PLoS ONE: Hæmning af histondeacetylaseaktivitet Impacts Cancer Stamceller og inducerer Epithelial-mesenkym Overgang af hoved og hals Cancer

Abstrakt

Genomet er organiseret og pakkes ind i kernen gennem interaktioner med kerne histon proteiner. Nye beviser tyder på, at tumorer er meget lydhøre over for epigenetiske ændringer, der inducerer kromatin-baserede arrangementer og dynamisk påvirke tumor adfærd. Vi undersøgte kromatin organisation i hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) under anvendelse acetyleringsniveauer af histon 3 som en markør for chromatin komprimering. Sammenlignet med kontrol orale keratinocytter, fandt vi, at HNSCC celler hypoacetylated og at microenvironmental stikord (fx mikrovaskulaturen endotelceller) inducere tumor acetylering. Endvidere fandt vi, at kemisk hæmning af histondeacetylaser (HDAC) reducerer antallet af cancer stamceller (CSC) og hæmmer klonogent sfære formation. Paradoksalt inhibering af HDAC også induceret epithelial-mesenchymal overgang (EMT) i HNSCC celler, akkumulering af BMI-1, et onkogen forbundet med tumor aggressivitet, og ekspression af det vimentin mesenchymale markør. Vigtigt er det, observerede vi co-ekspression af vimentin og acetyleret histon 3 ved invasionen foran humane HNSCC tumorvæv. Kollektivt, disse resultater tyder på, at miljømæssige signaler, såsom endotelcellespecifikke udskilles faktorer, modulere tumor plasticitet ved at begrænse befolkningen i CSC og fremkalde EMT. Derfor kan hæmning af HDAC udgøre en roman strategi at forstyrre befolkningen i CSC i hoved og hals tumorer til at skabe en homogen population af kræftceller med biologisk definerede signaturer og forudsigelig adfærd

Henvisning:. Giudice FS, Pinto DS Jr, Nor JE, Squarize CH, Castilho RM (2013) Hæmning af histondeacetylaseaktivitet Impacts Cancer Stamceller og inducerer Epithelial-mesenkym Overgang af hoved- og halscancer. PLoS ONE 8 (3): e58672. doi: 10,1371 /journal.pone.0058672

Redaktør: Irene Söderhäll, Uppsala Universitet, Sverige

Modtaget: November 6, 2012; Accepteret: 5 feb 2013; Udgivet: 20 mar 2013

Copyright: © 2013 Giudice et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (NIH /NCI) P50-CA97248 (University of Michigan hoved og hals SPORE); og ved tilskud R01-DE21139 fra NIH /NIDCR (JEN). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blandt maligne hoved og hals tumorer, hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er de mest almindelige epitelial neoplasi og er en af ​​de seks mest almindelige maligne sygdomme på verdensplan [1]. HNSCC er karakteriseret ved læsioner i mundhulen, svælget og svælg. På trods af bestræbelserne på at udvikle biomarkører til tidlig opdagelse og prognose, har overlevelse HNSCC patienter ikke væsentligt forbedret [2]. Udviklingen af ​​nye behandlingsformer, der forbedrer overlevelsen og livskvaliteten for patienter med HNSCC er et presserende behov.

initiering og progression af kræft er primært styret af genetiske og epigenetiske begivenheder, der påvirker genekspression [3]. Epigenetiske ændringer kan regulere genekspression uafhængigt af genomiske mutationer. Epigenetiske vekslen er almindeligt observeret ved DNA methylering og histon modifikation [4], [5]. Histoner kan modificeres posttranslationelt til lysin acetylering og ubiquitinering, serin-phosphorylering, sumoylation, og methylering af lysiner og argininer [6]. Histonacetyltransferaser (HAT) katalyserer overførslen af ​​en acetylgruppe fra acetyl-co-A til e-amino site af lysin, hvilket resulterer i chromatin dekondensering. I modsætning hertil histondeacetylaser (HDAC) handle på lysin rester til kompakt kromatin og undertrykke gentranskription [7], [8]. Interessant, er effekten af ​​HDAC på kromatin organisation også forbundet med regulering og vedligeholdelse af stamceller pluripotens i samarbejde med en lang række signalveje [9], [10]. Imidlertid er chromatinkondensation også forbundet med kemoresistens i tumorer [11] – [14]. Denne fænotype er delvist tilskrives specialiserede celler, der reaktivere stamcelle-lignende transskription programmer [15]. Disse cancer stamceller (CSC) er karakteriseret ved en høj proliferativ hastighed, aggressiv adfærd, metastatisk potentiale, og evnen til at forny sig selv [16] – [25]. CSC er vigtige terapeutiske mål for kræft [26], og den kliniske gavn af direkte rettet mod CSC er under efterforskning. Vi ønskede at bestemme, hvorvidt forstyrre chromatinkondensering, vides at spille en central rolle i opretholdelsen af ​​normale stamceller [9], [10], ville påvirke tumor adfærd og CSC indhold. Vi observerede hypoacetylated kromatin i et panel af HNSCC-afledte cellelinier og identificeret et distinkt population af CSC i disse celler. Disse observationer fik os til at spørge, om kromatin acetylering dikterer den biologiske opførsel af tumorer, og om farmakologisk interferens med HDAC ændrer CSC adfærd. Vi fandt, at hæmning af HDAC forstyrrer ophobning af CSC og paradoksalt nok inducerer tumorceller til at undergå epitelial-mesenkymale overgang (EMT).

