PLoS ONE: Regulering af Tumor suppressor PTEN gennem Exosomer: En diagnostisk potentiale for prostata Cancer

Abstrakt

PTEN er en potent tumor-suppressor protein. Aggressiv og metastatisk prostatacancer (PC) er associeret med en reduktion eller tab af PTEN ekspression. PTEN reduktion sker ofte uden genmutationer, og dens nedregulering er ikke fuldt forstået. Heri, viser vi, at PTEN inkorporeres i bagagerummet af exosomer afledt fra cancerceller. PTEN er ikke påvist i exosomer afledt fra normale, noncancerous celler. Vi fandt, at PTEN kan overføres til andre celler gennem exosomer. I celler, der har en reduktion eller fuldstændig tab af PTEN udtryk, det overførte PTEN er kompetent til at give tumor-undertrykkelse aktivitet acceptor celler. I pc-patienter, viser vi, at PTEN er indarbejdet i bagagerummet af exosomer der cirkulerer i blodet. Interessant normale personer har ingen PTEN ekspression i deres blod exosomer. Endvidere fandt vi, at prostata-specifikt antigen (PSA) er inkorporeret i PC patienternes og normale forsøgspersonernes blod exosomer. Disse data antyder, at exosomal PTEN kan kompensere for PTEN tab i PTEN deficiente celler, og kan have diagnostisk værdi for prostatakræft

Henvisning:. Gabriel K, Ingram A, Austin R, Kapoor A, Tang D, Majeed F et al. (2013) Regulering af Tumor suppressor PTEN gennem Exosomer: En diagnostisk potentiale for prostatakræft. PLoS ONE 8 (7): e70047. doi: 10,1371 /journal.pone.0070047

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: November 12, 2012; Accepteret: 17 juni 2013; Udgivet: 25 Juli 2013

Copyright: © 2013 Gabriel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev tildelt af prostatakræft Canada og er stolt finansieret af Movember Foundation, Grant # D2013-2 for K.Al. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PC) er den hyppigst diagnosticerede kræft og den næsthøjeste årsag til kræft dødsfald hos mænd [1], [2], [3]. Tabet af en kopi af PTEN genet bidrager til prostata tumor initiering, mens yderligere reduktion i PTEN ekspression støtter invasionen og metastatisk adfærd PC [4]. PTEN er et protein /lipid phosphatase. Dens proteintyrosinphosphatase domæne har karakter af en phosphataser med dobbelt specificitet, der er i stand til at dephosphorylere både tyrosin og serin /threoninrester. Den vigtigste sphingosin af PTEN er phosphatidylinositol (3,4,5) triphosphat (PIP-3). Den vigtigste mekanisme for tumor suppression af PTEN er opretholdelsen af ​​cellulær PIP-3 ved lave niveauer, hvilket forhindrer PI3K-AKT pathway og bidrage til cellulær apoptose eller cellecyklusstandsning [5]. Reduktionen af ​​PTEN proteinekspression optræder ofte i fravær af genmutationer [6], [7], [8]. I alt ca. 70-80% af de primære PC tumorer har en reduktion i PTEN udtryk [9]. Forskellige mekanismer, der bidrager til en reduktion af PTEN udtryk i tumorer er blevet identificeret, herunder promotor methylering [10], [11], og negative regulator proteiner [12]. Det er blevet foreslået, at andre, ukendte mekanismer kan handle i mange tumorer [10], [11]. Vores resultater peger på en ny mekanisme, som kræftceller regulerer PTEN udtryk gennem exosomer.

