PLoS ONE: Nicotinamid phosphoribosyltransferase (Nampt) er mål for MicroRNA-26b i kolorektal cancer Cells

Abstrakt

En række kræftformer viser øget ekspression af Nicotinamid phosphoribosyltransferase (Nampt). Men den mekanisme, gennem hvilken Nampt opreguleres er uklar. I vores undersøgelse fandt vi, at Nampt-specifikke kemiske inhibitor FK866 signifikant inhiberede celle overlevelse og reduceret nikotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) niveauer i LoVo og SW480 cellelinier. Bioinformatik analyser antydede, at MIR-26b målretter Nampt mRNA. Vi identificerede Nampt som et nyt mål på MIR-26b og viste, at MIR-26b inhiberer Nampt ekspression på proteinniveauet og mRNA-niveauer ved binding til Nampt 3′-UTR. Endvidere fandt vi, at MIR-26b ned blev reguleret i cancervæv forhold til det i tilgrænsende normale væv i 18 patienter med tarmkræft. En statistisk signifikant omvendt korrelation mellem miR-26b og Nampt ekspression blev observeret i prøver fra patienter med tyktarmskræft og i 5 kolorektale cellelinjer (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, og HCT116). Desuden overekspression af MIR-26b inhiberede kraftigt LoVo celleoverlevelse og invasion, en effekt delvist ophævet ved tilsætning af NAD. Som konklusion viste denne undersøgelse, at NAD-genanvendelse biosyntesevejen involverer Nampt kan spille en rolle i colorektal cancer celleoverlevelse. MIR-26b kan tjene som en tumor suppressor ved at målrette Nampt

Henvisning:. Zhang C, Tong J, Huang G (2013) Nicotinamid phosphoribosyltransferase (Nampt) er mål for MicroRNA-26b i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 8 (7): e69963. doi: 10,1371 /journal.pone.0069963

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: Februar 27, 2013; Accepteret: 13 Juni 2013; Udgivet: 29 juli 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af forskningsbevillinger fra National Natural Science Foundation of China (tal 30830038, 30970842, 81071180, 81000929); “973” Projekt (2012CB932604); New Drug Discovery Project (2012ZX09506-001-005); Key Projekt for Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (antal 10JC1410000); og Shanghai Leading Academic Discipline Project (nummer S30203). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

proteinet nicotinamid phosphoribosyltransferase (Nampt) har flere funktioner. Den findes i intercellulære (iNAMPT) og ekstracellulære (eNAMPT) former [1]. I celler, fungerer den som en hastighedsbegrænsende enzym i frelsesyntesevejen til syntese af nikotinamidadenindinukleotid (NAD), som er involveret i cellestofskiftet og proliferation [2]. Ekstracellulær Nampt blev først identificeret som præ-B-celle-koloni øge faktor (PBEF), et cytokin-lignende protein, som stimulerede tidlig B-celle formation [3]. Det blev omdøbt sent som visfatin af Fukuhara et al., Som identificerede det som en visceralt fedt-afledt adipokine, der menes at efterligne insulin funktion [4]. Nampt har trukket betydelig interesse ikke kun inden for metabolisme og immunrespons, men også med hensyn til kræft. En række kræftformer viser øget ekspression af Nampt [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], og inhibitorer af Nampt tilbyde lovende terapeutiske anvendelser i kræft [12] [13], [14], [15]. Men den mekanisme, gennem hvilken Nampt bliver opreguleret er uklar.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små ikke-kodende RNA. Identificeret som en ny klasse af genekspression regulatorer, de er rettet mod mRNA’er for translationel undertrykkelse eller nedbrydning [16]. En række undersøgelser har vist, at miRNA kan regulere ekspressionen af ​​en række gener, herunder de vigtige for tumor proliferation, invasion, eller metastase [17], [18], [19]. Anvendeligheden af ​​miRNA i behandlingen af ​​cancer er blevet påvist [20], [21], [22].

