PLoS ONE: Endoglin-medieret Undertrykkelse af prostatakræft Invasion reguleres af activin og knoglemorfogenetisk protein type II Receptors

Abstrakt

Dødelighed fra prostatakræft (PCA) er på grund af dannelsen af ​​metastatisk sygdom. Forstå, hvordan denne proces reguleres derfor kritisk. Vi har tidligere vist, at endoglin, en type III-transformerende vækstfaktor β (TGFp) superfamilie receptor, undertrykker human PCa celleinvasion og metastase. Endoglin-medieret suppression af invasion var også af os at være afhængig af type I TGFp-receptor, activin receptor-lignende kinase 2 (Alk2), og den nedstrøms effektor, Smad1. I denne undersøgelse viser vi for første gang, at to type II TGFp-receptorer er påkrævet for endoglin-medieret suppression af invasionen: activin A receptortype IIA (ActRIIA) og knoglemorfogenetisk protein receptor type II (BMPRII). Nedstrøms signalering gennem disse receptorer er overvejende medieret af Smad1. ActRIIA stimulerer Smad1 aktivering i en kinase-afhængig måde, og det er nødvendigt for undertrykkelse af invasion. I modsætning BMPRII regulerer Smad1 bifasisk, fremme Smad1 signalering gennem sit kinasedomæne men undertrykke den gennem dens cytoplasmatiske hale. BMPRII s Smad1-regulerende effekter er afhængige af dens udtryk niveau. Endvidere dets evne til at undertrykke invasionen er uafhængig af enten kinase funktion eller hale domæne. Vi viser, at ActRIIA og BMPRII fysisk interagere, og at hver interagerer også med endoglin. De nuværende resultater viser, at både BMPRII og ActRIIA er nødvendige for endoglin-medieret hæmning af human PCa celleinvasion, at de har forskellige virkninger på Smad1 signalering, at de gør særskilte bidrag til regulering af invasion, og at de funktionelt og fysisk interagere.

Henvisning: Breen MJ, Moran DM, Liu W, Huang X, Vary CPH, Bergan RC (2013) Endoglin-medieret Undertrykkelse af prostatakræft invasion reguleres af activin og knoglemorfogenetisk protein type II-receptorer. PLoS ONE 8 (8): e72407. doi: 10,1371 /journal.pone.0072407

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: September 17, 2012; Accepteret: 15 juli 2013; Udgivet: 13 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Breen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health til RCB, CA122985. Dette arbejde er delvist understøttet af Malkin Scholars Programmer fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center of Northwestern University via en award til MB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft dødelighed for amerikanske mænd [1], med stort set alle dødsfald som følge af metastatisk sygdom [2]. Metastase er en meget ineffektiv proces, hvor cellerne skal overvinde mange barrierer, en indledende hvoraf den ene er flygte fra oprindelsesstedet med købet af en invasiv fænotype [3]. Signalering gennem TGFp-superfamilien og dets tilknyttede receptorer er en vigtig regulator af denne proces i talrige cancertyper [4], herunder PCa [5]

TGFp er prototypiske medlem af en familie af ekstracellulære ligander -. Hvoraf der er 33 i pattedyr – der regulerer mange udviklingsmæssige og homeostatiske processer, og gør det gennem en relativt bevaret signalering mekanisme [6]. Med kanoniske TGFp signalering, ligandbindende inducerer oligomerisering af dimerer af serin /threonin-kinase type I og type II-receptorer (RIS og Riis, henholdsvis), hvori konstitutivt aktiv Riis derefter phosphorylere RIS. Disse aktiverede RIS derefter phosphorylere nedstrøms receptor-associeret Smads (R-Smads). Det phosphorylerede R-Smad binder derefter til den fælles mægler, Smad4, og de resulterende komplekser påvirker gentranskription. Groft sagt, kan signaleringen gennem denne superfamilie opdeles i TGFp-lignende ligander hvis beslægtet RIS tendens til at være activinreceptoren-lignende kinase (ALK) 4, 5 eller 7, tendens til at aktivere R-Smads Smad2 eller 3, og knoglemorfogenetisk protein (BMP) -lignende ligander signalering gennem beslægtet RIS ALK1, 2, 3 eller 6, og R-Smads Smad1, 5 eller 8.