Kræftceller frigiver vesikler i deres omgivelser. Mikrovesikler er en række stald vesikler, der genereres via direkte knopskydning af cellemembranen. Exosomer er en anden, relativt mindre type vesikel, der er lagret i multivesikulære organer og frigives, når multivesikulære organ sikringer med cellemembranen [13], [14]. Exosome indhold afspejler dens cellulære kilde [15], [16]. Interessant, kan disse indhold omfatter onkogene proteiner, som vi tidligere har rapporteret [17], [18], eller tumor suppressor proteiner, som rapporteret heri. Således kunne man forudse, at molekyler, der overføres af exosomer giver en erhvervet fænotype til acceptor-celler, hvilket fører til positive eller negative effekter i forhold til tumorprogression afhænger af arten af ​​molekylerne overførte. Lasten af ​​exosomer kan således ændre balancen mellem onkogene og tumor suppressor egenskaber. Analysen af ​​sådan last kunne tyde udtrykket status tumor suppressor proteiner i maligne celler uden at skulle direkte prøve malignitet. Exosomer dukker op som en vigtig kilde til kræft biomarkører og er beskrevet som biomarkør skattekister til PC [19]. Det er blevet foreslået, at PTEN status i PC patienterne kunne være en prædiktor for patienter med risiko for cancer metastase eller tilbagefald efter radikal prostatektomi [20], [21], [22]. I flere årtier har prostataspecifikt antigen (PSA) blevet anvendt som standard biomarkør til påvisning af PC [23]. Imidlertid er anvendelsen af ​​PSA begrænset af dens manglende specificitet og manglende evne til at skelne mellem indolent og livstruende former af sygdommen på diagnosetidspunktet [24]. PSA-screening kan reducere dødeligheden af ​​PC, men det er også forbundet med en høj grad af overdiagnostik og overbehandling [25], [26]. I deres undersøgelse, Harvey et al. konkluderede, at PSA testen har en høj falsk positiv og betydelig falsk negative rate [27]. Denne mangel på prognostisk værdi fører til en enorm stigning i unødvendige biopsier og i overbehandling af pc patienter med lav risiko [23], [25]. På baggrund af disse resultater, er der et stort behov for at finde nye markører til pc eller til at forbedre specificiteten af ​​PSA-test.

Materialer og metoder

Materialer

monoklonale antistoffer til PTEN, AKT, Flotilin-1, p27, og cyclin D1 blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Alle de tilsvarende HRP-konjugeret sekundære antistoffer blev købt hos Cell Signaling. Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer blev købt hos Molecular Probes (Eugene, OR).

cellelinjer.

DU145, PC-3 (human prostatacancer celler), U87 (human glioblastom astrocytom) og de humane normale celler [humane aorta endotelceller (HAOEC), humane aorta glatte muskler celler (HAOSMC) og humant prostataspecifikt epithelceller (HPEC)] blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA). DU145 celler med PTEN knockdown (DU145Kd) og DU145 celler transficeret med uspecifikke siRNA blev oprindeligt dannet i en af ​​vores laboratorier (D. T.) på Hamilton Kidney Research Centre (HKRC), McMaster University. DU145Kd celler blev dannet ved anvendelse PTEN siRNA udtrykkes af en retroviral-baserede H1-promotordrevet shRNA vektor, og styre- DU145 celler blev inficeret med en retrovirus, der udtrykker ikke-specifik siRNA, som tidligere beskrevet [12]. CHO og CHO-EGFR celler blev tidligere opnået som en generøs gave fra Dr. Guha laboratorium på The Hospital for Sick Children, Toronto. Alle cellelinier anvendt i dette studie blev dyrket i mikrovesikel-udtømte FBS (ved centrifugering natten over ved 100.000

g

). For standard kultur blev celler dyrket i Dulbeccos modificerede essentielle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS).

Isoleringen af ​​Exosomer fra de konditionerede medier og blodplasma

Exosomer blev opsamlet fra medierne af forskellige cellelinier og fra humant plasma, som tidligere beskrevet [18], [28], [29]. Kort fortalt blev konditioneret medium indsamlet fra celler ved ca. 80% konfluens, medmindre andet er angivet, og dette materiale blev udsat for to på hinanden følgende centrifugeringer på 300

g

i 5 minutter og derefter ved 12.000

g

i 20 minutter for at fjerne celler og rester. Endelig blev exosomer opnået efter centrifugering i 2 timer ved 100.000

g

og derefter vasket to gange med et stort volumen af ​​phosphatbufret saltvand (PBS). Denne protokol specifikt indsamler exosomer og udelukker store vesikler. Exosomet proteiner udvundet blev målt under anvendelse af Bradford assay (Bio-Rad).