I denne undersøgelse demonstrerede vi, at NAD-genanvendelse biosyntesevejen involverer Nampt spiller en rolle i colorektal cancer celleoverlevelse. Vi viste for første gang, at Nampt er et mål for miR-26b. Desuden blev ekspressionen af ​​miR-26b og Nampt analyseret i humane prøver af patienter med tyktarmskræft og 5 kolorektal kræftceller. Roller miR-26b og Nampt i udviklingen af ​​menneskelige cancer diskuteres.

Metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse er godkendt af den etiske komité for Ren Ji Sygehus, skole af medicin, Shanghai Jiao Tong University. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pasning og anvendelse af humane prøver fra Ren Ji Sygehus.

cellelinier og vævsprøver

kolorektal cancer cellelinjer SW480, SW1116 , HT-29, blev LoVo, og HCT116 anvendt i denne undersøgelse (opnået fra Shanghai Institute of gastrointestinale sygdomme, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kina). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en CO 5%

2 befugtet inkubator ved 37 ° C.

Vævsprøver fra human colorectal og tilstødende normale kolorektale væv blev opnået fra 18 patienter, som gennemgik kirurgi i Ren Ji Sygehus, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Ingen af ​​patienterne modtog kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Prøver blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C. De histopatologiske diagnoser blev evalueret af hospitalets patolog ved hjælp af både morfologiske kriterier og immuncytokemi. Alle patienter har givet deres skriftligt informeret samtykke (som skitseret i PLoS samtykkeerklæring), før vævet indsamling, og undersøgelsen blev godkendt af etiske komitéer i Ren Ji Sygehus, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University.

CCK-8 Assay

cellen overlevelse blev undersøgt ved hjælp af Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo). Celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved 5000 celler /brønd i komplet medium og dyrket i 24 timer. Mediet blev derefter erstattet med RPMI-1640 indeholdende 10% FBS, med eller uden behandling. Efter inkubation blev 10 pi CCK-8 tilsættes til hver brønd, og pladerne blev yderligere inkuberet i 4 timer i en inkubator. Absorbansen ved 490 nm blev aflæst spektrofotometrisk under anvendelse af en mikropladelæser.

Apoptose Assay

Cell apoptose blev bestemt ved Vybrant apoptose assay kit # 2 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Hver prøve blev evalueret med flowcytometri med et Coulter Epics XL flowcytometer (Beckman-Coulter). Data blev behandlet med Expo 32 cytometer software (Beckman-Coulter). Eksperimenter blev udført tre gange i to eksemplarer.

NAD + og NADH Kvantificering

Koncentrationerne af NAD

+ og NADH i celler blev påvist ved hjælp af en NAD

+ /NADH Kvantificering Kit ( Bio Vision) ifølge manualen. Mængden af ​​NAD

+ i hver prøve blev normaliseret til indholdet for hver prøve protein

Forudsigelse af miRNA Mål

Computer-baserede Targetscan (http:. //www.targetscan .org /) blev anvendt til at forudsige de miRNA, der er målrettet Nampt mRNA.

Knockdown eller overekspression af miR-26b

Angivelse af miR-26b i celler blev slået ned ved transfektion med miR-26b inhibitor (GenePharma) eller øges ved transfektion med mIR-26b efterligner (GenePharma). Cellerne blev udpladet i dyrkningsskåle eller 24-brønds plader i 24 timer og derefter transficeret med inhibitor eller efterligner anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i 24 timer. Efter transfektion blev cellerne udsættes for yderligere assays eller til RNA /protein-ekstraktion.

RNA-ekstraktion og Real-time RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler og kolorektal cancer prøver hjælp TRlzol (Invitrogen). Niveauerne af Nampt mRNA og MIR-26b blev målt ved real-time RT-PCR. Til påvisning af Nampt mRNA, revers transkription blev udført under anvendelse af M-MuLV revers transkriptase System, og real-time PCR blev udført ved anvendelse SYBR Green (Takara) med ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt til normalisering. Til måling af MIR-26b-niveauer, blev kvantitativ real-time RT-PCR-analyse udført under anvendelse af TaqMan Reverse Transcription Kit og TaqMan miRNA tests Kit (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. En human U6 lille nukleare RNA TaqMan probe blev anvendt til normalisering. Primersekvenser (fremad og tilbage) er anført i tabel 1.

