PLoS ONE: IL-6 Hæmmer Målrettet Modulation af PDCD4 af miR-21 i prostatakræft

Abstrakt

Prostatakræft er den hyppigste kræftform blandt mænd i De Forenede Stater. Den cytokin IL-6 aktiverer flere prostatakræft veje, men dens upstream trans-signalvejen stadig dårligt forstået. I denne undersøgelse evalueres vi rollen af ​​IL-6 i PDCD4 genekspression og hvordan microRNA MIR-21 regulerer denne proces i prostatakræft-cellelinier PC-3 og LNCaP. Ekspressionsmønsteret for PDCD4 fra prøver fra human prostatacancer, forstadier til kræft, og godartet prostatahypertrofi blev undersøgt ved immunohistokemi. PDCD4 transkription og translation blev påvist ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) og Western blot-analyse, hhv. Den målrettede modulering af PDCD4 af MIR-21 blev analyseret i PC-3 og LNCaP-celler, og virkningen af ​​IL-6 på ekspressionen af ​​PDCD4 blev undersøgt in vitro. PDCD4 ekspression i prøver fra de 3 vævstyper progressivt, og ekspressionsniveauerne af PDCD4 og prostataspecifikt antigen var negativt korreleret. Niveauerne af PDCD4 mRNA og protein i PC-3 og LNCaP-celler transficeret med anti-MIR-21-konstruktionerne var lavere end i kontrolceller. Ekspressionen af ​​PDCD4 blev inhiberet af IL-6, men denne virkning var svækket i cellelinier med lav ekspression af MIR-21. Vores undersøgelse viser, at reguleringen af ​​PDCD4 af miR-21 er målrettet og IL-6 hæmmer ekspressionen af ​​PDCD4 genet i PC-3 og LNCaP celler gennem målrettet funktion af miR-21 på PDCD4. Disse resultater understøtter muligheden for den fremtidige indsats for diagnose og genterapi for prostatakræft, der er baseret på IL-6, miR-21, og PDCD4

Henvisning:. Dong B, Shi Z, Wang J, Wu J Yang Z, Fang K (2015) IL-6 Hæmmer Målrettet Modulation af PDCD4 af miR-21 i prostatakræft. PLoS ONE 10 (8): e0134366. doi: 10,1371 /journal.pone.0134366

Redaktør: Craig N. Robson, Northern Institute for Cancer Research, Storbritannien

Modtaget: Februar 19, 2015; Accepteret: 8 Juli 2015; Udgivet: 7 August, 2015

Copyright: © 2015 Dong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:. forfatterne har modtaget specifikke midler til dette arbejde fra Heath Department of Yunnan-provinsen (Grant No.2010NS053). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er den mest almindelige cancer og den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald blandt mænd i USA. I Kina er forekomsten af ​​prostatacancer stiger hvert år. Interleukin-6 (IL-6) er en pleiotropisk cytokin, som stimulerer proliferation og modulerer vigtige cellulære begivenheder i prostatacancer [1]. Ekspressionen af ​​IL-6 er forhøjet i fremskreden prostatacancer [2] og korrelerer med Gleason kvalitet af prostatacancer [3] og prostatakræft progression [4]. IL-6 er en væsentlig aktivator af Janus kinase /signal transducer og aktivator af transkription 3 pathway i prostatacancer [5]. IL-6 kan også aktivere mitogenaktiveret proteinkinase pathway [6]. Imidlertid forbliver IL-6 opstrøms trans-signalvejen i prostatacancer dårligt forstået.

Programmeret celledød 4 (PDCD4) er en undertrykker af tumorigenese, tumor progression, og invasion, der fungerer med eller uden initiator udfordring. PDCD4 var den første suppressor fundet at målrette oversættelse [7]. PDCD4 interagerer med translationsinitiering faktorer eIF4A og eIF4G at inhibere translation i et mRNA-specifik måde, hvilket fører til inhibering af pro-onkogene faktorer [8]. Den overekspression af PDCD4 hæmmer tumorigenese og tumor progression i en transgen musemodel og hæmmer tumor celle invasion in vitro.

MikroRNA’er (Mirs) er små ikke-kodende RNA, der er post-transkriptionelle regulatorer af genekspression og vigtige regulatorer af flere fysiologiske og patologiske processer. Mirs også påvirke proteinproduktion [9] og spiller en central rolle i de forskellige typer af humane tumorer [10]. MIR-21 ekspression er højere i nogle faste tumorer [11-13], herunder prostatatumorer, end i normale væv [14]. Endvidere MIR-21 er et onkogen med antiapoptotisk funktion [15]. MIR-21 inhiberer apoptose i androgen-negative og androgen-uafhængige metastatisk prostatacancer-cellelinier PC-3 og DU-145 og kan regulere motilitet og invasion i disse cellelinier [16].

