PLoS ONE: Angivelse af Long ikke-kodende RNA hotair korrelerer med Disease Progression i blærekræft og er indeholdt i blærekræft Patient Urinary Exosomes

Abstrakt

Exosomer er 30-150nM membranbundne udskilles vesikler, der er let isoleres fra biologiske væsker, såsom urin (UE’er). Exosomer indeholder proteiner, mikro-RNA (miRNA), messenger RNA (mRNA), og lange ikke-kodende RNA (lncRNA) fra deres celler oprindelseslande. Selvom miRNA, protein og lncRNA er blevet isoleret fra serum som potentielle biomarkører for benigne og maligne sygdomme, er det uvist, om lncRNAs i UEer fra urotelial blærekræft (UBC) patienter kan tjene som biomarkører. lncRNAs er 200 nukleotid lange transkripter, der ikke koder protein og spille kritiske roller i tumor biologi. Da antallet af anerkendte tumorassocierede lncRNAs fortsætter med at stige, er der en parallel behov for at inkludere lncRNAs i biomarkør opdagelse og terapeutiske mål algoritmer. Den lncRNA HOX transkript antisense-RNA (hotair) har vist sig at lette tumor initiering og progression og er forbundet med dårlig prognose i flere kræftformer. Betydningen af ​​hotair i kræft biologi har udløst interesse i at bruge hotair som biomarkør og potentiel terapeutisk mål. Her viser vi hotair og flere tumorassocierede lncRNAs er beriget i UEer fra UBC patienter med høj kvalitet muskel-invasiv sygdom (HGMI pT2-pT4). Knockdown af hotair i UBC cellelinjer reducerer

in vitro

migration og invasion. Vigtigere, tab af hotair udtryk i UBC cellelinjer ændrer udtryk for epitelial-til-mesenkym overgang (EMT) gener, herunder SNAI1, TWIST1, ZEB1, ZO1, MMP1 LAMB3, og LAMC2. Endelig brugte vi RNA-sekventering til at identificere yderligere fire lncRNAs beriget med UBC patient UE’er. Disse data tyder på, at UE-afledte lncRNA potentielt kan tjene som biomarkører og terapeutiske mål

Henvisning:. Berrondo C, hør J, Kucherov V, Siebert A, Osinski T, Rosenberg A, et al. (2016) Angivelse af Long ikke-kodende RNA hotair korrelerer med Disease Progression i blærekræft og er indeholdt i Blære kræftpatient Urinary Exosomer. PLoS ONE 11 (1): e0147236. doi: 10,1371 /journal.pone.0147236

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: 12 oktober, 2015; Accepteret: December 30, 2015; Udgivet: 22 Jan 2016

Copyright: © 2016 Berrondo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. CTSI ved University of Rochester 5UL1TR000042-09

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lncRNAs, er udskrifter, der er 5 ‘7-methylguanosin udjævnede og enten polyadenyleret eller unadenylated og er 200 nukleotider lang. Engang blev betragtet genomisk støj, er lncRNA viser sig at være vigtige mediatorer af normale cellulære processer, herunder, udviklingsmæssige prægning, dosering kompensation, og cellulær differentiering samt funktioner inden for modne celler, såsom styring af splejsning og hormon regulering [1,2]. Dysregulering af lncRNA ekspression har vist sig at være vigtig i maligne processer såsom tumorudvikling [3-6].

Med fremkomsten af ​​transkriptomet hele RNA-sekventering (RNA-seq) opdagelsen af ​​lncRNAs er steget væsentligt. For nylig, Iyer

et al

anvendt

ab initio

forsamling til RNA-sekventering (RNA-seq) biblioteker fra flere tumorer at afsløre tusindvis af afstamning og cancer-associerede lncRNAs hvilket understreger betydningen af ​​at inddrage lncRNA i biomarkør og terapeutiske mål opdagelse algoritmer [7].