Materialer og metoder

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Vi anvendte HNSCC cellelinjer genereret fra kirurgisk fjernelse af primære tumorer lokaliseret i tungen (HN6, HN13 og Cal 27), pharynx (HN30), larynx (Hep2) og afledt af en tunge tumor, der metastaseret til lymfeknuder (HN12 ) [27], [28]. Normal oral keratinocyt spontant udødeliggjort cellelinie (NOK-SI) er tidligere etableret og venligst stillet til rådighed af Dr. Gutkind fra National Institute of Dental og kraniofaciale Research (NIDCR /NIH) [29]. NIH /3T3 normal fibroblast cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, USA) og dyrket under anvendelse af DMEM (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) suppleret med 10% bovint kalveserum ( Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 250 ng /ml amphotericin B (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Celler blev holdt i en 5% CO2-befugtet inkubator. Primære humane dermale mikrovaskulære endotelceller. (HDMEC, Lonza, Walkersville, MD, USA) blev fremstillet i serumfrit endotel basalmedium (Lonza, Walkersville, MD, USA)

Western blotting

tumorceller blev lyseret med cellelyse-buffer indeholdende proteaseinhibitorer og kortvarigt lydbehandlet. Totalt protein blev opløst på en 10-15% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en Immobilon-FL polyvinyldifluorid membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Membraner blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk indeholdende 0,1 M Tris (pH 7,5), 0,9% NaCI og 0,05% Tween-20 i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev inkuberet med vimentin (klon V9, 1 500, Dako, Carpinteria, CA, USA), BMI-1 (1 500, Millipore, Billerica, MA, USA), acetyl-histon H3 Lys9 (1 1500, Cell Signaling, Danvers , MA, USA) eller acetyl-histon H4 Lys 5, 8, 12 og 16 (1 2000, EMD Millipore, Billerica, MA, USA) primære antistoffer ved 4 ° C natten over. Membraner blev derefter inkuberet med passende sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase (Santa Cruz Biotechnology, Sta. Cruz, CA, USA) i 2 timer ved stuetemperatur. Signalet blev udviklet ved anvendelse af ECL SuperSignal West Pico Substrat (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), og proteiner blev visualiseret under anvendelse UVP maskine (BioSpectrum Imaging System). GAPDH tjente som en belastning kontrol (1:20.000, Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA).

FACS af hoved og hals CSC

Hoved- og halskræft stamceller celle-lignende celler blev identificeret ved cellesortering for ALDH (aldehyddehydrogenase) aktivitet. Den Aldefluor kit (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) blev anvendt ifølge producentens instruktioner til at identificere celler med høj ALDH enzymatisk aktivitet. Kort fortalt blev HN6 og HN13-celler behandlet med 300 nM Trichostatin A (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) i 24 timer og suspenderet med aktiveret Aldefluor substrat (BODIPY-aminoacetat) eller negative kontrol (diethylaminobenzaldehyde, en specifik ALDH inhibitor) i 45 minutter ved 37 ° C. Prøverne blev analyseret i FACSDiVA Cell Sorter (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA).