PTEN Expression Profile

Cellerne (DU145, DU145Kd, og DU145 med kontrol siRNA) og de primære celler (HAOEC , HAOSMC og HPEC), sammen med deres tilsvarende exosomer, blev lyseret i 10 minutter på is i en lyseringsbuffer indeholdende: 10 mM Tris (pH 6,8), 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 30 mM natriumpyrophosphat, 2% (vægt ./vol) SDS, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 mM Na

3VO

4. Lysaterne blev opløst ved SDS-PAGE og udsat for immunblotting med kanin monoklonale antistoffer til PTEN. Immunodetektion udførtes anvendelse af den passende HRP-konjugeret sekundært antistof og kemiluminescens plus kit (ECL kit, Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Storbritannien), hvorefter blots blev scannet og proteinbånd kvantificeret under anvendelse af Mængde One software (Bio-Rad, CA) .

påvisning af Signaling begivenheder relateret til PTEN

for at vurdere virkningen af ​​exosomer der indeholder PTEN på DU145Kd celler, sidstnævnte blev udpladet i 100 mm skåle med en tæthed på 2 × 10

5 celler /ml, dyrkes kortvarigt, og sultet i 24 timer (enten i DMEM suppleret med 0,5% FBS, eller i serumfrit DMEM). Kulturerne blev derefter stimuleret natten over med forskellige koncentrationer af exosomer afledt af DU145 celler. Efter exosom behandling blev cellelysater fremstillet og analyseret for deres signalering effektor indhold under anvendelse af anti-phospho-AKT antistoffer (cellesignalering), i overensstemmelse med leverandørens anbefalinger. Påvisning af ekspressionen af ​​P27 og cyklin D1 blev udført med de samme eksperimentelle indstillinger, der bruges til påvisning af Pakt.

Fluorescent Imaging af exosom Optagelse

For

in vitro

analyse af PTEN ekspression blev cellerne dyrket i kammerskiver (Nalge Nunc, NY). Kulturerne blev vasket med PBS og fikseret i forvarmet (37 ° C) 4% (wt./vol) paraformaldehyd (PFA) i phosphatbufret saltvand i 5 minutter. Derefter blev de vasket tre gange i PBS, og antiquenching blev udført i 50 mM NH

4CL i 10 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev cellerne vasket to gange i PBS og inkuberet med BSA [1% (wt./vol) i PBS] i 30 minutter. Inkubation med et primært antistof blev udført i 1 time, efterfulgt af vask i PBS, og derefter inkubering med et sekundært antistof i 30 minutter. Efter farvning blev præparatglassene monteret ved hjælp Dako fluorescerende monteringsmedium og ses under et konfokalt mikroskop til påvisning af tilstedeværelsen af ​​exosomal indhold (PTEN) i recipientcellerne.

PTEN aktivitetsassay

Lysater fra DU145Kd celler, som blev behandlet med exosomer fra DU145 celler, blev udsat for immunpræcipitation hjælp PTEN antistoffer (cellesignalering) og protein G Sepharose. PTEN-aktivitet blev vurderet under anvendelse af de vandopløselige substrat DiC8PtdIns (3, 4, 5) P3 (Echelon). De frigivne frie phosphater blev målt med BIOMOL Green reagens og normaliseret mod en reaktion indeholdende kun PIP3 substrat [12].

Påvisning af PTEN-mRNA

DU145Kd celler blev behandlet med exosom præparater afledt af DU145, efterfulgt af grundig vask og ekstraktion af RNA ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, NY). RT-PCR-analyse blev udført under anvendelse af en enkelt-trins metode (Qiagen, CA), hvor PTEN blev påvist under anvendelse af primersæt: sense 50-ATGACAGCCATCATCAAAGAG-30 og antisense 50-GTGCCACTGGTCTATAATCCAG-30 [12]. Reaktionerne blev udført i 50 pi med den indledende aktivering Taq ved 95 ° C i 30 minutter, efterfulgt af 30 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, primerannealing ved 60 ° C i 1 minut og forlængelse ved 72 ° C i 30 sekunder. Produkterne blev resolveret på 1% agarosegel og fotograferes. GAPDH blev anvendt som intern kontrol ved hjælp af primer sæt: sense 50-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-30 og antisense 50-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-30

proliferationsassav

Proliferationsassayet blev udført ved hjælp af et assay kit (CHEMICON. ) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev 0,1 x 10

