Hvordan man fremstille transgene mus og transgene Rat

transgen mus og rotte er genetisk modificerede dyr, hvis genomer er ændret ved anvendelse af gensplejsningsteknikker. Genetisk modificerede mus er almindeligt anvendt til forskning eller som dyremodeller for humane sygdomme. Hvordan har de forskere gøre disse transgene dyr? Generelt undersøgerne først brug for at konstruere et transgen med en promotor og et strukturgen. Derefter DNA fremstilles og mikroinjiceret i fertiliserede museæg, og senere de transgene mus eller rotter er født. De følgende passager giver en kort oversigt over de nødvendige for at opnå transgene mus eller transgene rotter trin.

1. Plan og Forbered Experiment

Man må gøre det klart, hvad formålet er. Så har han brug for at opnå eller klone den ønskede promotor og strukturelle gen og etablere en genekspression assay for den specifikke forskning. Ekspression af nogle gener vil være skadelig eller inkompatibel med korrekt vækst og udvikling af embryoet. Ekspressionen af ​​et transgen kræver, at de passende transskriptionelle kontrolelementer inkluderes i DNA-konstruktionen. Foreløbige undersøgelser i cellekulturer kan kontaktes for at kontrollere integriteten af ​​konstruktionen og funktionen af ​​promotoren.

2. Klon og kontrollere integriteten af ​​transgenet

Flere ting bør overvejes under kloning. Transgenet bør indeholde unikke markører, således at dets tilstedeværelse kan let påvises i musevæv DNA-prøver og dets ekspression kan analyseres og skelnes fra endogen genekspression. Sekventering af forbindelsesfragmenter bør udføres for at bekræfte, at transgenet har en funktionel promotor, initieringscodon, og polyadenyleringssignal. Under de bedste omstændigheder bør transgenet testes til ekspression i en cellekultur, inden transgene mus er lavet.

3. Etablere en screeningsmetode

En PCR-analysen er stærkt anbefales til at identificere transgene dyr. Før indgivelse af DNA til mikroinjektion i befrugtede mus eller rotte æg, bør man fremstille et PCR eller Southern-blot-assay anvendes til at detektere transgenet, når det er tilsat til hale-DNA ved en én kopi koncentration. Et andet assay til at detektere en endogene muse-gen eller et endogent rottegen er nødvendig for at påvise, at de DNA-præparater er fri for PCR-inhibitorer. Dyrene testes med begge analyser, så der ikke transgene grundlægger er fejlagtigt kasseres, fordi halen DNA er forurenet med PCR-hæmmere.

4. Etablere et udtryk Assay

Man kan bruge RT-PCR tilgang RNA-ekspression ved in situ-hybridisering eller RNAse beskyttelse assay med RNA-prober for at opnå ekspression af transgenet. Proteinet, der skal produceres, skal være forskellige fra proteiner normalt udtrykkes i musen. Der er flere måder at opnå dette, og man kan bruge et reportergen såsom et fluorescerende protein til at visualisere processen direkte.

5. DNA Oprensning og Mikroinjektion.

DNA ekstrakt kit anbefales til rensning af mikroinjektion DNA. Men hvis man ønsker at bruge store DNA-fragmenter, der er en særlig protokol til forberedelse af BAC DNA for mikroinjektion. Talrige publikationer viser, at BAC’er, der indeholder prokaryote vektorsekvenser udtrykkes ved fysiologiske niveauer i transgene mus. I modsætning til plasmid baserede transgener, fjernelse af vektor sekvenser i ikke kræves til BAC transgener. Transgene konstruktioner derefter kvantificeres og mikroinjiceret i mus æg og kirurgisk overført til modtagerne.

6. sydlige Analyse

6 uger gamle Southern blot-analyse bør gøres for at bestemme, hvor mange kopier af transgen integrerede, og hvor mange kromosomale sites transgenet indsat i, og også at verificere transgene status og afgøre, om transgenet er intakt. De oplysninger er nødvendige for at sikre, at transgene grundlæggere med en god chance for overførsel af en intakt transgen i en enkelt indsættelse site kan vælges til intensiv avl.