I denne undersøgelse vi stilling til, om IL-6 regulerer ekspressionen af ​​PDCD4 genet og defineret rolle miR-21 i denne proces i prostatakræft-cellelinier LNCaP og PC-3.

Materialer og metoder

Reagenser

PC-3 og LNCaP cellelinjer blev opnået fra Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences. Rekombinant human IL-6 blev købt fra R HyClone 0,25% trypsinase fra GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ); og DMSO fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anti-MIR-21 inhibitor og anti-MIR-21 negativ kontrol blev erhvervet fra ABI Biotech (USA). Lipofectamine 2000 blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Den RNAiso Plus kit til RNA isolering, blev PrimeScript RT reagens kit til cDNA revers transkription, og Perfect Real Time kit til kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) købt fra Takara Bio (Mountain View, CA) sammen med DL1000 DNA markør . Primere til

PDCD4

og

GAPDH

blev opnået fra Sangon (Kina). Humant anti-PDCD4 monoklonalt antistof og kanin polyklonalt anti-β-actin-antistof blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, MA). Anti-kanin IgG, blev HRP-bundet antistof købt hos Cell Signaling Technology (Danvers, MA). BCA proteinassaykit og RIPA lysat-buffer blev erhvervet fra Beyotime Institute of Biotechnology (Kina). In situ hybridisering kits til HSP og DAB blev købt fra LBP Biotech Company (Kina).

Patientprøver

Tyve prøver hver af prostatakræft, forstadier til kræft, og benign prostatahyperplasi vævsprøver fra patienter med prostata atypisk adenomatøs hyperplasi, prostata intraepithelial neoplasi eller benign prostatahyperplasi henholdsvis blev leveret af Patologisk Institut, Anden Affiliated Hospital i Kunming Medical University, Yunnan, Kina, fra januar 2010 til oktober 2011. Alle prøver blev fikseret i formalin, paraffin-indlejret, og skåret.

Cellekultur

LNCaP og PC-3-celler blev dyrket i 25-ml plader i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin ( 100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) i en 37 ° C, 5% CO

2 incubator. Dyrkningsmediet blev skiftet hver anden dag.

Kvantitativ realtids-PCR

PDCD4 ekspression blev bestemt ved QRT-PCR-analyse. Celler (5 x 10

5) blev podet i hver brønd i 6-brønds plader, dyrket i 24 timer, og inkuberet med IL-6 (0, 5 eller 10 ng /ml) i 24 timer. RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNAiso Plus RNA-ekstraktion kit i henhold til producentens anvisninger. RNA kvalitet blev målt ved anvendelse af PrimeScript RT reagenskittet ifølge producentens instruktioner, før RNA blev revers-transkriberet til cDNA. Følgende PDCD4 primere blev anvendt: opstrøms primer 5′-CCTGAATTAGCACTGGATACTCCT-3 ‘og nedstrøms primer 5′-CTAGCCTGCACACAATCTACAGTT-3’. Følgende GAPDH primere blev anvendt: forward primer 5′-TCACTTTGTCACAGCCCAAG-3 ‘og revers primer 5′-AGCAAGCAAGCAGAATTTGG-3’. Revers transkription blev udført ved 37 ° C i 15 minutter (revers transkriptionsreaktion), efterfulgt af 85 ° C i 5 s (revers transkriptase inaktivering reaktion), i henhold til producentens anvisninger. Amplifikation blev udført under følgende betingelser: 2 cyklusser ved 95 ° C i 30 s hver, efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s

Western blot-analyse

Celler (5 x 10

5) blev podet i hver brønd i 6-brønds plader, dyrket i 24 timer, og inkuberet med IL-6 (0, 5 eller 10 ng /ml) i 24 timer . Totalt protein blev ekstraheret under anvendelse af RIPA lysebuffer, og proteinkoncentrationen blev målt ved BCA-assay. Proteinerne blev separeret efter størrelse ved elektroforese, overført til film, og inkuberet med de følgende antistoffer: PDCD4 antistof, 1: 5000; p-actin antistof, 1: 8000; og sekundært antistof, 1: 5000. ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare Life Sciences) blev anvendt til at afbilde de geler.