4 DU145Kd celler blev udpladet i en plade med 96 brønde; efter 24 timer, blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af exosomer afledt af DU145 celler. Andre DU145Kd celler blev behandlet med DU145Kd-afledte exosomer at vise effekten af ​​exosomer med nedreguleret PTEN. DU145-celler blev anvendt som kontrol til at vise evnen af ​​exosomer til at kompensere for PTEN nedregulering i DU145Kd. Denne procedure blev brugt til U87 og PC-3 celler.

prostatakræft Patienter og normale personer

Denne undersøgelse er støttet af etisk godkendelse fra McMaster University etiske bord (REB # 02-2174) . Deltagerne blev informeret om formålet med undersøgelsen, og skriftligt samtykke er indhentet fra alle personer, der deltog i undersøgelsen. Prøver fra 30 PC patienter blev anvendt i denne undersøgelse. Patienterne havde avanceret (T3 /T4) tumor fase. Blodprøver blev indsamlet før prostatektomi, og tumorvæv blev opsamlet efter kirurgi og lynfrosset i flydende nitrogen. Kliniske optegnelser, såsom Gleason score, PSA, tumorstørrelse, tumor histopatologiske kvalitet og metastase blev indsamlet. Prøverne blev indsamlet i henhold til McMaster University etiske standarder, og patient samtykke blev opnået før prøvetagning. Otte raske frivillige mænd i alderen 50-65 (matchende PC patientprøver de) blev anvendt i denne undersøgelse; alle var uden nogen historie af kræft og med normale PSA niveauer.

Statistisk analyse

Alle forsøg blev reproduceret mindst tre gange med lignende resultater. De kvantitative data er præsenteret som den gennemsnitlige værdi af de replikater i repræsentativt eksperiment ± SEM. Statistisk signifikans blev vurderet ved anvendelse af et edb 2-tailed t-test. Forskellene blev betragtet som signifikante ved P. 0,05

Resultater

PTEN udtrykkes i Exosomer fra PC Celler, men ikke normale celler

Vi bestemt status PTEN i følgende PC celler: DU145, DU145 stabilt transficeret med PTEN siRNA (DU145Kd) for PTEN nedregulering eller knockdown, og DU145 transficeret med kontrol siRNA [12]. Exosomer blev opsamlet fra de konditionerede medier af hver celletype, og lige proteinkoncentrationer fra cellerne, og exosomer blev underkastet SDS-PAGE og immunoblotting, derefter probet med PTEN antistoffer. Begge DU145Kd celler (figur 1A) og exosomer (figur 1b) viste en nedregulering af PTEN ekspression sammenlignet med vildtype DU145 celler og DU145 celler transficeret med kontrol siRNA. Vi vurderede også phosphorylering status PTEN i exosomer afledt af disse celler. Phosphorylering af PTEN holder det i en lukket tilstand beskyttet mod nedbrydning; senere vil PTEN være tilgængelige til at blive aktiveret i cytoplasmaet, binder cellemembranen ved dephosphorylering, og derefter indlede cellesignalering [30], [31]. Vi fandt, at PTEN inkorporeret i exosomer phosphoryleres (figur 1B, midterste panel). Flotilin-1 blev anvendt som en loading kontrol for exosomer [32]. Spredningen satser DU145 stamcellerne, DU145 med kontrol siRNA og DU145Kd celler (Figur 1C) viser, at de PTEN knockdown celler udviste en signifikant højere spredning end de to andre celletyper. Humane primære celler (normal, ikke-kræft celler), såsom human aortaendothelceller (HAOEC), Human Aorta glatte muskelceller (HAOSMC), og human prostata epitelceller (HPEC) udtrykker PTEN, men vi fandt, at PTEN ikke er indarbejdet ind exosomerne af disse celler (figur 1D). Dette kan betyde, at inkorporeringen af ​​PTEN i exosomer er en eksklusiv karakteristisk for kræftceller, men dette fund kræver yderligere udforskning. Figur 1E er en scanningselektronmikrofotografi viser udgydelse af exosomer fra kræftceller.