Western Blotting

Et lige antal pelleterede celler blev vasket med iskold phosphatbufret saltvand (PBS), igen pelleteret og resuspenderet i RIPA-buffer. Efterfølgende blev cellerne inkuberet ved 95 ° C i 5 min og centrifugeret i en mikrocentrifuge i 5 minutter. Lige store mængder totalt protein blev fyldt til elektroforese i natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgeler og derefter overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev blokeret med 5% TBS-T i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med primært antistof i TBS-T i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Efter vask 4 gange i 5 minutter hver i TBS-T, blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Kangchen Technology) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask 4 gange i 5 minutter, blev proteinbånd visualiseret gennem kemiluminescens reaktion og eksponeret for røntgenfilm. Det primære antistof, anti-Nampt antistof (katalog nummer AP9010c), var fra Abgent. Data blev behandlet i den 2-ΔΔCT metode.

reporterkonstruktioner

De formodede miRNA26b-genkendelse elementer fra Nampt genet og tilsvarende mutanter blev klonet i 3′-utranslaterede region (UTR) af luciferasegenet i pEZX-MT01 luciferase vektor (GeneCopoeia Inc.). Dette udtryk klon indeholdt Nampt (deponeringsnummer: NM_005746.2) 3′-UTR-sekvens indsat i pEZX-MT01 vektor nedstrøms for en ildflue-luciferase-genet under kontrol af en SV40-promotor. Den pEZX-MT01 vektor indeholdt også den Renilla luciferase genet under kontrol af en CMV-promotor. Ildflueluciferase aktivitet blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. De mutante kloner for Nampt blev konstrueret. Frøet bindingsregion (5′-UACUUGAA-3 ‘) blev ændret til 5′-UACUUACA-3’ (2-bp udskiftning). Alle konstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekvensanalyse.

Luciferase Reporter Assay

SW480-celler blev dyrket i plader med 24 brønde og transficeret med negativ kontrol mimic (NC) eller MIR-26b efterligner (30 nM eller 60 nM; GenePharma) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Efter en anden transfektion med en MIR-26b reporterkonstruktion eller dens mutant (50 ng) blev SW480-celler inkuberet i 24 timer. Luciferase assays blev udført ved anvendelse af Dual-Light kombinerede Reporter Gene Assay System (Promega) og Promega Turner TD-20/20 luminometer.

Transwell assay

Cell migration blev udført ved transwell assay (BD Biosciences) ifølge producentens instruktioner. Kontrol miRNA eller efterligninger af MIR-26b transficerede celler blev høstet 24 timer efter transfektion. Derefter 3,0 × 10

5 transficerede celler eller ubehandlede celler i serum-frit medium blev tilsat til hver øvre insert pre-coatet med Matrigel matrix. Til den matchede nedre kammer, blev 500 pi 10% FBS medium tilsat. Efter inkubation blev ikke-invasive celler fjernet fra den øvre overflade af Transwell membran med en vatpind, og de invasive celler på den nedre membranoverfladen blev fikseret i methanol, farvet med 0,1% krystalviolet, fotograferet og talt.

Statistisk analyse

forsøgene blev gentaget 3 gange. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Til sammenligning af 2 grupper blev en to-halet, uparret t-test anvendt. En værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistiske tests blev udført ved hjælp af stat Software 12,0 (Stata Corp).

Resultater

Nampt-specifikke kemiske Inhibitor FK866 inhiberer NAD Syntese og Cell Survival

Øget Nampt udtryk er blevet rapporteret i primær kolorektal cancer [5], [6], [7]. FK866 er et Nampt-specifik kemisk inhibitor, som inhiberer NAD-genanvendelse biosyntesevejen ved binding på nicotinamid-bindingsstedet i Nampt derved nedbryder celler af NAD [23], [24]. Angiveligt, er FK866 veltolereret, og det hæmmer cellevækst i nogle typen tumorer [13], [15] betydeligt. Men effekten af ​​FK866 i kolorektal cancer ikke er dokumenteret,.

