisk analyse bekræftede, at

NLRP12

-rs2866112 var forbundet med en øget risiko for

H. pylori

i kinesiske individer (OR: 2,13, 95% CI: 1,22-3,71)

Fælles Effekt af

Helicobacter Pylori

Infektion og genetiske polymorfier Markant øger risikoen for mavekræft i. etniske kinesiske Individer

Yderligere analyser blev udført for at vurdere ikke blot tilstedeværelsen eller fraværet af de valgte polymorfier men også

H. pylori

status i forhold til risikoen for GC, i et forsøg på at fastslå, at biologisk vekselvirkning i form af synergisme eller antagonisme. Slående, enkeltpersoner huser ti af de udvalgte polymorfier (

CARD8

-rs10405717,

NLRP3

-rs12079994,

NLRP3

-rs3806265,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs2866112,

NLRP12

-rs4419163,

NLRX1

-rs10790286,

CASP1

-rs2282659,

CASP1

-rs530537 og

CASP1

-rs61751523) og inficeret med

H. pylori

blev observeret at være højst risiko for GC, de fleste af disse regioners er i området 4,0-5,0 (tabel 3). I modsætning hertil i mangel af

H. pylori

infektion,

CARD8

-rs2043211 faldt betydeligt risikoen for GC (OR: 0,19, 95% CI: 0,06-0,63).

Helicobacter Pylori

Påvirker Angivelse af flere molekyler involveret i NOD-lignende receptor Signalering Pathway

for yderligere at karakterisere effekten af ​​

H. pylori

på molekyler der er involveret i NLR signalvejen, vurderede vi udtryk for 84 gener, der koder NLRs, andre Inflammasome komponenter, negative regulatorer, pro-inflammatoriske cytokiner, pro-inflammatoriske caspaser og molekyler involveret i nedstrøms signalering, i THP-1 -afledte makrofager efter eksponering for to forskellige

H. pylori

stammer (GC026 og 26695). I

H. pylori

GC026-udfordrede THP1-celler, 49 gener blev differentielt udtrykt i sammenligning med kontrolgruppen (tabel S7 i tabel S1 og fig S1 i fig S1). Af disse blev statistisk signifikant opregulering og nedregulering af mindst to gange fundet i 17 og 28 gener, henholdsvis (tabel 4 og 5). Tredive fem gener differentielt udtrykt mellem kontrolgruppen og gruppen eksponeret for

H. pylori

26.695 (tabel S7 i tabel S1 og S2 Figur i fig S1). Af disse blev statistisk signifikant opregulering og nedregulering af mindst to gange fundet i 5 og 23 gener, henholdsvis (tabel 4 og 5).

Helicobacter pylori

Stammer associeret med mavekræft og Gastritis føre til forskellige Expression Niveauer af cytokiner og kemokiner

i betragtning af at inflammation er kendetegnende for gastrisk carcinogenese, vi analyseret yderligere udtryk for pro-inflammatoriske cytokiner og chemokiner ved udsættelse til to

H. pylori

stammer. Udtrykket af ni gener, der koder pro-inflammatoriske cytokiner (

IFNB1

,

IL1B

,

IL12B

,

IL6

,

IL33

og

TNF

) og kemokiner (

CXCL1

,

CXCL2, CCL5

) var signifikant opreguleret i THP-1-celler udfordret med både

H. pylori

GC026 og 26695 stammer (tabel 4). Endvidere en intens immunrespons (

CXCL1

,

CXCL2

,

CCL5

,

IL6

,

IL12B

,

TNF

og

IFNB1

) blev indledt mod

H. pylori

GC026 (figur 1A). Interessant, en række gener, der koder kemokiner (

CCL2

CCL7

) og cytokiner (

IL18

,

TNFSF11

og

CD40LG

) blev nedreguleret i

H. pylori

-challenged THP-1-celler (tabel 5).