Cell transfektion og IL-6 behandling

Celler (5 x 10

5) blev podet i hver brønd i 6-brønds plader og dyrket i 24 timer for at sikre, at integrationen af ​​transficerede celler var mindst 60%. Mediet blev skiftet en gang før en 4-h transfektion i et antibiotikum-frit medium med Lipofectamine 2000 i henhold til producentens anvisninger. Slutkoncentrationen af ​​anti-MIR-21 inhibitor og negative kontrol var 30 nM. Transfektionsblandingen blev inkuberet ved stuetemperatur i 20 minutter og derefter placeret i et 37 ° C, 5% CO

2 inkubator i 30 min. Mediet blev erstattet med frisk, antibiotika-fri RPMI 1640 efter 6 timer. Celler blev inkuberet med eller uden IL-6 (10 ng /ml) i 24 timer, inden de blev høstet og anvendt til QRT-PCR og Western blot-analyser til påvisning PDCD4 ekspression.

Immunohistokemisk analyse

den prostatacancer, forstadier til kræft, og benign prostatahyperplasi vævsprøver blev snittet i 2-mm-tykke skiver og fikseret i 10% formalin i op til 24 timer. Skiver blev derefter afparaffiniseret, antigen blev hentet fra dem, og de blev inkuberet i hydrogenperoxid i 15 min. Primært antistof (50 pi; koncentration 1: 500) blev tilsat til hver skive og inkuberet ved 4 ° C natten over. HRP Polymer (HRP sekundært antistof) blev sat til vaskede objektglas, og objektglassene blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 min. Derefter blev 1 ml DAB Plus Substrat tilsættes dråbevis til hvert objektglas sammen med 2 dråber DAB Plus Kromogen og inkuberet i 10 min. Slides blev vasket, kontrastfarvet, og dehydreret, før du tilføjer det transparente montering medium og dækglas. Alle skiver blev vurderet separat af 2 patologer og gradueres som -, +, ++ eller +++, afhængig af dybden af ​​PDCD4 farvning i cytoplasmaet og kernen. Vi identificerede også de basale celler med P63 farvning.

statistiske analyser

Data blev analyseret af SPSS17.0 statistisk software. Chi-squared test blev anvendt til at estimere forskelle mellem udtrykkene for PDCD4 og PSA. Shapiro-Wilk testen blev anvendt til at undersøge normaliteten af ​​data fra immunhistokemisk analyse, og envejs ANOVA blev anvendt til at sammenligne forskellen mellem interventionsgruppen. Den Fishers mindste signifikante forskel (LSD) test blev anvendt til at teste forskelle mellem 2 grupper.

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for Anden Affiliated Hospital i Kunming Medical University og gennemføres i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. Behovet for at indhente skriftligt informeret samtykke blev givet afkald af den institutionelle gennemgang bestyrelsen, fordi det var en retrospektiv undersøgelse. Patienternes optegnelser blev anonymiseret inden analyse.

Resultater

PDCD4 udtryk i prostata vævstyper

PDCD4 protein blev hovedsageligt udtrykt i cytoplasmaet, men det blev også givet udtryk i mindre udstrækning i kernen af ​​prøver af præcancerøse prostata og prostatahyperplasi. Der var en markant forskel i PDCD4 udtryk mønster blandt eksemplarer af prostatakræft, prostata intraepitelialneoplasi, og prostatahyperplasi (Fig 1). I dårligt differentieret carcinom, PDCD4 ekspression var lav eller fraværende. PSA-ekspression var højere i prøver af prostatacancer end dem fra benign prostatahyperplasi (figur 1). Resultater fra PSA og PDCD4 farvning i forskellige typer prostatavæv afslørede, at mindre differentieret prostata cancer, jo lavere niveauet af PDCD4 ekspression og jo højere niveau af PSA-ekspression. Resultaterne af P63 farvning viste, at basale celler var rigelige i BPH, knappe i PIN-kode og fraværende i PCa væv (figur 1).

I prostatakræft, er betydelig mængde normal kirtel mangler. Kræft reder er dannet med uregelmæssige cribriform kirtler og kræft infiltrerer muskelvæv og celle cytoplasma. Dette farvningsmønster blev gradueret PDCD4 (+), PSA (+++). I prostata intraepitelialneoplasi blev farvningsmønster gradueret PDCD4 (++), PSA (++). I prostatahyperplasi /glandulær hyperplasi blev mønstret kernefarvning gradueret PDCD4 (+++), PSA (+/-). Udtrykket af PDCD4 og PSA var forskellige (

x

2 = 8,632,

P

0,05) blandt de 3 vævstyper. I Spearman rank test, blev ekspressionsniveauerne af PDCD4 og PSA blandt de 3 prostata vævstyper negativt korreleret (-1

r

0).