Endoglin (også omtalt som CD105) er et homodimert transmembranprotein der fungerer som en ekstra TGFp-superfamilien receptor, og betragtes som en type III-receptor [7] – [9]. Endoglin modulerer signalering nedstrøms for TGFp og BMP-ligander, tendens til fremme signalering fortrinsvis gennem BMP-lignende veje, mens inhiberende TGFp-lignende pathways [10] – [14]. Desuden endoglin regulerer talrige cellulære processer gennem ikke-Smad afhængige veje. Relevante for cellulær invasion, endoglin interagerer via sin cytoplasmatiske domæne med LIM-domænet-indeholdende proteiner zyxin og zyxin-relateret protein 1 at regulere fokal adhæsion sammensætning og actincytoskelettet [15], [16]. Endvidere endoglin regulerer integrin aktivering og signalering i en række cellulære processer [17] – [21]. Endoglin kan også modulere det transformerende potentiale H-Ras [22].

rolle endoglin i cancer er kompleks, givet differentiel ekspression og funktion tværs celletyper [23], [24]. De fleste studier af endoglin funktion er blevet udført på endotelceller. Kimcellelinje mutationer i endoglin forårsage genetiske sygdom hereditær teleangiektasi [25], fremhæver endoglin rolle som en vigtig regulator af endotelceller motilitet, invasion, og spredning. I multiple cancere herunder PCa, er endoglin overudtrykt i endotelceller i mikrovaskulaturen og er forbundet med angiogenese [26] – [28]. Det er også højt udtrykt i det stromale mikromiljø [29]. Således ved overordnet vævsniveau, endoglin ofte overudtrykkes i cancer. I kontrast og af stor betydning, i epitelceller i flere faste tumorer – og i prostata epitel i særdeleshed – vi og andre har vist, at endoglin ekspression går tabt med sygdomsprogression [30], [31]. Vi har vist, at dette tab fremmer celle løsrivelse [31], celleinvasion [14], [32] og metastase [33]. Mekanistisk, har vi vist, at endoglin undertrykker invasion på en måde, der er afhængig af RI Alk2 og den nedstrøms R-Smad Smad1 [14]. Men Riis er involveret i denne proces er fortsat ukendt.

I betragtning af den rolle alk2 og Smad1 i endoglin-medieret undertrykkelse af invasion (Emsi) i PCa, vi hypotese, at en eller flere Riis er involveret i denne proces. I denne rapport vi identificere, at ActRIIA og BMPRII er påkrævet. Interessant nok har modsatte virkninger på downstream Smad1 signalering. ActRIIA fremmer tidligere identificerede signalering akse, mens BMPRII har bimodal funktion, fremme Smad1-afhængig signalering via dens kinaseaktivitet mens inhibering det via sin store cytosolisk hale domæne. Tilsammen disse resultater er de første til at identificere ActRIIA og BMPRII som vigtige regulatorer af Emsi og vise, at de opererer gennem distinkte endnu indbyrdes afhængige mekanismer. Disse resultater åbner nye veje for farmakologisk målretning af PCa metastatisk potentiale

Materialer og metoder

Cell Culture Transfektion

Oprindelsen og dyrkningsbetingelser for PC3-M humane PCA celler er blevet beskrevet [34]. PC3-M linje er en meget metastatisk PC3-derivat-cellelinje. De blev holdt i RPMI 1640 medium suppleret med 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES-buffer, 50 enheder /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, Grand Island NY). DU145 celler er humane PCA celler afledt fra en hjernemetastaser og blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Disse celler blev opretholdt i DMEM-medium suppleret med de ovennævnte produkter ud over 1 mM natriumpyruvat (Life Technologies). Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% carbondioxid og 95% luft under sub-sammenflydende eksponentielle vækstbetingelser med triweekly ændringer af medium, og blev erstattet med fast passage celler på en regelmæssig basis.

cellelinier blev autentificeret ifølge fremgangsmåder beskrevet i American Type Culture Collection Technical Bulletin No. 8, cellelinie Verification Test Anbefalinger [35]. Konkret celler fra lav passage (dvs.,. 15 passager) var frosne lagre brugt og blev genopfyldes efter 20 passager; celler undergik rutine mikroskopisk undersøgelse for at bekræfte ensartet og standard cellulær arkitektur og ingen mikrobiel infektion; og celler blev testet (inden for tre måneder) og fundet negative for mycoplasma-infektion.