Vi har analyseret effekten af ​​FK866 på cellen overlevelsesraten for menneskelig colorectal cancer SW480 og LoVo celler ved CCK-8 assay og flowcytometri. Resultaterne viste, at FK866 fremmes signifikant apoptose af SW480 og LoVo-celler på en dosis-afhængig måde. IC

50 af FK866 var 14,3 nM for SW480-celler og 32,7 nM for LoVo celler, ifølge CCK-8 assay (figur 1A). Flowcytometri undersøgelser viste, at udsætte SW480 og LoVo celler til forskellige koncentration af FK866 i 3 dage steg procentdelen af ​​debuterende apoptotiske celler fra 3,37 ± 0,83% til 27,27 ± 1,49% (SW480) og 3,00 ± 0,37% til 21,53 ± 1,76% (LoVo) (figur 1B).

A. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af FK866 i 72 timer og derefter bedømt ved hjælp Cell Counting Kit-8. IC

50 værdier blev beregnet. Hvert assay blev gentaget mindst 3 gange. B. kvantificering af apoptotiske celler induceret af FK866 blev bekræftet ved flowcytometrisk analyse. De sub-G1 indhold blev betegnet apoptotiske celler. *: Versus negativ kontrolgruppe; **: Sammenlignet med 2 behandlingsgrupper. C. NAD-niveauer i kolorektal cancer celler blev målt efter eksponering for FK866. Hver lodret bjælke repræsenterer middelværdien ± SD af tredobbelte bestemmelser. Til sammenligning af 2 grupper blev en to-halet, uparret t-test anvendes.

Vi næste bestemmes effekten af ​​FK866 på NAD biosyntese i celler ved hjælp af NAD

+ /NADH Kvantificering Kit . FK866 eksponering i 3 dage faldt niveauet af NAD fra 5,33 ± 0,96 til 1,17 ± 0,31 nM /ug (SW480) og 6,63 ± 1,16 til 2,33 ± 0,85 nM /ug (LoVo) (figur 1C). Disse resultater antydede, at Nampt-medieret NAD-bjærgningen biosyntesen spiller en kritisk rolle i kolorektal cancer celle overlevelse og at FK866 har anti-kræftfremkaldende egenskaber i kolorektal kræftceller.

MIR-26b Hæmmer Angivelse af Nampt via Binding til 3′-UTR

Ved computerbaseret sekvensanalyse hjælp TargetScans afsløring software (https://www.targetscan.org/), blev Nampt forudsagt til at være et potentielt mål for miR-26b. Frøene sekvens af modent MIR-26b blev konserveret blandt humant, chimpanse, rhesus, og bush baby-arter, blandt andre. Derfor blev MIR-26b udvalgt til yderligere biologisk karakterisering.

Af MIR-26b efterligner, overekspression af MIR-26b undertrykt Nampt mRNA (figur 2A til venstre) og protein (figur 2B) niveauer i SW480-celler, som påvist ved RT-PCR og Western blot-analyse, hhv. I mellemtiden MIR-26b efterligner også undertrykt ekspressionsniveauet af NAD +, som blev målt ved NAD

+ /NADH Kvantificering Kit (figur 2D til venstre). På den anden side, transfektion med MIR-26b inhibitor forøget Nampt mRNA (figur 2A til højre) og protein (figur 2C) niveauer, og MIR-26b inhibitor også øget ekspressionsniveauet af NAD + (figur 2D til højre).

A. Kvantitativ real-time PCR af Nampt i SW480 cellelinier efter transfektion med forskellige koncentrationer af MIR-26b efterligner eller inhibitorer. B og C. Western blotting af Nampt i SW480 cellelinier efter transfektion med forskellige koncentrationer af MIR-26b efterligner eller inhibitorer. D. De relative niveauer af NAD i SW480-cellelinier efter transfektion med forskellige koncentrationer af MIR-26b efterligner eller inhibitorer. E. Luciferase reporter analyser validering af direkte interaktion af miR-26b med 3′-UTR af Nampt. Nampt-3′-UTR-pEZX (eller Nampt-3′-UTR-mut-pEZX) blev cotransficeret med MIR-26b efterligner eller negativ kontrol i SW480-celler. *: Versus negativ kontrolgruppe; **: Sammenlignet med 2 behandlingsgrupper. Hver lodret bjælke repræsenterer middelværdien ± SD af tredobbelte bestemmelser. Til sammenligning af 2 grupper blev en to-halet, uparret t-test anvendes.