A. DU145 PC celler blev transficeret med det anførte siRNA. Cellerne transficeret med PTEN-specifikke siRNA viste en klar knockdown af PTEN ekspression, mens celler transficeret med kontrol mismatch siRNA viste ikke noget fald i PTEN ekspression. B. Exosomer afledt DU145, DU145Kd, og DU145 med kontrol siRNA viser det samme mønster af PTEN udtryk som observeret med den celle, hvorfra de stammer. PTEN inkorporeret i exosomer phosphoryleres; phosphorylering beskytter PTEN mod nedbrydning, og det kan aktiveres ved dephosphorylering ved overførsel til andre celler. Exosomer er positive for Flotilin-1. C. Forskelle i udbredelsen af ​​DU145, DU145 med kontrol siRNA og DU145Kd blev vurderet, med betydeligt højere spredning udstillet af DU145Kd. D. Humane primærelementer, HAEC, HASMC og HPEC, og deres exosomer blev profileret for PTEN udtryk. Alle tre celler er PTEN ekspression, men PTEN udtrykkes ikke i deres exosomer. Udtrykket for begge celler og deres exosomer blev normaliseret med Flotilin-1. E. En scanningelektronmikrofotografi viser udgydelse af exosomer fra DU145 celler.

Intercellulær Overførsel af PTEN af Exosomer

For at undersøge intercellulære udveksling af PTEN, exosomer stammer fra indfødte DU145 PC celler blev opsamlet ved hjælp af standardproceduren af ​​centrifugering. DU145Kd celler blev inkuberet med exosomet præparat afledt af parentale DU145 celler. Den tilsyneladende optagelse af microvesicular PTEN af DU145Kd celler blev observeret under anvendelse af immuncytokemi (baggrundssubtraktion blev udført under anvendelse af de ubehandlede celler som kontrol, og fluorescensen blev trukket fra både ubehandlede og behandlede celler for at vise erhvervelsen af ​​PTEN i exosom-behandlede celler), og immunoblotting (Figur 2 A og B).

DU145Kd celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af exosomer afledt af DU145-celler i 24 timer. A. DU145Kd celler blev dyrket i slide kamre og behandles med DU145-afledte exosomer. Cellerne blev vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS), og immuncytokemi blev udført med PTEN primære antistoffer og Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer. Cellerne blev visualiseret under anvendelse af konfokal mikroskopi (hvis-immunfluorescens). DU145Kd celler erhvervet PTEN (grøn) efter inkubering med DU145-afledte exosomer. B. DU145Kd blev dyrket i 100 mm skåle og behandles på samme måde som i (A) med forskellige koncentrationer af DU145-afledte exosomer. Cellerne blev vasket med PBS, lyseret med RIPA lysebuffer, og analyseret for PTEN ekspression under anvendelse immunobloting. DU145Kd celler erhvervet PTEN udtryk. C. Exosomer har en hæmmende effekt på transkriptionen af ​​PTEN. DU145Kd blev behandlet med forskellige koncentrationer af exosomer afledt af DU145 parentale celler. Total RNA blev indsamlet fra de behandlede celler, DU145 celler og DU145 med kontrol siRNA. RT-PCR blev udført under anvendelse af primere specifikke for PTEN. GAPDH blev anvendt som kontrol. RT-PCR blev udført under anvendelse af en ettrins RT-PCR-kittet. Produkterne blev opløst på en 1,1% agarosegel. D. Exosomer transfer PTEN til U87 PTEN

– /- celler. U87 celler blev dyrket i slide kamre og behandles med DU145-afledte exosomer. Cellerne blev farvet med PTEN antistoffer og Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer, og derefter blev visualiseret under anvendelse af et konfokalt mikroskop (IF-immunfluorescerende). U87 celler, som ikke udtrykker PTEN, som de har mutationer i begge PTEN alleler, erhvervet PTEN udtryk (grøn).