Transient transfektion af celler blev udført som tidligere beskrevet [36]. Kort fortalt 24 timer efter udpladning blev cellerne transficeret med transit-LT1 Transfektion Reagent (Mirus Bio LLC, Madison, WI) for invasion assays, der kun involverer plasmid-DNA, med Dharmafect Duo (Thermo Scientific, Lafayette, CO) for invasion analyser involverer samtidig levering af plasmid DNA og siRNA, eller med Dharmafect2 (Thermo Scientific, tidligere Dharmacon) for invasion og luciferase forsøg med levering af siRNA alene. For immunopræcipitationseksperimenter blev celler transficeret med plasmid-DNA under anvendelse af lipofectamin LTX (Life Technologies). Celler blev derefter anvendt i de angivne assays 24-48 timer efter transfektion. Alle reagenser blev anvendt ifølge producentens anvisninger. I nogle eksperimenter som angivet, celler blev vasket to gange med PBS, serum-udsultet i medium indeholdende 0,1% bovint serumalbumin i 3 timer og behandlet med 2 ng /ml TGFp, 5 ng /ml BMP7, eller 20 ng /ml BMP9 30 minutter før lysis

Reagenser

neutraliserende antistof til ActRIIA, Fc-ActRIIA og Fc-BMPRII ligand fælder, og rekombinant human TGFp blev købt fra R . D Systems (Minneapolis MN) . Antistoffer mod følgende proteiner blev købt: phospho-Smad1 /5, phospho-Smad1 /5/8 Smad1, og Myc-mærke fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA), endoglin fra BD Biosciences (San Jose, CA), GAPDH fra Enzo Life Sciences (Farmingdale NY), FLAG-mærke og Myc-tag fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), α-tubulin fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), HRP-konjugeret gede-anti-muse-IgG (H + L) F (ab ‘) 2-fragment fra KPL (Gaithersburg, MD), og ECL æsel-anti-kanin helt antistof fra GE Healthcare Biosciences (Pittsburgh, PA). De siRNAs anvendt i denne undersøgelse var alle puljer af fire individuelle siRNAs, bestilt fra Thermo Scientific som ON-TARGETplus SMARTpools

plasmider

Følgende ekspressionsvektorer blev anvendt:. PCDNA3 tom vektor købt fra Life teknologier, endoglin i en pCDNA3-vektor, blev konstrueret og tidligere beskrevet af os [31], pCMV-β-galactosidase (β-gal) indkøbt fra Agilent Technologies (Santa Clara, CA), pCDNA3-ActRII, pCDNA3-ActRIIA-ΔKD- 5myc, pCDNA3-ActRIIB og pCDNA3-ActRIIB-ΔKD-5myc var generøst tilvejebragt af Wylie Vale (Salk Institute, La Jolla, CA) [37], [38], pCDNA3-ActRIIA-myc blev genereret fra pCDNA3-ActRIIA ved Brugerdefineret DNA konstruktioner (University Heights, OH), blev pCMV5-BMPRII, -BMPRII-KI og -BMPRII-Δtail konstruktioner generøst tilvejebragt af Liliana Attisano (University of Toronoto, Canada) [39], pGL3-MLP-BRE

2-luciferase var en generøs gave fra Peter ti Dijke (Leiden University Medical Centre, Holland) [40], pRL-TK

Renilla

luciferase blev købt fra Promega (Madison, WI).