A), Gene ekspression af cytokiner og chemokiner i

H. pylori

-challenged THP-1 celler, B) Gen-ekspression af NOD-lignende receptorer i

H. pylori

-challenged THP-1 celler, C)

NFKB1

udtryk i

H. pylori

-challenged THP-1 celler og D)

PTGS2

BIRC3

udtryk i

H. pylori

-challenged THP-1-celler. Fold-ændring (2∧ (-delta Delta Ct)) er den normaliserede genekspression (2∧ (-delta Ct)) i THP-1 celler udfordret med

H. pylori

(GC026 og 26.695) divideret den normaliserede genekspression (2∧ (-delta Ct)) i deres respektive kontrolgruppe. Fold-regulering repræsenterer fold-ændring resulterer i en biologisk meningsfuld måde. Fold-change værdier større end en indikerer opregulering, og fold-forordningen er lig med fold-ændringen. Fold-ændre værdier mindre end én indikerer nedregulering, og fold-forordningen er den negative inverse af fold-ændringen. Fold-forskel sammenlignet med kontrolgruppen viser en *

P

-værdi 0,05 og en **

P

-værdi 0,01.

P

-værdier blev opnået med en t-test.

Helicobacter pylori

Infektion Resultater i opregulering af

NFKB1

med Samtidig Markeret nedregulering af

NLRP12

og

NLRX1

Tretten gener, der koder NLRs blev vurderet i denne undersøgelse, herunder medlemmer af IPAF underfamilien (NAIP, NLRC4), NLRPs ( NLRP1, NLRP3-6, NLRP9, NLRP12) og nikker (NOD2, NLRC5, NLRX1 og CIITA) (Figur 1B). Ekspressionen af ​​fem gener kodende NLRs var signifikant reguleret i H. pylori-inficerede celler (NLRC4, NLRC5, NLRP9, NLRP12 og NLRX1) (tabel 5). Af disse NLRP12 (fold regulering: 0,03, p-værdi: 0,016298) og NLRX1 (fold regulering: 0,02, p-værdi: 0,01762) blev markant nedreguleret i H. pylori GC026-udfordret celler. Som en validering teknik, yderligere Western blot analyser undersøger NLRX1 udtryk, blev gennemført. Konsekvent, nedsat NLRX1 niveauer blev fundet i THP-1-celler udfordret med både H. pylori GC026 og 26.695 (Støtte Information Figur S3).

Da NF-KB negativt reguleres af NLRP12 og NLRX1, vi yderligere i forhold udtryk for

NFKB1

RELA

mellem

H. pylori

GC026- og 26.695-udfordrede celler. Bemærkelsesværdigt, selv om

RELA

viste faldt niveauer i THP-1 celler udsat for både

H. pylori

stammer (fold regulering: 0,49,

s

-værdi: 0,044673 og fold regulering: 0,26,

s

-værdi:. 0,131017 for

H pylori

GC026 og 26.695 henholdsvis), statistisk signifikant opregulering af

NFKB1

blev kun observeret i

H. pylori

GC026-udfordrede celler (fold regulering: 2,50,

s

-værdi: 0,006825). (Figur 1C)

Helicobacter Pylori

Øger Angivelse af

PTGS2

BIRC3

Angivelse af andre molekyler, der er involveret, ikke kun i NLR signalvejen, men også i carcinogenese blev også analyseret ved at sammenligne THP-1 celler reaktioner på både

H. pylori

stammer. Interessant,

PTGS2

var signifikant opreguleret i THP-1 celler efter udsættelse for både

H. pylori

stammer,

H. pylori

GC026-udfordrede celler (fold regulering: 54,03,

s

-værdi: 0,0247), der viser signifikant højere ekspressionsniveauer sammenlignet med

H. pylori

26.695-udfordret celler (fold regulering: 19,56,

s

-værdi: 0,016089) (figur 1d). Endvidere et andet gen er involveret i carcinogenese,

BIRC3

, var udelukkende opreguleret i

H. pylori

GC026-udfordrede celler (fold regulering: 12,28,

s

-værdi: 0,001638). (Figur 1D)

Diskussion

GC er nu betragtes som en multifaktoriel proces, hvor bakterier, miljømæssige og værten genetik faktorer er involveret på forskellige stadier i kræft patofysiologi. I øjeblikket er det veletableret, at kræft opstår i kronisk betændt væv, og dette er særlig bemærkelsesværdig i mavetarmkanalen [4]. Som kronisk betændelse i maveslimhinden er en konsekvens af

H. pylori

infektion og denne bakterie er i første omgang målrettet efter PRRS, undersøgte vi rollen af ​​molekyler, der er involveret i NLR signalvejen i

H. Tabel S1. Tabel S2. Tabel S3. Tabel S4. Tabel S5.