Cell invasion assay

HN6 og HN13 celler (5 x 10

4) var podet i 24-brønds plader i en homogen tyndt lag af fibronectin (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) i Millicell Cell Culture Inserts (Millipore, Billerica, MA, USA), som indeholdt polycarbonatfilter membraner med 8 porer um diameter. Vi konstateret, at den optimale invasion cirka HNSCC tumorceller var 8 timer efter podning, hvilket fremgår af det betydelige antal celler, der invaderede til bunden af ​​polycarbonat membranfilter (~60-70% af celler /samlet areal) (fig. S1). Tumorceller fra kontrolgruppen blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika, og HDAC inhibitor gruppe modtog 300 nm af Trichostatin A (TSA) fortyndet i medier. Det nedre kammer indeholdt DMEM suppleret med 20% FBS og 1% antibiotika. Efter udpladning blev cellerne inkuberet i 8 timer, baseret på optimal invasion tid (fig. S1), ved 37 ° C i en 5% CO2-befugtet inkubator. Invasive celler i det nedre kammer blev farvet med hematoxylin og eosin (H 0,05; * P 0,05; ** P 0,01 og *** P 0,001).

Resultater og Diskussion

kromatin acetylering og cellulære adfærd HNSCC

for at undersøge betydningen af ​​kromatin remodeling i HNSCC adfærd, vi undersøgte kromatin acetylering i et panel af seks HNSCC cellelinjer. Et spontant immortaliseret mundslimhinden cellelinje (NOK-SI) blev anvendt som en kontrol [29]. Histonproteiner spiller strukturelle og funktionelle roller i alle nukleare processer og gennemgår forskellige modifikationer [30], herunder acetylering, methylering, phosphorylering, ubiquitinering, SUMOylation, og poly-ADP-ribosylering at regulere kromatin struktur og genekspression [31]. Acetylering af histon H3, almindeligvis observeret ved Lys9, 14, 18, 23, 27, og 56, spiller en rolle i genaktivitet [32], [33]. Navnlig har funktionel acetylering af histon 3 ved Lys 9 blevet grundigt undersøgt og er forbundet med histon deposition, chromatin samling, og genaktivering [34] – [36]. Tumorceller har varierende acetyleringsniveauer af histon 3 ved lysin 9, som er en markør for aktive gener [32], [33]. Alle HNSCC cellelinjer analyserede vi vist hypoacetylation af kromatin sammenlignet med NOK-SI styrer (fig. 1A), hvilket tyder HNSCC har kondenseret chromatin under basale dyrkningsbetingelser. blev også rapporteret reduceret acetyleringsniveauer af histon 3 på lysin 9 i tumorer fra lunge og spiserøret [37] – [39] og i 3D kulturer af neuroblastomceller og tumor sfæroider afledt fra melanomceller [40] – [42]. Ændringer i kromatin organisation spiller en rolle i mange humane sygdomme, herunder cancer [43], hvor de betragtes som en værdifuld prognostisk markør [44].

(A) Western blot-analyse, der viser globale kromatin hypoacetylation af HNSCC, som fremgår af lave ekspressionsniveauer af acetyl-histon H3 Lys9 (Ac.H3) sammenlignet med styre normale orale keratinocytter (NOK-SI). (B) Repræsentative billeder og søjlediagram af invasion assays. HN6 viser en betydelig invasiv kapacitet i forhold til HN13 (*** p 0,001). Invasion blev bestemt ved tælling HNSCC celler i bunden af ​​membranen (se materialer og fremgangsmåder for detaljer) i flere felter (20X). (C) Western blot-analyse viser høje ekspressionsniveauer af endogen vimentin, en kanonisk markør for EMT, i HN6 celler, men ikke i HN13 celler. (D) Evaluering af CSC markør ALDH viser, at HN6 har et højt antal ALDH + -celler, opsummering til mere end 11% af den samlede tumorcellepopulation. Ca. 6% af HN13 celler er ALDH +. (E) Et repræsentativt eksempel på holoclones (pil), meroclones (pilespids) og paraclones (stjerne) dannet under HN6 klonogene assay. HN13 tumorceller danner primært udifferentierede holoclones (pil). Kvantificering af kugler afslører øget evne HN6 celle til at generere sfærer sammenlignet med HN13 (** p 0,01).