Invasion Analyser

Invasion assays blev udført i det væsentlige som tidligere beskrevet af os [41], med følgende modifikationer. Kort beskrevet blev cellerne co-transficeret med den angivne DNA- og β-gal, med eller uden siRNA som angivet. Efter 48 timer blev celler udpladet på 8,0 um porestørrelse Growth Factor-Reduceret Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences) i serumfrie medier indeholdende 0,1% BSA, i replikater af N = 4 brønde til hver eksperimentel betingelse. Serumfrit NIH-3T3 konditionerede medier blev anbragt i bundkammeret som kemoattraktant, og cellerne fik lov til at invadere i 24 timer. Celler på toppen af ​​membranen blev fjernet fra tre brønde pr betingelse (tillader kvantificering af invaderede celler), mens den fjerde blev efterladt uforstyrrede (samlede cellekontroller). Efter fastsættelse celler og farvning for β-gal-ekspression ved hjælp af en in situ ß-galactosidase Farvning Kit (Agilent Technologies), ni mikroskopiske felter (for 100x) per brønd blev afbildet på et Olympus CKX41 mikroskop udstyret med en QImaging RETIGA 1300 digital CCD kamera og QCapture imaging software. β-gal-positive celler blev talt i hvert felt hjælp af Image J software og normaliseret invasion blev bestemt for hver brønd som Øgal

+ celler i invasion brønd /β-gal

+ -celler i alt godt. Relativ invasion blev beregnet som en brøkdel af en kontrol tilstand (f.eks tom vektor /siNeg).

Kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion

RNA blev isoleret fra celler ved hjælp RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia , CA), ifølge producentens anvisninger. RNA blev behandlet med RNase fri DNase og dens kvalitet og kvantitet vurderet af optisk tæthed. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af enten TaqMan revers transkription Reagenser (Life Technologies) eller qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD), og qPCR udføres med TaqMan Universal PCR Master Mix og TaqMan-primer-probe par på en 7500 Real Time PCR System (alle fra Life Technologies), alle som tidligere beskrevet af os [33]. RT minus kontrolreaktioner blev kørt som en negativ kontrol. Valideret gen specifikke exon spænder primer /probe sæt til ACVR2A, ACVR2B, BMPRII, TGFβRII, endoglin, Smad1, Smad5, Smad8, og GAPDH var fra Applied Biosystems. Assays blev kørt i replikater af 2, og de resulterende gennemsnitlige tærskel cyklusser (CT) blev anvendt til yderligere analyse. Assays blev gentaget mindst en gang på et separat, også som replikater af 2. Ct for individuelle reaktioner blev identificeret gennem Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System software. Genekspression blev normaliseret med den for GAPDH, og relativ genekspression blev beregnet af 2

-ΔΔCt metode [42].

luciferaseassays Salg

Celler blev kortvarigt transficeret med pGL3 BRE

2-luciferase (inducerbar) og pRL-TK (konstitutive) plasmider i et forhold på 20:01, med yderligere plasmider ± siRNA’er som angivet, som tidligere beskrevet af os [14]. Kort fortalt, efter 48 timer blev cellerne lyseret, og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af en dobbelt-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Målingerne blev foretaget på enten en Synergy HT pladelæser (BioTek, Winooski, VT) eller en Monolight 2010 luminometer (Analytical Luminescence Laboratory, San Diega CA). Efter fratrække baggrund signal, blev luciferaseaktivitet beregnet som forholdet mellem ildflueluciferase /

Renilla

luciferase.

Western Blotting

Cell lyse og immunoblotting blev udført som tidligere beskrevet af os [ ,,,0],14]. Kort fortalt blev cellerne vasket med PBS, lyseret med lyseringsbuffer: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na-phosphat, 2,7 mM KCI), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM β-glycerophosphat med tilsætning af protease inhibitor cocktail (# P8340,) phosphatase inhibitor cocktails 1 og 2, 10 mM natriumfluorid, og 1 mM natriumorthovanadat (alle fra Sigma-Aldrich), og lysater klaredes ved centrifugering, alle ved 4 ° C. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-metoden (Bio-Rad, Hercules, CA), blev ens mængder separeret ved SDS-PAGE under denaturerende og reducerende betingelser, overført til nitrocellulose (Bio-Rad), og farvet med Ponceau S (Sigma-Aldrich ) at kontrollere, selv lastning og overførsel. Membraner blev enten blokeret og probet med primær (4 ° C natten over) og sekundært antistof (1 time stuetemperatur) i 5% mælk i TBS-T (25 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) eller blokeret og probet med 0,5% mælk /TBS-T ved hjælp af SNAP id vakuummanifold (Millipore), ifølge producentens forslag. Membraner blev derefter inkuberet med ECL Western blotting detektionsreagenser og eksponeret for Amersham Hyperfilm ECL (begge fra GE Healthcare). Film blev udviklet under anvendelse af et SRX-101A film processor (Konica Minolta, Wayne, NJ). Membraner blev strippet i 62,5 mM Tris (pH 6,8), 2% SDS og 100 mM β-mercaptoethanol i 20 minutter ved 50 ° C, vasket kortvarigt i TBS-T, og re-probet som ovenfor. Alle Western blots blev gentaget mindst en gang, på en separat tid.