For at bekræfte, at Nampt er målet for miR-26b, effekten af ​​transfektion med miR-26b efterligner på reporter aktivitet bred type og muteret pEZX-Nampt blev undersøgt. pEZX-Nampt er en dual-luciferase-reporterkonstruktion der indeholder en bred type eller muteret segment af Nampt 3′-UTR med MIR-26b genkendelsessekvens umiddelbart nedstrøms for ildflue-luciferase reporter (Fig S1A). Et diagram over Nampt med vildtype eller muterede sekvenser i den potentielle MIR-26b bindingssted er vist i figur S1B. Sekvensen kort over vildtype og muterede Nampt opnået ved gen-sekventering er vist i figur S1c. Som vist i figur 2E, transfektion med forskellige koncentrationer af MIR-26b efterligner nedsatte ildflueluciferase reporter aktivitet af vildtype pEZX-Nampt med ca. 51,7% ± 3,2% og 64,3% ± 4,0% hhv. Induktionen af ​​reporter-aktivitet ved overekspression af MIR-26b af MIR-26b efterligner blev imidlertid ikke påvist, når MIR-26b genkendelsessekvensen i 3′-UTR af Nampt mRNA blev muteret (Figur 2E). Derfor er resultaterne fra figur 2 bekræfter, at Nampt er et mål for miR-26b.

ekspressionsniveauerne af miR-26b og Nampt i kolorektal cancer væv og cellelinier

De basale ekspressionsniveauerne af mIR-26b og Nampt mRNA blev målt ved QRT-PCR i kolorektale cancercellelinjer (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, og HCT116), og de basale ekspressionsniveauer af NAD + også blev målt ved NAD

+ /NADH Kvantificering Kit i cellelinier. SW480-celler havde den laveste Nampt ekspression og NAD + niveau, og den højeste MIR-26b niveau, efterfulgt af HT-29, HCT116, LoVo og SW116-celler (figur 3A venstre). En signifikant omvendt korrelation mellem ekspressionen af ​​miR-26b og Nampt mRNA blev observeret, og en signifikant positiv sammenhæng mellem NAD + og Nampt mRNA blev også observeret (figur 3A til højre).

A. MIR-26b, Nampt mRNA og NAD + niveauer blev analyseret i kolorektale cancercellelinjer. Udtrykket af miR-26b blev omvendt korreleret med Nampt udtryk i kolorektale cancer cellelinjer; udtryk for NAD + var positiv korreleret med Nampt udtryk i kolorektale cancer cellelinjer (A til højre). B. MIR-26b og Nampt mRNA niveauer blev analyseret i 18 kirurgiske prøver af humane tyk- og endetarmskræft væv og tilstødende normale kolorektal væv. Markant opreguleres Nampt niveauer i kolorektal cancer væv er vist i forhold til Nampt niveauer i tilstødende normale kolorektale væv (fold ændringer 6); signifikant nedreguleret miR-26b niveauer i kolorektal cancer væv er vist i forhold til miR-26b niveauer i tilstødende normale kolorektale væv (fold ændringer 2). C. udtryk for miR-26b blev omvendt korreleret med Nampt udtryk i kolorektale cancer væv (C til venstre), og tilstødende normale kolorektale væv (C til højre). Nampt mRNA niveauer blev analyseret ved real-time RT-PCR og normaliseret til GAPDH. MIR-26b niveauer blev analyseret af real-time RT-PCR og normaliseret til U6. Hver lodret bjælke repræsenterer middelværdien ± SD af tredobbelte bestemmelser. Til sammenligning af 2 grupper blev en to-halet, uparret t-test anvendes.