Virkning af mIR-21-inhibering på PDCD4 ekspression

An mIR-21-reguleret locus på 3’UTR af PDCD4 er blevet rapporteret i HeLa cervikale carcinomceller [17]. For at bestemme om MIR-21 regulerer også PDCD4 ekspression i prostatacancer, PC-3 og LNCaP-cellelinjer blev transficeret med MIR-21 inhibitoren at reducere mængden af ​​endogent MIR-21 før måling PDCD4 mRNA og protein ekspression ved real-time PCR og immunoblotting henholdsvis. Niveauet af PDCD4 mRNA-ekspression var højere i den transficerede end i nogen af ​​de kontrolgrupper, med udtrykket i LNCaP celler er højere end i PC-3 celler (Fig 2a) (

F

= 20,562,

P

0,001). PDCD4 proteinekspression steg efter LNCaP og PC-3-celler blev transficeret med miR-21 inhibitor (figur 2b) (PC-3 celler:

Z

= -3,920,

P

0,001 ; LNCaP celler:.

Z

= 3,883,

P

0,001), hvilket tyder på, at PDCD4 reguleres af miR-21 i disse prostatakræft-cellelinier

qRT- PCR-resultater viste en forhøjelse af PDCD4 mRNA-ekspression af PC-3 og LNCaP-celler transficeret med mIR-21 inhibitor, hvilket indikerer, at PDCD4 mRNA differentielt blev udtrykt mellem de to grupper. Blandt de MIR-21-inhiberede celler, PDCD4 mRNA-ekspression i LNCaP-celler var signifikant højere end i PC-3-celler. PDCD4 mRNA ekspression af LNCaP og PC-3-celler blev nedreguleret efter en 24-h behandling med forskellige koncentrationer af IL-6. (B) Western blot-analyse, der viser en stigning i niveauet af ekspression af PDCD4 proteinet i PC-3 og LNCaP-celler transficeret med MIR-21 inhibitor. Ikke-transficerede og negativ-kontrolceller blev rangordnet 1 til 6 i rank test af parrede prøver. Niveauer af PDCD4 protein ekspression af LNCaP og PC-3-celler blev nedreguleret efter en 24-h behandling med forskellige koncentrationer af IL-6.

PDCD4 ekspression efter IL-6 behandling

resultater fra QRT-PCR-analyse afslørede et signifikant fald i transkriptionen af ​​PDCD4 i PC-3 og LNCaP-celler efter forbehandling med IL-6 (5 eller 10 ng /ml; fig 3a). Resultater fra Western blot-analyse afslørede et signifikant fald i oversættelsen af ​​PDCD4 efter forbehandling med IL-6 (5 eller 10 ng /ml, Fig 3b). Derudover var der en negativ korrelation mellem koncentrationen af ​​IL-6 og niveauet for nedregulering af PDCD4 ekspression. PDCD4 udtryk faldt mere i PC-3 celler end i LNCaP celler. PC-3 og LNCaP-celler blev stabilt transficeret med MIR-21 inhibitoren og derefter behandlet med IL-6 (10 ng /mL) for at bestemme den rolle, MIR-21 i reguleringen af ​​PDCD4 ekspression ved IL-6. I begge PC-3 og LNCaP-celler, niveauet af PDCD4 mRNA og proteinekspression i de transficerede grupper var højere end i nogen af ​​kontrolgrupperne eller negativ-kontrol-grupper (Fig 4). Som tidligere nævnt, PDCD4 var målet for miR-21 regulering, og IL-6 hæmmede PDCD4 udtryk gennem miR-21.