Vi næste undersøgte aggressivitet HNSCC celler med lave acetyleringsniveauer. HN6 tumorceller, som er følsomme over for cisplatin (Almeida OA og Castilho RM, upubliceret data), der vises, forstærket invasivitet (Fig 1B, *** p. 0,001) og høj ekspression af endogent vimentin, en mellemliggende filament ofte findes i aggressive maligne epitel tumorer, der undergår epitelial-mesenkym overgang (EMT) [45] – [47] (figur 1C.). Dernæst forsøgte vi at karakterisere tilstedeværelsen af ​​en subpopulation af CSC vides at underbygge til tumorinitiering, vækst og metastase [16] – [25] og er forbundet med udviklingen af ​​EMT [48] – [50]. Selv om flere markører er blevet foreslået at identificere CSC befolkning inden hoved og hals kræft, er aktivitetsniveauet af enzymet aldehyd dehydrogenase (ALDH) anses for at være en meget selektiv markør for CSC og en stamcelle biomarkør for forskellige normale og cancer stamceller [51] – [54]. Invasive HN6 har en præsenteret et stort antal ALDH-positive (ALDH +) celler, opsummering til mere end hvilket svarede til over 11% af den samlede befolkning (fig. 1D_HN6). I modsætning til HN6 celler, HN13 celler ikke udtrykker vimentin, udviste reduceret invasionsevne, og kun 6% af deres totale cellepopulation var består af ALDH + -celler Interessant HN13 tumorceller opførte sig differentielt i forhold til HN6 celler, der udgør en population af 6% af ALDH + celler, fravær af vimentin ekspression og reducerede invasive kapacitet (fig. 1B, C, og D_HN13). I et klonogene assay, HN6 og HN13 celler dannet 3 forskellige sfære mønstre, identificeret som holoclones, meroclones og paraclones, der er direkte forbundet med “stemness” Efter, klonogen assay af hoved og hals tumorcellelinier vises dannelsen af ​​3 forskellige sfære mønstre direkte knyttet til “stemness” adfærd, de holoclones, meroclones og paraclones [55] – [57]. Holoclones er kendetegnet ved velafgrænsede kanter og besidde de største vækstpotentiale, derved sandsynligvis være sammensat af udifferentierede stamceller. Paraclones er kendetegnet ved hurtig vækst, endnu, men begrænset cellulær levedygtighed. Meroclones ligger mellem de to andre sfære mønstre og er kendetegnet ved de to foregående beskrevne CSC sfærer mønstre, ved at præsentere kolonier med rynkede omkredse og øget cellulær levedygtighed i forhold til paraclones [55]. Vi observerede, invasive HN6 tumorceller genereret flere kloner sammenlignet med HN13. Navnlig sfære-dannende celler fra HN6 var en blanding af holoclones (fig. 1E_arrow), meroclones (fig. 1E_arrow hoved) og paraclones (fig. 1E_asterisk). Men HN13 kugler indeholdt kun store holoclones og ingen meroclones eller paraclones (fig. 1E_arrow), hvilket tyder på en homogen population af CSC.

Kollektivt, vores resultater tyder på, at hoved- og halscancer celler konsekvent opretholde hypoacetylated kromatin trods af deres aggressive opførsel. Øget chromatinkondensation er korreleret til tumor modstand mod kemoterapi [11] – [14], sandsynligvis på grund af en forstyrret tilstrømning af DNA reparation molekyler til kernen og forringet apoptose [58]. Faktisk chromatin dekondensering er nødvendig for DNA-reparation [59] – [62], hvorved medlemmer af DNA-reparation maskiner spille en rolle i kromatin reorganisering ved storstilet chromatin udfoldning [59], [63]. Tilstedeværelsen af ​​CSC, som detekteret ved ALDH enzymatisk aktivitet, i humane hoved- og halscancer cellelinier er interessant og viser evnen af ​​tumorceller til at opretholde en heterogen population. Især fandt vi, at aggressive tumorceller er sammensat af en heterogen population af sfære-dannende celler bestående af holoclones, meroclones og paraclones og en samlet stort antal kugler (fig 1E, ** p. 0,01). Den heterogene CSC mønster blev ikke observeret i indolent hoved og hals tumorceller. Disse resultater tyder på sameksistensen af ​​tumorceller med varierende grader af “stemness”, der tegner sig for både deres CSC befolkning og invasiv.