Derudover har vi udvidet vores undersøgelse til prøver fra patienter med tarmkræft. Vores resultater viste, at Nampt udtryk blev øget betydeligt i kræft væv (6,3 gange) sammenlignet med den i de parrede tilstødende normale væv i panelet af 18 patienter kolorektal cancer (figur 3B til højre), som var i overensstemmelse med andres fund [5 ], [6], [7]. Desuden fandt vi kræft væv viste en bemærkelsesværdig tab af miR-26b (~45.45%) i forhold til de tilstødende normale kolorektal cancer væv i panel af 18 patienter kolorektal cancer (figur 3B venstre), som ikke er blevet indberettet før . Vi observerede en omvendt korrelation mellem miR-26b og Nampt udtryk i kræft væv (figur 3C venstre) og tilstødende normale væv (Figur 3C højre).

MIR-26b Hæmmer Cell Overlevelse og Invasion, og dette kan være delvist ophævet ved tilsætning af NAD

Nampt er kendt for at regulere en række biologiske aktiviteter, herunder celleoverlevelse og invasion. Da MIR-26b menes at målrette Nampt, virkningen af ​​MIR-26b på celleoverlevelse og invasion blev undersøgt. Desuden samarbejder vi transfekterede celler med miR-26b efterligner, derefter 1,0 mM /L NAD + (maksimalt effektive) blev sat til at afgøre, om virkningerne af miR-26b er medieret af Nampt-medieret NAD biosyntese.

Brug den CKK-8-assayet, celler behandlet med mIR-26b inhibitor havde den højeste celleproliferation, efterfulgt af celler behandlet med negativ kontrol mIR-26b efterligner plus NAD og mIR-26b efterligner alene (figur 4A). En stigning i cellevækst 21,1% blev observeret i LoVo celler 4 dage efter transfektion med MIR-26b-inhibitor, i forhold til væksten i den negative kontrol. Imidlertid transfektion med MIR-26b efterligner undertrykte væksten af ​​LoVo-celler med 31,48% i forhold til den negative kontrol. Transfektion med MIR-26b efterligner plus NAD øget vækst af LoVo-celler med 26.85% sammenlignet med gruppen transficeret med kun MIR-26b efterligner.

A. LoVo celler blev behandlet med MIR-26b efterligner et al., Og cellelevedygtigheden blev bestemt ved anvendelse Cell Counting Kit-8. B. kvantificering af apoptotiske celler induceret af MIR-26b efterligner (med og uden NAD) eller MIR-26b-inhibitor blev bekræftet ved flowcytometrisk analyse. De sub-G1 indhold blev betegnet apoptotiske celler. C. Repræsentative mikrografier af celle invasion assays (til venstre) og kvantificering (til højre) fra forskellige behandlinger (* p 0,01). De farvede invasive celler blev fotograferet under et inverteret lysmikroskop (100 x forstørrelse). *: Versus negativ kontrolgruppe; **: Sammenlignet med 2 behandlingsgrupper. Hver lodret bjælke repræsenterer middelværdien ± SD af tredobbelte bestemmelser. Til sammenligning af 2 grupper blev en to-halet, uparret t-test anvendt.

flowcytometriassayet Resultaterne er vist i figur 4B. Udsættes LoVo celler til miR-26b-hæmmere i 4 dage faldt betydeligt procentdelen af ​​debuterende apoptotiske celler (3,03 ± 0,72% i forhold til 7,33 ± 0,60% i den negative kontrolgruppe). Transfektion med miR-26b efterligner og NAD bemærkelsesværdigt faldt den tidlige apoptotisk sats (12,23 ± 0,35% i forhold til 24,2 ± 0,79% i gruppen kun transfekteret med miR-26b efterligner).