Immunopræcipitation

Celler blev vasket med PBS og overfladeproteiner blev tværbundet med 2 mM vandpermeabel tværbindingsreagens 3,3′- dithiobis (sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP, Thermo Scientific) i PBS. Tværbindingsreaktion blev standset ved tilsætning af Tris, pH 7,5 til 20 mM. Celler blev derefter lyseret som ovenfor under anvendelse puffer sammensat af følgende: 10 mM Tris-HCI, pH 7,4; 145 mM NaCl; 10% glycerol; 0,5% NP-40; protease og phosphataseinhibitorer som ovenfor. Lysater blev klaret ved centrifugering og proteinkoncentration blev bestemt ved Bradford-metoden som ovenfor. Samme mængde protein blev klaret med agaroseperler konjugeret til rekombinant protein A (Life Technologies; anvendes til kanin IgG) eller protein G Plus (Thermo Scientific; anvendes til muse IgG) i 1 time ved 4 ° C med rotation. -Klaret lysater blev overført til nye rør og inkuberet med IgG natten over ved 4 ° med rotation. Antistof-antigenkomplekser blev udvundet ved 2 timers inkubation med protein A eller protein G, i overensstemmelse med de i preclearance trin. Perler blev udvundet og supernatanten blev fjernet og gemt. Perlerne blev vasket tre gange med iskold lysepuffer. Prøver blev ækvilibreret til 1X Laemmli-puffer indeholdende 5% β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) og inkuberet i 95 ° C varmeblok i 6 min, hvilket reducerer og denaturering af prøver og spaltning tværbinderen. Prøver var vestlige slettet som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

At analysere invasion assays ensidet uparret Students t-test blev beregnet på grundlag af den vurderede fænotype vende undertrykkelse af invasion. For luciferaseassays og QRT-PCR, blev Students tohalet uparret Students t-test anvendes. P values≤0.05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

Endoglin-medieret Undertrykkelse af Invasion Kræver ActRIIA og BMPRII

Endoglin-medieret undertrykkelse af invasion (Emsi) i PCa kræver en RI, dvs. alk2 [14]. Desuden kanonisk signalering gennem TGFp-superfamilien af ​​receptorer kræver ligand-afhængig aktivering af RI ved en [6] RII. Vi hypotese derfor, at Emsi ville kræve en eller flere Riis. Vi evaluerede dette ved transfektion PC3-M og DU-145 humane PCA-celler med endoglin, sammen med siRNA specifikke for individuelle RII undertyper: aktivin A receptortype IIA (ActRIIA), activin A receptortype IIB (ActRIIB), knoglemorfogenetisk protein receptortype II (BMPRII) eller transformerende vækstfaktor β receptor type II (TGFβRII). For både PC3-M og DU-145-celler, endoglin undertrykker signifikant invasion til 60% og 50% af kontrolceller, henholdsvis, og det ophæves af siRNA targeting ActRIIA eller BMPRII men ikke ActRIIB eller TGFβRII (figur 1A). For yderligere at undersøge mekanismen for ActRIIA og BMPRII at påvirke Emsi, undersøgelser fokuseret på de menneskelige PC3-M PCA celler. De udgør en metastatisk fænotype [34], og er kendt for at udtrykke meget lave baseline niveauer af endoglin [14].