En glimrende kilde til biomarkør opdagelse er exosomer. Exosomer er 30-150nM membranbundne secernerede vesikler, der let oprenses fra dyrkningsmedier og biologiske væsker, herunder serum, ascitesvæske og urin (UE’er) [8-14]. Exosomer deltage i intercellulære kommunikation ved at levere proteiner, miRNA, mRNA, og lncRNA til modtager celler [15,16].

Der er spirende tegn på, at udskrift emballage i exosomer er ikke stokastisk og kan stole på signatur motiver og sekundær struktur. [17-20]. Endvidere onkogen signalering såsom KRAS resulterer i selektiv pakning af miRNA i exosomer, hvilket indikerer, at cellulær transformation kan generere en cancer-specifik exosome profil, der kunne tjene som biomarkører [21].

Især kvantitative sammenligninger af producentceller versus exosomer viser, at exosomer markant er opbrugt i mRNA, men beriget med lncRNA [18-20]. Desuden lncRNAs udvise større specificitet end proteinkodende mRNA som biomarkører for kræft [22]. Givet lncRNA er beriget i exosomer udstillingsområde kræft specificitet, de er attraktive kandidater til biomarkør opdagelse.

Flere grupper har vist, at miRNA, mRNA og protein i serum-afledte (SE) og urinveje exosomer (UE) kan tjene som biomarkører for både benigne og maligne sygdomme [23-36]. For eksempel har vi tidligere identificeret, epidermal vækstfaktor-lignende gentagelser og discoidin I-lignende domæner 3 (EDIL-3) protein i exosomer fra urotelial blærecancer (UBC) cellelinjer og UEs isoleret fra UBC patienter med high-grade muskel invasive tumorer (HGMI pT2-pT4) [34,37].

prostata og UBC tilknyttede lncRNAs er blevet isoleret fra annulleret celler eller frit flydende i urin, og flere grupper har identificeret lncRNA i UE fra patienter med prostatacancer [28, 38,39]. Imidlertid har ingen publicerede undersøgelser vist, at UBC UE-afledte lncRNAs kan tjene som biomarkører [28,38,39]. En fordel ved at anvende UEs er, at exosomet membran beskytter indholdet mod proteaser og RNAser, som er allestedsnærværende i urin [40]. Nylige undersøgelser har vist, at den primære UBC tumorer indeholder unikke lncRNA vi derfor søgt at indfange sådanne lncRNA i UE af UBC patienter med HGMI sygdom [7]. Et vigtigt medlem af klassen af ​​tumorassocierede lncRNAs er hotair, som overudtrykkes, med så meget som 2000 gange i patient med brystcancer tumorer sammenlignet med normalt væv [3]. Hotair over-ekspression er også forbundet med forøget invasionsevne og dårlig prognose [3,41]. Vigtigere er det, hotair er blevet vist at regulere adskillige gener involveret i epitel-til-mesenkym overgang (EMT), herunder snail familie zinkfinger 1 (SNAI1), laminin, beta 3 (LAMB3), laminin, gamma 2 (LAMC2), forbindelsesepitoper adhæsionsmolekyle 2 (JAM2) og ABL proto-onkogen 2 (ABL2) [3,42-44].

betydningen af ​​hotair i UBC er begyndt at komme frem i lyset gennem flere nylige undersøgelser. For eksempel, Yan

et al

. vist, at forhøjet udtryk for hotair forudsiger høj kvalitet non-muscle invasive UBC (NMIBC) recidiv [45]. De optrådte også

In vitro

undersøgelser der viser, at hotair er involveret i migration og invasion og undertrykkelse af den kanoniske Wnt pathway antagonist protein WIF-1 [45].

Martinez-Fernandez

et al

. undersøgte muligheden for, at hotair udtryk kunne tjene som en prognostisk markør for tilbagefald i NMIBC [46]. De demonstrerede, at patienter med højere niveauer af hotair ekspression havde også tidligere fornyet sygdom. Desuden viste de, at Enhancer af Zeste 2 Polycomb Undertrykkende Complex 2 underenhed (EZH2) regulerer ekspressionen af ​​hotair. Endelig har de anvendes Cancer Genomisk Atlas (TCGA) datasæt for blærekræft at vise, at hotair udtryk er korreleret med etape af UBC med de mest invasive T4 tumorer med det højeste niveau af hotair udtryk.