Tumor mikromiljø og HDAC-hæmmer modulerer kromatin acetylering og CSC indhold

Efter vores tidligere observationer, at tumorceller findes hypoacetylated, besluttede vi at søge efter miljømæssige signaler, der kan påvirke kromatin acetylering under tumor invasion. Vi valgte arginin-rige histoner H3 og H4 som markører for kromatin acetylering baseret på deres evne til at organisere DNA i nukleosomer. Acetylerede histoner H3 og H4 frigivelse supersnoet DNA fra nukleosomer at gøre gener mere tilgængelige [64]. Derudover acetylering af histoner H3 og H4 påvirker høj-ordens kromatin strukturer og gør DNA bindingssteder tilgængelige for trans-virkende faktorer [65], [66]. Vi behandlede tumorceller med konditioneret medium (CM) afledt af fibroblaster og endothelceller, to væsentlige bestanddele af tumormikromiljøet [67] – [69]. Selvom fibroblaster, er den største cellulære komponent af dermis og sub slimhinde, CM fra disse celler inducerede ikke ændringer i acetylering af histoner H3 (Ac. H3) og H4 (Ac. H4) (fig. 2A_Fibroblast CM). Men CM fra endotelceller havde en udtalt indflydelse på tilrettelæggelsen af ​​tumor kromatin (Fig 2A_Endothelial CM -.. Ac H3 og Ac H4.). Interessant nok i respons på CM fra endotelceller, der vises, HN6 celler acetyleret kromatin og forøget ekspression af vimentin, der hovedsageligt observeret under EMT [45] – [47]. BMI-1, et medlem af Polycomb repressor komplekse 1, der er involveret i kromatin remodellering og overudtrykt i cancerceller [70] – [72], blev opreguleret i HN6 som reaktion på endotel CM (fig 2A_ Endothelial CM_HN6.). Overraskende, endotel CM induceret kromatin komprimering i HN13-celler (fig. 2A_ Endothelial CM_HN13) på en måde svarende til den aktuelle totrinsproces af transkriptionel repression medieres af Polycomb gruppefamilie af gener (PcG). Denne proces negativt påvirker DNA tilgængelighed af transkriptionelle og remodeling faktorer, hvilket resulterer i kromatin komprimering (gennemgået af Sparmann A,

et al

. [73]). Deacetylering af HN13 celler ændrede ikke BMI-1 og vimentin udtryk (fig. 2_Endothelial CM). Uoverensstemmelser mellem tumor adfærd og kromatin reaktion på miljømæssige ændringer kan skyldes mutationer i PCG familiemedlemmer, der forårsager den aggressive opførsel observeret i HN6 tumorer celler (fig. 1B og C).

(A) Western blot-analyse viser at fibroblast-medium (FCM-venstre panel) ikke modulere kromatin acetylering (Ac. H3 og Ac. H4), BMI-1 eller vimentin niveauer i tumorcellelinjer. Endotel-afledt konditioneret medium (ECM-højre panel) påvirker tumor acetylering som vist ved forhøjet Ac. H3 og Ac. H4 niveauer i HN6 celler og ablation af AC. H3 og Ac. H4-niveauer i HN13 celler. Bemærk, at sammen med Ac. H3 og Ac. H4, HN6 celler viser mindre stigninger i BMI-1 og vimentin niveauer. (B) Tumor proliferation vurderes ved Ki67 demonstrerer reduceret proliferation efter administration af HDACi TSA (300 nM) i 24 timer. (C) Administration af TSA (300 nM) i 24 timer reducerer den samlede population af CSC i HN6 og HN13 celler, som påvist ved tilstedeværelsen af ​​ALDH + celler. (D) HDACi (TSA) forstyrrer tumor holoclones som afbildet i repræsentative billeder af tumor sfærer og ved kvantificering af kugler (HN6 ** p 0,01, HN13 * p 0,05).