A) Effekten af ​​type II receptorer på endoglin medieret undertrykkelse af invasion (Emsi). PC3-M (venstre) eller DU-145 (højre) celler blev transient transficeret med tom vektor (Vec) eller med endoglin sammen med siRNA, som angivet. Følgende siRNA’er blev anvendt: siNeg – ikke-targeting negativ kontrol, si2A – henvender ActRIIA, si2B – mål ActRIIB, siBMP – mål BMPRII, siTGF – mål TGFβRII. Efter 48 timer blev celleinvasion målt. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM af 3 uafhængige forsøg, der hver i replikater af 3. *, p ≤ 0,05 sammenlignet med Vec /siNeg. Mikrografer er repræsentative billeder af celler, der har invaderet gennem Matrigel, blev farvet for agal, og afbildes (forstørrelse 100X). B) ActRIIA og BMPRII siRNA er specifik. PC3-M-celler blev transient transficeret med endoglin sammen med de angivne siRNA’er som i (A). Efter 48 timer mRNA-ekspression blev vurderet via QRT-PCR, normaliseret til GAPDH, og udtrykt i forhold til siNeg-transficerede celler (normaliseret til 1,0). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af et enkelt forsøg, udført i replikater af N = 2; lignende resultater blev set i et uafhængigt forsøg (N = 2 replikater). *, P ≤ 0,05 sammenlignet med siNeg. C) ActRIIA og BMPRII siRNA undertrykker målprotein. PC3-M-celler blev transficeret med ActRIIA-myc (øvre paneler) eller BMPRII-flag (lavere paneler), samt med de angivne siRNA’er, efterfulgt af Western blot for angivne proteiner. Data er fra et repræsentativt forsøg (n = 2 separate forsøg). D) Blokering ActRIIA eller BMPRII ligandbinding hæmmer Emsi. PC3-M-celler blev transient transficeret med tom vektor eller endoglin som ovenfor. Efter 2 dage blev celler forbehandlet i 5 timer ligand fælder bestående af ActRIIA eller BMPRII ekstracellulære domæne fusioneret til immunoglobulin Fc-region (Fc-A2 eller Fc-B2 henholdsvis). Behandlingen fortsatte i den efterfølgende gennemførelse af celle invasion assays. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SEM af 3 uafhængige forsøg, der hver i replikater af N = 3. *, p ≤ 0,05 sammenlignet med Vec /-.

Der er tæt homologi blandt TGFp superfamilien receptorer. Det er derfor særlig vigtigt at tage fat siRNA specificitet, som vi demonstrere i figur 1B. Brug sekvens specifikke primere for hver receptor, viser vi ved QRT-PCR, at receptor specifikke siRNA betydeligt vælter den målrettede receptor med ≥60% i hvert enkelt tilfælde, med ingen signifikant modulation af uden for målgruppen receptorer. Effekten og specificitet siRNA målrettet ActRIIA og BMPRII blev næste demonstreret ved at måle effekter på proteinniveau. En endemisk problem inden for området vedrører det faktum, at antistoffer rejst mod et givet TGFp superfamilie receptorundertype tendens til at have relativt høje niveauer af krydsreaktivitet. Vi behandlet dette ved co-transfektion af celler med enten myc-mærkede ActRIIA eller FLAG-mærkede BMPRII, sammen med siRNA til individuelle Riis, efterfulgt af tag-specifikke Western blot (figur 1C). På denne måde demonstrerer vi receptor-specifikke siRNA-medieret hæmning af protein-ekspression til næsten ikke-detekterbare niveauer for både ActRIIA og BMPRII.

Binding af ekstracellulære ligander til ActRIIA og BMPRII udgør en vigtigste faktor for deres signalering funktion. Vores hypotese er derfor, at hvis ActRIIA og BMPRII er virkelig vigtige regulatorer af emsi, så deres modulation af denne proces bør være afhængig beslægtede ligander, i det mindste delvis. Vi fastslået, at dette er faktisk er tilfældet ved transfektion af celler med endoglin efterfulgt af måling af effekt på invasionen når ekstracellulære beslægtede ligander blev blokeret fra receptorbinding (Figur 1D). Dette blev opnået ved at behandle celler med rekombinante proteinkonstruktioner, Fc-A2 eller Fc-B2, der består af ActRIIA eller BMPRII ekstracellulære domæner henholdsvis fusioneret til et immunglobulin-konstant domæne, således tjene som en ligand fælde. Som det kan ses i figur 1 D, blokering af ligand-binding til enten receptoren reverserer emsi. Disse ligand-blokerende studier supplerer vores Knockdown undersøgelser. Tilsammen vores resultater implicerer ActRIIA og BMPRII som vigtige fysiologiske regulatorer af Emsi.