For at sikre, at stigningen i PTEN i DU145Kd celler efter inkubation med DU145-afledte exosomer skyldtes ikke stimuleringen af ​​PTEN transkription ved exosomer, udførte vi RT-PCR for PTEN i DU145Kd celler behandlet med forskellige koncentrationer af DU145-afledte exosomer. Vi observerede en inhibitorisk virkning på PTEN transkription (figur 2C). For yderligere at sikre, at vi observere den intercellulære overførsel af PTEN protein, i modsætning til stimulering af transskription, brugte vi glioblastom cellelinie U87, en null genotype, som indeholder en mutation i begge PTEN alleler [33]. Ved behandling med exosomer afledt af DU145 celler, U87-celler testet positive for PTEN (figur 2D). Disse data bekræfter, at den erhvervede PTEN i DU145Kd og U87 er udelukkende relateret til den intercellulære overførsel af PTEN protein gennem exosome udveksling. Desuden behandlede vi den prostatacancer-cellelinie PC-3, som er PTEN null, med exosomer afledt af DU145 celler, der viser erhvervelsen af ​​PTEN (fig S1). Vi bestemt PTEN udtryk i exosomer fra forskellige cancer cellelinjer dvs lungekræft (A549), brystkræft (MDA-MB-231), kolorektal carcinom (HCT116), og bugspytkirtel adenocarcinom (BxPC-3) (figur S2, A), til viser, at PTEN er udgydt gennem exosomer fra andre kræft celletyper. Vi har også behandlet PC-3-celler med exosomer afledt fra HCT116 colorektale carcinomaceller, og fandt at PC-3-celler erhvervet PTEN ekspression (figur S2, B).

exosomer Overførsel Aktiv PTEN mellem cancerceller

for at vurdere, om PTEN overføres gennem exosomer er aktiv, vi behandlede DU145Kd celler med forskellige koncentrationer af exosomer afledt DU145 celler. De behandlede celler blev underkastet immunpræcipitation for PTEN. Immunopræcipitaterne blev vurderet for PTEN-aktivitet under anvendelse af et lipid-phosphatase assay. DU145Kd celler viste en betydelig stigning i fosfatase aktivitet ved behandling med exosomer afledt DU145 celler (figur 3A).

A. DU145Kd celler blev behandlet med exosomer afledt af DU145 celler. PTEN blev immunpræcipiteret med PTEN antistoffer og PTEN phosphatase-aktivitet blev vurderet under anvendelse af de vandopløselige substrat DiC8PtdIns (3, 4, 5) P3 (Echelon). De frigivne frie phosphater blev målt med BIOMOL Green reagens og normaliseret mod en reaktion indeholdende kun PIP3 substrat. Resultaterne repræsenterer gennemsnittet af tre eksperimenter ± SEM, og de er signifikante ved P 0,01. B. PTEN-positive exosomer (fra DU145) forårsagede et fald i AKT fosforylering i acceptor celler (DU145Kd); AKT fosforylering faldt til et niveau svarende til DU145 celler med kontrol siRNA, og forældrenes modstykke DU145 celler (sidste to baner til højre, henholdsvis). C. DU145Kd celler blev udpladet i 100 mm cellekulturskåle og behandlet med forskellige koncentrationer af DU145-afledte exosomer. Cellerne blev lyseret og analyseret ved immunobloting med P27 og cyclin D1-antistoffer. PTEN inducerede ekspression af p27 og reduceret ekspression af cyclin D1 (C). De to begivenheder førte til cellerne indgår celle-cyklus anholdelse. Udtrykket blev normaliseret til p-actin.

For at undersøge, om den overførte PTEN er kompetent til at ændre celle signalering i acceptor celler blev DU145Kd celler behandlet med exosomer afledt DU145 celler i 24 timer. Phosphoryleringsstatussen af ​​phosphatidylinositol 3′-kinase /serin-threonin-kinase (AKT), den vigtigste substrat for PTEN, blev vurderet. I DU145Kd celler, fandt vi et fald i phosphoryleringen af ​​AKT, der nåede niveauer sammenlignelige med DU145 parentale celler (PTEN positiv) og DU145 celler transficeret med kontrol siRNA (figur 3B).