Af interesse, miR- 26b suppression påvirket ikke kun celleoverlevelse men også invasion (figur 4C). Transfektion med MIR-26b-inhibitor forøges bemærkelsesværdigt invasionen effektiviteten af ​​LoVo-celler (1,7 gange) ifølge Transwell assay. Transfektion med MIR-26b efterligner faldt imidlertid invasionen effektiviteten af ​​LoVo-celler til 34.53%, og dette blev delvist reddet ved tilsætning af NAD (øget til 66,10%). Resultater fra figur 4 indikerer derfor, at MIR-26b inhiberede celleoverlevelse og invasion i LoVo celler. Tilføjelsen af ​​NAD delvist ophævet denne effekt.

Diskussion

Undersøgelser har vist, at Nampt øges betydeligt i primær kolorektal cancer [5], [6], [7] og andre kræftformer [8 ], [9], [10], [11]. Således kan Nampt være en god biomarkør for malignt potentiale og fase progression [1], [8], [25], [26]. Nampt-medieret NAD-biosyntese spiller en kritisk rolle i celle metabolisme, overlevelsesfunktioner, og stress modstand gennem sirtuins og andre NAD-forbrugende regulatorer [1]. Den Nampt-specifikke kemiske inhibitor FK866 udtømmer celler af intracellulært NAD ved binding på nicotinamid-bindende site af Nampt og inhibere NAD salvage pathway [23], [24]. I kræftceller, FK866 viser anti-tumor [27], anti-metastatisk [15], og anti-angiogene aktiviteter [28] og en kemo-sensibiliserende effekt [27]. I modsætning hertil viste nogle undersøgelser ikke-tumorigene celler var upåvirkede af FK866 [29], [30]. Disse kan forklares ved det forhold, at cancerceller kræver højere NAD + niveauer for at rumme med høj metabolisk hastighed end normale celler. Der er derfor en forskel i dosis-respons mellem maligne og normale celler som for niveauerne af det cellulære NAD + indhold. Derfor er FK866 veltolereret, og det hæmmer tumorvækst signifikant in vitro og in vivo. Disse resultater understøttes af mange undersøgelser [12], [13], [14], [15]. I denne undersøgelse, vi først viste, at FK866 signifikant hæmmede celle overlevelse og reducerede NAD-niveauer i SW480 og LoVo celler, som tyder på, at den Nampt-medierede NAD biosyntetiske mekanisme er aktiv i kolorektale cancerceller. Interessant, der var lidt korrelation mellem faldet i NAD + og stigningen i apoptose ved hjælp FK866 ifølge vores resultater (r = -0,8544,

s

= 0.3479). Der kan være to forskellige gisninger som for resultatet. For det første kan der være en tærskeleffekt på grund af den høje koncentration af FK866. For det andet Thakur, rapporterede B. K. FK866 er i stand til at inducere apoptose i leukæmiceller ved indirekte at aktivere tumor-suppressor protein p53 [13], og denne vej kan også arbejde i kolorektale cancerceller. Selvom der var lidt korrelation mellem NAD + og apoptose ifølge vores resultater, ville det ikke påvirke det faktum, at FK866 kan være et lovende middel til tarmkræft. Og de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for den høje ekspression af Nampt i colorektal cancer er ikke fuldt forstået.