Vi næste afgøres, om kromatin acetylering alene påvirkninger hoved og hals tumor adfærd. Vi brugte Trichostatin A (TSA) HDAC-hæmmer til kemisk fremkalde kromatin acetylering. TSA selektivt hæmmer HDAC klasse I og II, som besidder epigenetisk aktivitet. Senest TSA er også blevet vist at inhibere ikke-histon transkriptionelle faktorer og co-regulatorer, herunder p53, STAT, og NFKB [74], [75]. Efter bestemmelse af optimale koncentration af TSA (300 nM) stand til at inducere hoved og halscancer celle acetylering (Fig S2.) [76] – [82], fandt vi, at inhibering af HDACs direkte forringet spredning af HNSCC celler (Fig 2B. , HN6 * p 0,05, HN13 *** p 0,001). Vi observerede også en uventet reduktion i den del af CSC efter behandling med TSA (fig. 2C_TSA), med en reduktion på 7% i ALDH + celler isoleret fra HN6 og en reduktion på ca. 6% i ALDH + celler fra HN13 (fig. 1D_Vehicle). Som et funktionelt assay, evaluerede vi indflydelsen af ​​TSA på klonogene dannelsen af ​​CSC sfærer. Brug ultralav friktion plader, vi dyrkede tumorceller ved lav sammenløb i 5 dage og observeret indtil dannelse af veldefinerede områder. Efter sfære dannelse, blev TSA administreret, og kuglerne blev nøje overvåget. Overraskende induktion af kromatin acetylering resulterede i en hurtig og progressiv forstyrrelse af kugler (fig 2D, HN6 ** p. 0,01, HN13 * p 0,05). Afbrydelse af tumor kugler tyder på, at kromatin acetylering induceret af HDAC hæmning forstyrrer de fysiologiske krav til CSC vedligeholdelse. Faktisk har chromatin acetylering længe været kendt for at inducere cellulær differentiation og begrænse cellulær transformation [83], [84]. Derfor kan HDAC-hæmmere (HDACi) være en roman terapeutisk strategi for at forringe de skadelige virkninger af CSC. Disse resultater tyder på en dynamisk proces, hvor hoved og hals kræft celler er meget modtagelige for miljømæssigt drevne epigenetiske ændringer, støtter tanken om, at epigenetisk målretning kan være en effektiv og værdifuld metode til kemoterapi og chemoprevention af kræft [4]. HDAC-hæmmere (HDACi) er lægemidler, der er målrettet specifikke enzymer involveret i epigenetisk regulering af genekspression og er potentielt en ny klasse af anticancer stoffer [4], [5], [7], [12], [85]. Selvom HDACi har succes i behandling af blodkræftsygdomme, deres anvendelse i solide tumorer er stadig kontroversiel [86], [87].

Kemisk induceret kromatin acetylering fremmer EMT i HNSCC celler

Effekten af ​​HDACi på CSC fik os til at bestemme, om administration af TSA ville ændre yderligere kendetegn for hoved- og halscancer. Maligne tumorer afledt fra epithelceller (carcinomer) undergår en udsøgt proces kendt som EMT, der går forud invasion og progression af cancerceller [46], [88] – [91]. EMT er karakteriseret ved tab af celleadhæsion, forøget motilitet, aggressiv adfærd, og erhvervelse af et langstrakt fibroblastoid morfologi og ekspression af vimentin, en kanonisk markør for EMT [45] – [47]. Især aggressive HN6 celler havde konstitutiv ekspression af vimentin (Fig. 1C) og et overvejende brosten udseende (fig. 3A_Vehicle_HN6). Farmakologisk hæmning af HDAC forårsagede celler hurtigt ændre deres morfologi i en spindel form og øge vimentin ekspression (fig. 3A_ TSA_HN6). Endvidere administration af TSA induceret spindel morfologi og vimentin ekspression i HN13-celler (fig. 3A_ TSA_HN13), der ikke typisk udtrykker dette mellemprodukt filament (fig. 1C_HN13_Vimentin). Vi har ikke observere TSA-inducerede morfologiske ændringer eller vimentin udtryk i normale celler (fig. 3A_NOK-SI), tyder på, at hyperacetylering af kromatin forskelligt modulerer normale og neoplastiske celler. Selv om det samlede antal HN6 celler, der udtrykker vimentin kun marginalt forøget som respons på TSA (fig 3B_HN6, * p. 0,05), tumorceller udviser fibroblastoid morfologi var stort set positive for vimentin (Fig 3C_HN6, *** p. 0,001). Kombinationen af ​​vimentin ekspression og fibroblastoid morfologi blev også observeret i HN13 celler efter chromatin acetylering (Fig 3B og C_HN13 *** p. 0,001). Disse resultater tyder på en stærk rolle for chromatin dekondensering under erhvervelse af en EMT fænotype i HNSCC celler.