For at bestemme om den overførte PTEN påvirker nedstrøms celle signalveje i forbindelse med AKT, vurderede vi cyklin-afhængige kinase (CDK) inhibitor p27 (KIP1) udtryk. p27 regulerer celleproliferation, cellemotilitet, og apoptose. En reduktion i p27-ekspression observeres i mest dødbringende epiteliale cancere og er forbundet med dårlige patient resultater [34]. Pakt regulerer negativt p27 at støtte antiapoptotisk aktivitet i kræft progression. Vi fandt, at p27-ekspression er forøget i DU145Kd celler, når de behandles med DU145-afledte exosomer (figur 3C). Det er blevet rapporteret, at G1 celle-cellecyklusstandsnings koordineres af PTEN lipid phosphataseaktivitet gennem opregulering af p27 og ved PTEN proteinphosphatase aktivitet gennem nedregulering af cyclin D1 [35]. Vi bestemt, at cyclin D1 nedreguleres i DU145Kd celler behandlet med DU145 exosomer, som forventet (figur 3C).

PTEN Overført gennem Exosomer Påvirker biologiske funktioner i acceptor Celler

For at vurdere, om den biokemiske ændringer observeret i figur 3 er associeret med modifikation af biologisk funktion, vurderede vi virkningen af ​​PTEN-positive exosomer (afledt af DU145 celler) på proliferationen af ​​tre cellelinier, der mangler PTEN ekspression. DU145Kd, PC-3, og U87 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af DU145 exosomer, og opformeringsrater blev inhiberet i alle tre cellelinier i en dosisafhængig måde (figur 4 A, B og C). Exosomer mangler PTEN udtryk, der stammer fra DU145Kd, viste lidt effekt på spredning satser.

Tre cellelinier mangler PTEN udtryk, DU14Kd, PC-3, og U87 (A, B og C), blev behandlet med forskellige koncentrationer af DU145 exosomer. En proliferation assay blev udført under anvendelse af et assay kit. I alle tre cellelinjer blev opformeringsrater inhiberet i en koncentrationsafhængig måde. Spredningen satser DU145Kd celler nået et niveau svarende til DU145 celler, der viser, at exosomer helt kompenseres for tabet af PTEN (A). Exosomer afledt af DU145Kd, som mangler PTEN, viste ingen effekt på celleproliferation af alle tre cellelinier. Resultaterne er vist som gennemsnittet af tre eksperimenter ± SEM. Forskellene fra kontrolgruppen (0 exosomer) er betydelig * P 0,05, ** P. 0,01, og # forskellene er ikke signifikante

Integrering af PTEN i Exosomer reguleres af Onkogener

for at undersøge mekanismen af ​​inkorporeringen af ​​PTEN i exosomal fragt, testede vi rolle onkogene receptor epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) i denne proces. Vi bruges kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinie, som spontant immortaliseret [36] og har ingen EGFR. CHO celler stabilt transficeret til at udtrykke EGFR havde lignende niveauer af PTEN udtrykt i exosomer som de parentale CHO-celler (figur 5A). Ved stimulering af CHO-EGFR celler med forskellige koncentrationer af EGF (5, 10 og 20 ng /ml), var der en stigning i mængden af ​​PTEN i exosomer, på en koncentrationsafhængig måde (figur 5B). Desuden testede vi en hæmmende effekt på EGFR i DU145 celler på PTEN inkorporering i exosomer. Vi behandlede cellerne med EGFR-inhibitor CI-1033 (5, 10 uM). Hæmme EGFR faldt inkorporeringen af ​​PTEN i exosomer i en koncentrationsafhængig måde (figur 5C).

A. Introduktion EGFR i CHO celler viste ingen effekt på ekspressionen af ​​PTEN i celler og exosomer. B. Stimulering af CHO-EGFR celler med de angivne koncentrationer af EGF (5, 10 og 20 ng /ml) førte til en stigning i PTEN iblanding i exosomer. C. DU145 celler blev behandlet med to koncentrationer (5 um, 10 uM) af CI-1033, en irreversibel inhibitor af EGFR. PTEN inkorporering i exosomer blev inhiberet på en koncentrationsafhængig måde; Flotilin-1 blev anvendt som en belastning kontrol for exosome koncentration.