ActRIIA og BMPRII har modsatte Virkninger på Downstream Smad1 Signaling

Vi har tidligere vist, at endoglin øger fosforylering af Smad1, at Smad1 undertrykker celleinvasion, og at Smad1 er nødvendig for emsi [14]. Vi evaluerede derfor effekten af ​​ActRIIA og BMPRII om reguleringen af ​​Smad1 fosforylering. Dette blev gjort ved at vælte ActRIIA eller BMPRII via transfektion af PC3-M-celler med siRNA mens cotransfektion med tom vektor eller endoglin. Phosphorylering af Smad1 blev derefter vurderet ved Western blot (figur 2A). Uanset endoglin status, knockdown af ActRIIA nedsætter phospho-Smad1 niveauer. Overraskende knockdown af BMPRII har den modsatte effekt; det øger phospho-Smad1. Som med vores tidligere undersøgelser [31], den endogene endoglin udtryk i PC3-M-celler er så lav som at nærme detektionsgrænsen.

PC3-M-celler blev forbigående transficeret med tom vektor eller endoglin og den angivne siRNA som i figur 1. To dage senere blev cellerne lyseret for Western blot (A) eller luciferase-promotor assay (B). A) ActRIIA og BMPRII differentielt regulerer Smad1 proteinphosphorylering. Western blot på resulterende cellelysat blev udført i Smad1, phospho-Smad1 /5 (pSmad1 /5), endoglin og GAPDH. Data er fra et repræsentativt forsøg (n = 4 forsøg). B) ActRIIA og BMPRII differentielt regulerer BRE

2-luciferaseaktivering. Celler blev desuden cotransficeret med BRE

2-luciferase og

Renilla

luciferase konstruktioner, og luciferaseaktivitet (normaliseret til

Renilla

luciferaseaktivitet) blev målt. Data er gennemsnit ± SD fra et enkelt forsøg i replikater af N = 2, gennemført tre særskilte gange med lignende resultater (også N = 2). *, P ≤ 0,05 mellem de angivne grupper. C) BMP7- og BMP9-stimuleret Smad1 fosforylering er forskelligt reguleret af ActRII og BMPRII. Celler blev transficeret som ovenfor, serum-udsultet, og behandlet med BMP7 eller BMP9 som angivet. Western blot på resulterende cellelysat blev udført for phospho-Smad1 /5 (pSmad1 /5) og total Smad1. Dataene er fra et repræsentativt forsøg (N = 2 eksperimenter).

Vi har tidligere demonstreret i det samme system, vi bruger i øjeblikket at primære inducerede stigninger i endoglin udtryk status fremkalde stigninger i både Smad1 fosforylering samt som i Smad1 transkriptionel aktivitet, som målt ved luciferase reporter assay under anvendelse af Smad1-responsive BRE

2-luciferase-reporterkonstruktion [14]. Vigtigere er det, i dette samme system, har vi også vist, hvordan flere forskellige forstyrrelser har diskordante virkninger på Smad1 phosphorylering og dets funktionelle transskriptionelle aktivitet. Men i alle tilfælde, ændringer i Smad1 transkriptionel funktion afspejles overensstemmende virkninger på biologisk funktion, som vurderet af tilknyttede Smad1 Knockdown undersøgelser samt invasion analyser [14], [32]. Mens den mekanisme der ligger til grund dette fænomen ikke er helt klar, ser det ud til at afspejle det faktum, at humane prostata celler indeholder meget høje niveauer af syrephosphatase, og at der under cellelyse det har protein-specifikke effekter, som ikke i tilstrækkelig grad bragt i skak selv med høj niveauer af phosphataseinhibitorer [43]. Vi mener derfor vurdering af Smad1 transkriptionel funktion at være den informative assay. Som sådan, vi gik at evaluere effekten af ​​ActRIIA og BMPRII knockdown på BRE