Hæmning af histon deacetylase inducerer vimentin udtryk i HNSCC celler og erhvervelse af spindlen formede morfologi. (A) Repræsentative eksempler på morfologiske ændringer og ekspression af cytokeratin 14 (CK14) epitelcelle markør og vimentin mesenkymale markør. Bemærk, at normale keratinocytter udtrykker CK14 i tilstedeværelse af køretøjet eller TSA og cellemorfologi er kontinuerligt epithelioid (brosten eller discoid udseende). Både HN6 og HN13 celler udtrykker CK14 og en epithelioid form (A, køretøj). Efter TSA behandling, HN6 og HN13 ekspres vimentin og blive spindel formet. (B) Grafik repræsenterer procentdelen af ​​celler positive for vimentin følgende TSA eller behandling køretøj. TSA-induceret chromatin acetylering resulterer i forøget vimentin ekspression i HN6 og HN13 celler (* p 0,05 og *** p 0,001). (C) Grafisk repræsenterer vimentin ekspression i spindel formede celler (tumorceller med EMT-lignende morfologi). HN6 og HN13 celler vise betydelige stigninger i vimentin udtryk efter TSA behandling (*** p 0,001).

chromatin hyperacetylering forbedrer invasion og ekspressionen af ​​BMI-1 i hoved og hals kræft

BMI-1

genet opreguleres i en række forskellige kræftformer og forbundet med øget tumor aggressivitet og dårlig overlevelsesrater [71], [92] – [97]. Den onkogene effekt af BMI-1 medieres primært ved at undertrykke p16

INK4 tumorsuppressorgen, hvilket fører til aktivering af pRB og p53 signalering [98], [99]. Vi fandt, at TSA-behandlede tumorer viste øget ekspression af BMI-1 (fig. 4A) lokaliseret i kernen (fig. 4B), udvikling af en spindel formet fænotype, og polarisering af F-actin filamenter (fig. 4B). Interessant polarisering af actinfilamenter blev kun observeret i tumorceller behandlet med TSA. Normale humane epitelceller har ikke ændret deres morfologi som reaktion på chromatin dekondensering, hvilket antyder en selektiv virkning af HDACi i tumorceller (fig. S3_NOK-SI). Opregulering af BMI-1 blev også forbundet med forøget invasivitet af HN6 og HN13 celler (Fig 4C, HN6 * p. 0,05 og HN13 *** p 0,001). Kollektivt, fandt vi, at uanset den oprindelige invasive kapacitet HN6 og HN13 celler (Fig. 1B og C), kemisk-induceret kromatin acetylering forårsaget HNSCC at undergå EMT (fig. 3) og opregulere BMI-1 (fig. 4A og B ). Paradoksalt inhibering af HDAC Hæmmede også CSC population (fig. 2C). Disse resultater antyder, at acetylering af HNSCC chromatin direkte forringer subpopulationen af ​​ALDH + cancerceller, hvorved der udvælges en homogen subpopulation berøvet multipotency egenskaber [16] – [25]. Desuden klinisk anvendelse af HDACi er meget vellykket i behandling hæmatologiske maligniteter, der ofte opfører sig som homogene sygdomme. Således kan epigenetiske faktorer, der modulerer chromatin acetylering være ansvarlig for at indlede ændringer i HNSCC adfærd ved skiftevis tumorceller mellem en hvilende og “stemness” fase, der modstår kemoterapi til en mere aggressiv og invasive adfærd, der fremmer tumormetastase. Denne mekanisme er i tråd med den nye tumorgenicitet model af cellulær “plasticitet”, og kan være en vigtig mekanisme HNSCC bruges til samtidig udvikler en invasiv adfærd og kemoresistens. Den første brug af HDACi kan give et molekylært defineret vindue af muligheder for patienter med hoved- og halscancer ved kemisk ablation tumor “plasticitet” før indgivelse af genotoksisk kemoterapi.

(A) Western blot-analyse skildrer øget BMI -1 ekspression i HNSCC celler efter TSA behandling. (B) Repræsentative billeder af nukleare BMI-1 (FITC /grøn) og polarisering af F-actin filamenter (TRITC /rød) i tumorceller undergår EMT efter TSA behandling. (C) Repræsentative eksempler på øget tumorcelleinvasion efter behandling med HDAC-inhibitorer. Bemærk den betydelige stigning i invasivitet af HN6 og HN13 celler (* p 0,05 og *** p 0,001 henholdsvis). (D) Repræsentative eksempler på humane prøver af normal mundslimhinde og HNSCC (H & E farvet). Bemærk acetylerede tumorceller (Ac. H3-FITC), at samtidig udtrykker høje niveauer af vimentin (trict /grøn) ved invasionen foran HNSCC.