PTEN status i PC Patienterne kan vurderes ved hjælp af blod Exosomer

For at undersøge rollen af ​​exosomer i vurderingen af ​​PTEN status i PC patienter, vi opsamlede blod fra 30 PC patienter før prostatektomi og 8 normale forsøgspersoner matchende alder af patienterne (50-65 år). De normale frivillige havde ikke tidligere kræft eller tidligere dokumenteret forhøjet serum PSA. Blodet blev fraktioneret, og plasmaet blev anvendt som en kilde til exosomer. PTEN-exosomer blev immunfældet ved hjælp af PTEN antistoffer og Sepharose-protein-G. Indarbejdelsen af ​​PTEN i exosomer fra PC patienternes blod blev bestemt ved immunblotting, og blev påvist forskellige udtryk blandt patienter. Interessant nok fandt vi PTEN ekspression i exosomer fra alle PC patienter, og ingen PTEN ekspression i exosomer fra blodet af de normale individer (figur 6 A, B); t-test-analyse viste resultaterne var yderst signifikant P 0,001. Desuden kunne vi vurdere koncentrationen af ​​PTEN i PC patienternes exosomer ved immunoblotting med standard koncentrationer af rekombinant PTEN, og koncentrationen af ​​PTEN blev bestemt som (ng PTEN /mg exosome protein) (figur 6C).

A. Exosomer blev opsamlet fra plasmaet af 30 pre prostatektomerede PC patienter og 8 normale forsøgspersoner. Exosomer blev udsat for standard immunblotting analyse for status PTEN. Figuren viser evne exosomer at vurdere status af PTEN. Som vist i figuren er raske forsøgspersoner havde nogen PTEN ekspression i deres plasma exosomer. B. Optiske tætheder for PTEN bånd (A) blev vurderet ved hjælp Mængde-1 software. Exosomal-PTEN udtryk i pc-patienter og normale forsøgspersoner blev beregnet som den gennemsnitlige ± SEM, og forskellene mellem de to grupper var meget signifikant (P 0,001). C. PTEN koncentration i exosomer fra PC patient blod blev bedømt ved immunoblotting faste koncentrationer af rekombinant PTEN sammen med patientprøver. Resultaterne er gennemsnittet af PTEN udtryk ± SEM og er statistisk signifikant P. 0,01

Blood exosomal-PTEN Giver et simpelt værktøj til at vurdere PTEN status

PC tumorer er heterogene i PTEN ekspression som ses i (figur 7 A, B, C). PTEN status i tumorer i fire PC patienter blev bestemt ved immunohistokemi. Figuren viser, hvor vanskeligt at danne en konklusion om PTEN ekspression med denne teknik. PTEN ekspression i blodet exosomer af de samme patienter vurderes i figur 7D, hvilket viser en enkel og direkte måde at vurdere koncentrationen PTEN i PC patienter. Figur 7E er en scanningselektronmikrofotografi viser homogen befolkning af blod exosomer.

Dette tal giver en sammenligning undersøgelse af PTEN vurdering ved hjælp exosomal PTEN, og Immunhistokemi PC patient tumorer. Immunhistokemi af tumorvæv fra fire pc-patienter demonstrerer heterogenitet PTEN udtryk i prostata tumorer. A. Eosin hæmatoxylin-farvning. B. Farvning med sekundære antistoffer. C. Farvning med PTEN specifikke antistoffer, pile angiver PTEN positive celler. D. Vurdering af PTEN ekspression under anvendelse plasma exosomer fra de samme patienter. E) et scanningselektronmikroskop mikrograf som viser den homogene population af exosomer indsamlet fra patienten blod. Exosomer blev fastgjort til en dækglas hjælp polylysin og forarbejdet til scanning elektronmikroskopi.

Angivelse af PSA i Exosom Forberedelserne fra PC Patienter og normale personer

Brug 30 PC patienter og 8 normale personer, vi har registreret PSA i exosomer fra både PC patienter og normale individer (figur 8A): optiske tætheder af PSA bånd (fra figur 8A) blev anvendt til statistisk analyse. Forskellene i exosomal PSA mellem PC patienter og normale forsøgspersoner var ikke signifikant (figur 8B).