I en anden undersøgelse Sun

et al

. påvist, at MIR-205 er vigtige for inhibering af proliferation, migration og invasion af UBC cellelinier. De identificerede celle-cyklus regulering gen cyclin J (CCNJ) som en ny målsætning for miR-205. Vigtigere, viste de, at hotair deltager i undertrykkelse af miR-205-ekspression i UBC celler gennem epigenetisk regulering [47].

Samlet disse undersøgelser viser hotair spiller kritiske roller i UBC. I betragtning af betydningen af ​​hotair i tumor progression, er der øget interesse for at bruge hotair som biomarkør samt en terapeutisk mål i kræft, hvor hotair er afvigende udtrykt [2,48,49]. Vigtigere er det, der har en ikke-invasiv måde at opdage hotair i kræftpatienter, såsom UEer, ville være ideel til biomarkør udvikling [15,16,23].

Her er vi udvide anvendelsesområdet for hotair engagement i UBC biologi. For eksempel har vi identificeret yderligere EMT faktorer, der påvirkes ved ekspression af hotair. Kritisk viser vi hotair og andre lncRNA herunder tumor-associerede lncRNAs Hoxa klynge antisense RNA 2 (HOX-AS-2), Antisense ikke-kodende RNA i

INK4

locus (ANRIL), lang intergeniske RNA regulator af Omprogrammering (Linc-RoR), er overudtrykt i UBC cellelinjer og er beriget i exosomer isoleret fra UBC cellelinjer. Vi viser også, at hotair, HOX-AS-2, Metastase-associeret lungeadenokarcinom udskrift 1 (MALAT1), og lincRoR er overudtrykt i tumorer og beriget i UEer fra UBC patienter med HGMI sygdom (pT2-pT4 om endelig cystektomi patologi). Vigtigt er det, brugte vi RNA-seq at identificere yderligere og nye lncRNAs beriget med UE’er fra patienter med HGMI (pT2-pT4) UBC sammenlignet med raske frivillige. Vi fandt fire sådanne lncRNAs; Hydatidiform muldvarp forbundet og påtrykt ikke-protein-kodende RNA 1 (HYMA1), Long intergeniske ikke-protein-kodende RNA 477 (LINC00477), LOC 100.506.688, Orthodenticle homeobox 2 antisense-RNA 1 (OTX2-AS1)

Materialer og metoder

Patienter og frivillige

Denne undersøgelse blev godkendt af Research Emner Review Board ved University of Rochester Medical center (RSRB godkendelsesnummer IRB # 46706). Kemoterapi naive patienter, som gennemgår cystektomi for HG sygdom (endelig cystektomi patologi pT2-pT4) blev inkluderet i denne undersøgelse. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere, og holdt i sikre filer pr RSRB regler. Forskning data blev kodet for at sikre, at personer ikke kunne identificeres, direkte eller via forbundne identifikatorer i overensstemmelse med Department of Health and Human Services Regulations til beskyttelse af personmotiver (45 CFR 46,101 (b)). Emne identifikationsnumre blev også re-kodet til offentliggørelse. Vi indsamlede urin, tumorer, og distal normalt væv (DNT) fra patienter. Væv blev opnået fra patologi i formalin paraffinindstøbte (FFPE) blokke. Vævet blev hematoxylin og eosin farves til bestemmelse tumorbærende væv og DNT (mindst 3 cm væk fra tumoren målt af en uafhængig patolog). Frivillige var sunde 18+ år uden tidligere urologiske sygdomme.