Niveauer af PDCD4 mRNA-ekspression i LNCaP og PC-3-celler blev nedreguleret efter en 24- h behandling med IL-6 på 0, 5 eller 10 ng /mL. Forskellen var statistisk signifikans (a) mellem hinanden. Den samme forskel blev også observeret i niveauerne af PDCD4 proteinekspression (b). (A) PDCD4 mRNA ekspression af LNCaP og PC-3-celler blev nedreguleret efter en 24-h behandling med IL-6 ved 10 ng /mL. (B) PDCD4 protein ekspression af LNCaP og PC-3-celler blev nedreguleret efter en 24-h behandling med IL-6 ved 10 ng /ml,

PDCD4 proteinekspression var signifikant højere i prostatacancerceller transficeret med miR-21-inhibitor før Il-6 behandling end i celler ikke transficeret med den hæmmer (envejs ANOVA test:

F Drømmeholdet værdi = 241,781,

P

0,05) . Niveauer af PDCD4 proteinekspression i transficerede og ikke-transficerede celler i begge cellelinier var signifikant forskellige (LSD test:

P

0,05).

Diskussion

I denne undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af ​​PDCD4 protein faldt med et fald i omfanget af differentiering af prostatavæv. Denne iagttagelse antyder, at omfanget af malignitet i prostata cancer væv er relateret til PDCD4 ekspression. Et lignende mønster ses i kræft i fordøjelsessystemet [18], levercancer [19], ductal carcinoma af brystet [20], og nasopharyngeal kræft [21]. Eftersom ekspressionsniveauerne af PDCD4 afviger med sygdommens omfang i prostatavæv, kan PDCD4 være en lovende tumormarkør for både diagnose og behandling af prostatacancer (figur 1). Vi fandt også, at PDCD4 blev udtrykt både i luminale celler og basale celler i BPH, men i PIN og PCA væv hovedsageligt udtrykt i luminale celler (Fig 1), og udtrykkene for PDCD4 og PSA blev negativt korreleret i prostata væv, hvilket tyder på, at den diagnosticering af prostatacancer kan lettes ved at kombinere påvisningen af ​​de 2 faktorer.

Vores undersøgelse viste også, at PDCD4 er et mål på mIR-21 regulering i prostatacancerceller. MIR-21 er kendt for at være overudtrykt i mange typer af faste tumorer. Modent MIR-21 kan reducere PDCD4 ekspression ved at inducere TGF-β-vejen, som er en regulator af PDCD4 [22]. Desuden har en konserveret protein locus blevet identificeret i PDCD4 sekvensen, hvorigennem MIR-21 regulerer PDCD4 ekspression at inducere tumorinvasion og metastase [23]. I overensstemmelse med tidligere resultater [24,25], vores undersøgelse understøtter, at miR-21 og PDCD4 har en negativ korrelation, med miR-21 reducerer PDCD4 udtryk og inducere tumor celle invasion og fjernmetastaser.

For at bestemme om miR -21 og PDCD4 udtryk var forskellige i androgen-afhængige og androgen-uafhængige prostatacancer, udførte vi vores studier i androgen-uafhængige prostatacancer-cellelinie PC-3 og den androgen-afhængige prostatacancer LNCaP. I begge cellelinier, PDCD4 var et mål på MIR-21 på det transskriptionelle og translationelle niveau. Imidlertid er virkningsmekanismen for MIR-21 i regulering PDCD4 var forskellig i de androgenafhængige og androgen-uafhængige celler, med MIR-21-inhibering påvirker PDCD4 ekspression i et større omfang i PC-3-celler end i LNCaP-celler. Således er vores resultater tyder på, at PDCD4 genet er målet for miR-21 regulering i prostatakræft.

cirkulerende niveauer af IL-6 i solide tumorer kan være af prognostisk betydning for patienter med metastatisk og hormon-refraktær prostata cancer [26]. IL-6 promoverer proliferationen af ​​prostatacancerceller ved at aktivere androgenreceptoren (AR), og denne virkning inhiberes af antiandrogener såsom bicalutamid [27]. Desuden kan MIR-21 regulerer AR ekspression under udviklingen af ​​prostatacancer [28]. Vores undersøgelser viser, at MIR-21 fremmer væksten af ​​prostatacancerceller ved nedregulering af ekspressionen af ​​PDCD4. Derfor kan AR være det fælles mål for IL-6 og miR-21 i prostatakræft, med miR-21 spiller en formidlende rolle i aktivering IL-6 til at regulere PDCD4 udtryk. Også, IL-6 påvirker PDCD4 udtryk gennem hele udviklingen af ​​prostatakræft i både androgen-afhængige prostatakræft og androgen-uafhængig prostatacancer.

Konklusioner

Denne undersøgelse giver eksperimentelle data til at køre den fremtidige indsats i prostatakræft genterapi og diagnose, der er baseret på IL-6, miR-21, og PDCD4.

tak

Vi takker Dr. Zhiwei Yuan for hjælp til immunhistokemisk analyse.