2-luciferaseaktivering (figur 2B). Igen viser vi, at uanset endoglin status, knockdown af ActRIIA signifikant nedsætter Smad1 funktion mens knockdown af BMPRII øger det. Disse resultater stemmer overens med de Smad1 phosphorylering Dataene i figur 2A, og viser, at ændringer i Smad1 phosphorylering er forbundet med ændret Smad-medieret transkription. Men de viser også, at BMPRII-inducerede virkninger på Smad1 transkriptionel funktion er ikke kongruent med BMPRII effekt på Emsi.

For at undersøge BMPRII yderligere undersøgte vi effekter på signalering under forhold med knogle protein (BMP) ligand stimulation . ActRIIA og BMPRII blev slået ned som i figur 2A blev celler serumudsultet, simuleret med enten BMP7 eller BMP9, og Smad1 /5 phosphorylering vurderes ved Western blot (figur 2C). Med enten BMP7 eller BMP9, knockdown af ActRIIA svækker ligand-stimuleret Smad1 /5 phosphorylering, mens knockdown af BMPRII forøger det. Ved at demonstrere en lignende signalering respons profil under betingelser med BMP ligand stimulation sammenlignet med den for standard dyrkningsbetingelser, er betydningen af ​​BMP yderligere understøttet. Disse resultater bekræfter dem i figur 1D, som viser, at BMP-ligand er nødvendig for Emsi.

Hverken BRE

2-luciferase promoter systemet eller de aktuelt tilgængelige phospho-Smad antistoffer er i stand til helt at skelne mellem Smad1 , Smad5 og Smad8 isoformer. Vi vurderede derfor, i hvilket omfang disse andre Smad isoformer kunne redegøre for de aktuelt observerede virkninger. Konkret da BMPRII knockdown uventet førte til, hvad syntes at være øget Smad1 signalering, vi ønskede at undersøge muligheden for, at BMPRII knockdown var stigende Smad5 eller Smad8 signalering, potentielt maskering en funktionelt vigtig fald i Smad1 signalering. Brug gen-specifikke QRT-PCR-analyse, vi først vise, at siRNA til de enkelte Smad isoformer er meget specifik og effektiv, markant tavshed den målrettede isoform med ≥90% i hvert enkelt tilfælde, og samtidig have nogen signifikant effekt på uden for målgruppen isoformer (figur 3A). Dernæst forsøgt at bestemme hvilke Smads blev aktiveret ved endoglin overekspression. Knockdown af Smad1 resulterer i nær totalt tab af specifikt signal fra et antistof, som genkender phospho-Smad1, 5 og 8 (figur 3B). Vi kontrollere, at Smad1 proteinekspression effektivt undertrykt af siRNA til Smad1, men er ikke undertrykt af siRNA målrettet Smad5 eller Smad8. Anvendelse af et antistof, der genkender både phosphoryleret Smad1 og Smad5, vi vise, at Smad5 også phosphoryleres i tilstedeværelse af endoglin. Derefter gik vi på at vise, at knockdown af Smad1 forårsager en reduktion på 90% af endoglin-inducerede stigning i BRE

2-luciferase (figur 3C). I modsætning hertil endoglin-inducerede stigning i BRE

2-luciferaseaktivitet mindskes ved kun 30% efter Smad5 knockdown, og slet ikke ved Smad8 knockdown. Endelig, som vi viser i figur 2, at BMPRII knockdown øger Smad1 aktivering, undersøgte vi effekten af ​​Smad isoform undertrykkelse i ansigtet af BMPRII knockdown i endoglin fyldt celler (Figur 3D). Svarende til fund i figur 3C, Smad1 knockdown ophæver betydeligt øgede BRE

2-luciferaseaktivitet opnået ved BMPRII knockdown, mens Smad5 eller Smad8 knockdown har ingen signifikant effekt. Alle sammen de ovenstående resultater viser, at ActRIIA øger Smad1 phosphorylering og funktion, mens BMPRII falder det.