RNA-sekventering og dataanalyse

RNA mængde blev bestemt ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer og kvalitet blev bestemt med en Agilent Bioanalyzer, hjælp Pico assay. RNA kvalitetskontrol, bibliotek forberedelse og sekventering blev udført af University of Rochester Genomics Research Center (GRC) ved hjælp af Ribo-forarmet cDNA biblioteker genereret af TruSeq RNA kit V2 (Illumina). cDNA blev fragmenteret, Barcoded med Illumina-fremstillede adaptere, og PCR-amplificeret. Illumina HiSeq2500 blev anvendt til high-throughput RNA-sekventering. Tyve millioner 125 bp pair-ended læser /prøve blev opnået

For NSG databehandling.; rå 125 bp læser blev de-mutiplexed. Lav kompleksitet læser og vektor forurening blev fjernet. Den FASTX toolkit (fast_quality_trimmer) blev anvendt til at fjerne baser med kvalitet score under Q = 13 og tilpasset til det menneskelige genom samling udgave hg19 /GRCh37 hjælp Burrows-Wheeler Aligner med standardindstillinger. Læs tællinger blev genereret med HTSeq og Manchetknapper /Tophat blev anvendt til differential ekspressionsanalyse [50]

cellelinier

BC cellelinjer benyttes:. SV-HUC, 5637, TCC-SUP, T24 , UMUC3, HT1376, J82, og RT4, fås fra ATCC. HEK293-celler blev anvendt til viral pakning. Celler blev dyrket i relevante medier og i henhold til ATCC retningslinjer. UBC cellelinje identitet blev genetisk valideret af DDC Medical

shHOTAIR og shScramble stabile kloner

HEK293 celler blev transficeret med plasmider:. PSPAX2, pMD2G, og GFP-udtrykkende shRNA hotair (shHOTAIR) eller Scramble kontrol (shScramble) lentiviral vektor-konstruktioner, som var generøse gaver fra Systems BioScience (Mountain View, CA). TCC-SUP og T24-celler blev inficeret med shHOTAIR eller shScramble lentivirus og udvalgt af puromycin (2 ug /ml) og FAC sorteres. Knockdown af hotair blev bekræftet ved QRT-PCR.

siRNA

T24-celler blev udpladet i 6-brønds plader ved en koncentration på 6×10

4 celler /brønd, og inkuberet natten over. Inkubation og transfektion af siRNA hjælp DharmaFECT 1 reagens (GE Life Sciences, Dharmacon) blev udført som pr fremstiller protokol. Specifikt for hver brønd, 2.5μL af 5 uM siRNA og 1.37μL af DharmaFECT 1 reagens (GE Life Sciences Dharmacon) blev anvendt. SiRNA anvendte blev tidligere publiceret: siHOTAIR (siRNA-1 UAACAAGACCAGAGAGCUGUU; siRNA-2 CCACAUGAACGCCCAGAGAUU); og styre siGFP (CUACAACAGCCACAACGUCdTdT.) blev opnået fra GE Life Sciences Dharmacon [51].

exosome Forberedelse og sporing Analyse

Exosom-producerende cellelinjer TCC-SUP og T24 blev dyrket i Bioflasks som ifølge producentens anbefalinger (cellelinie 1000AD) i passende dyrkningsmedium suppleret med 10% exosom-fri FBS (EF-FBS). EF-FBS blev fremstillet ved ultracentrifugering ved 100.000 x g ved 4 ° C i 18 timer.

Exosomer blev høstet ved seriel centrifugering og ultracentrifugering som beskrevet tidligere [34,52]. Exosome protein blev kvantificeret ved anvendelse af en microBCA kit (Pierce) og partikel analyse blev udført ved hjælp af LM10 nanopartikel karakterisering systemet (NanoSight) monteret med blå laser 488.

sårheling, Trans godt og 3D Invasion Analyser

En sårhelende assay blev anvendt til evaluering migration [53]. Sårene blev målt til tiden nul, lige efter at såret og fire senere. Sårlukning blev målt ved anvendelse ImageJ software.