For nylig blev det rapporteret, at uhensigtsmæssig ekspression af miRNA bidrager til patogenesen af ​​cancer. Nedsatte niveauer af miR-26b er observeret i en bred vifte af tumorer [17], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]. I vores undersøgelser viste vi, at ekspressionen af ​​miR-26b var signifikant nedreguleret i 18 ondartede prøver af patienter med tarmkræft. I kolorektal kræftpatienter, miR-26b var 2,2 gange højere i tilstødende normale væv end i ondartede væv (p 0,0001). Vi oprindeligt identificeret Nampt som et mål for miR-26b af bioinformatik analyser, luciferase reporter analyser, og faktion assay ved transfektion af miR-26 efterligner eller inhibitorer. Overekspression af MIR-26b ved transfektion af MIR-26 efterligner faldt betydeligt Nampt mRNA og protein niveauer in vitro. Vores undersøgelse viste, at MIR-26b efterligner er mere effektive i apoptose end i proliferationsassays. Resultaterne er i overensstemmelse med andre undersøgelser, at hæmning af Nampt forårsagede generel cytotoksicitet [13]. Knockdown af MIR-26b ved transfektion af MIR-26b inhibitorer signifikant forøget Nampt mRNA og protein niveauer. Dette indikerer, at miR-26b regulerer Nampt primært gennem translationel undertrykkelse. I mellemtiden, i vores resultater de regulatoriske veje for miR-26b blev forbundet med invasionsevne og metastaser i kolorektal cancer celler. Ma et al. viste, at overekspression af MIR-26b inhiberes in vivo tumorvækst i mus injiceret med LoVo-celler [38]. Endvidere fandt vi, at inhibering af celle overlevelse og invasion ved overekspression af MIR-26b delvis kunne reddes ved tilsætning af NAD. Dette resultat indikerer, MIR-26b inhibering af tumorcelleoverlevelse og invasion involverer Nampt-medieret NAD-biosyntese. Derfor vores resultater giver indsigt i funktionen af ​​miR-26b i reguleringen kolorektal tumorigenese. Derudover, eftersom Nampt funktioner i metabolisme og immunresponser, kan MIR-26b også påvirke disse processer ved at dæmpe translation af Nampt. Dette tyder på en mekanistisk forklaring på nedregulering af MIR-26b i diabetiske mus [39].

Men den mekanisme, hvormed MIR-26b og Nampt regulere tumorigenese kan ikke være så simpelt. Når koncentrationen af ​​NAD + var maksimalt effektive, blev redningen ikke fuldt tilbagebetalt. Den alternative vej kan være mulige involvering. Først nyere undersøgelser viser, at MIR-26b har mange andre direkte mål, såsom EphA2 [40], SLC7A11 [32], Lef-1 [41], pRb-proteinet [42], og COX-2 [36]. For det andet, kan andre end miR-26b miRNA målrette Nampt udtryk. For eksempel MIR-182 nedreguleret Nampt ekspression i Tat-induceret HIV-1 lang terminal repeat (LTR) transaktivering [43]. For det tredje, selv om det rapporteret, at reguleringen af ​​glukose stimuleret insulinsekretion og mTORC1 og ERK1 /2 signal pathway er involveret i Nampt-media NAD bjærgning syntese [12], [44], andre signalveje, der omfatter Nampt, såsom PI3K /Akt [45] og STAT3 [46], [47], deltager også i tumordannelse, transformation, og angiogenese. Tilsammen den MIR-26b-Nampt-NAD signalvej bidrager til kolorektal cancer celleoverlevelse og invasion, men det er ikke den eneste vej.

Konklusion

Sammenfattende vores nuværende undersøgelse tyder at mIR-26b regulerer negativt Nampt ekspression på posttranskriptionel plan ved binding til dets 3′-UTR. Derudover MIR-26b inhiberede tumorvækst og invasion, og denne virkning blev delvis ophævet ved tilsætning af NAD. Vi fandt også, at niveauerne af MIR-26b i patientens colorektale tumorvæv var meget lavere end i det tilstødende normale væv, og at MIR-26b ekspression omvendt korreleret med ekspressionen af ​​Nampt mRNA i 5 kolorektale cancercellelinjer og patientprøver. Disse resultater viser, at vores resultater er klinisk relevant: miR-26b overekspression og hæmning af Nampt-NAD-signalvejen kan være en begrundelse for terapeutiske indgreb i kolorektal cancer i fremtiden

Støtte oplysninger

figur S1. .

Luciferase reporter analyser validering interaktionen mellem miR-26b og Nampt. A. Konstruktion af pEZX-MT01 luciferase reporter (Luc-Nampt 3′-UTR). hLuc, ildflueluciferasereportergen; hRLuc, Renilla luciferase reportergen. Ildflue luciferase ekspression reguleres ved binding af miRNA til 3′-UTR målsekvensen. Ildflueluciferase aktivitet blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. B. Diagram over Nampt med vildtype og muterede sekvenser i den potentielle MIR-26b bindingssted. C. Sekvens kort over vildtype og muterede Nampt sekvenser oprettet ved gen-sekventering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0069963.s001

(TIF)