En trans-brønd assay blev anvendt til at bestemme invasion som tidligere beskrevet med modifikationer [54]. 1 × 10

5 celler i basalt medium blev sat til 8um pore trans-brønd indsatser (Corning Inc.) præ-belagt med reduceret vækstfaktor Cultrex (Trevigen Inc). Indsætter blev høstet, fikseret, og farvet med 1% toluidinblåt, fotograferet, og det samlede areal af blå-farvede celler blev beregnet ved hjælp af den partikel analyse funktion i ImageJ software.

For 3D invasion analyse, 1325 celler /190 ul blev podet i 3D mictrotissue

® plader (Sigma) på dag 0 [55,56]. Efter sfæroid dannelse blev medierne erstattet med basalmembran ekstrakt (BME) (Cultrex). Sfæroid billeder blev taget ved hjælp Progres

® CapturePro 2.7.7 (Jenoptik) ses med Axio observatør A1 mikroskop (Zeiss). Invasion blev målt som længden og antallet af fremspring i medierne ved hjælp ImageJ.

Western Blotting Analysis

For Western blotting 20 ug af exosom eller cellelysat protein blev analyseret med 10% SDS PAGE. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et microBCA kit (Pierce) ifølge producentens anbefalinger. Alix (3A9) (Cell Signaling Technology, Cat # 2171, 1: 1000 fortynding), GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Cat # sc-32233, 1: 200 fortynding), snail (C15D3) (Cell Signaling Technology, Cat # 3879, 1: 1000 fortynding), ZEB1 (H-102) (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: Sc-25.388, 1: 200 fortynding) og Beta-tubulin (Cell Signaling Technology, Cat # 2128, 1: 1000 fortynding). Anti-kanin IgG-peberrodsperoxidase, anti-gede-IgG-peberrodsperoxidase og anti-muse-IgG-peberrodsperoxidase blev anvendt som sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology). Kemiluminescerende detektion blev udført ved hjælp af Super Signal West Femto Maksimal følsomhed Substrat (Thermo Scientific) i henhold til fabrikantens anbefalinger. Billede capture blev udført ved hjælp af et ChemiDoc imaging system (Bio-Rad).

Immunofluorescens

For immunfluorescens af shHOTAIR og shScramble TCC-SUP celler, blev fikseret i 4% paraformaldehyd og blokeret i 0,5% normalt gedeserum i PBST (0,3% Triton X-100 i PBS) i 1 time ved stuetemperatur. Celler blev inkuberet i ZEB1 (H-102) antistof (Santa Cruz Biotechnology, Cat #: Sc-25.388, fortynding 1:50 i PBST) natten over ved 4 ° C, vasket tre gange med PBS, derefter inkuberet med sekundært antistof gede-anti- kanin-IgG (H + L) Alexa Fluor

® 594 konjugat i 2 timer ved stuetemperatur (Thermo Scientific Catalog #: A-11012, 1: 200 fortynding i PBST). Efter tre vaske i PBS, blev farvede celler monteret i Vectashield HardSet antifade Mounting Medium med DAPI. ICC imaging:

Celler blev farvet og behandlet samtidigt. Celler blev afbildet under anvendelse af et FV1000 Olympus laserscanning konfokal mikroskop med en 20x objektiv i URSMD lysmikroskopi delte ressource. Laser og spænding indstillinger blev justeret således, at intensiteten niveauer af DAPI og Alexa 594 udtryk var inden for det lineære område for alle billeder og indstillinger forblev ens for alle billeder. Opnå og offset blev justeret til den indledende kontrol image og derefter bruges til alle billeder. Et formatforhold på 1024 x 1024 og en Kalman gennemsnit af 2, blev anvendt. Alle indstillinger var identiske for alle fire grupper. Mønstrene er offentliggjort i dette manuskript er blevet reproduceret i to separate eksperimenter og data repræsenterer den reproducerbare resultat af behandlinger og farvning for disse proteiner.

Elektronmikroskopi

5 pi af exosome præparat blev anbragt på 200 mesh kobbergitre overtrukket med Formvar /carbon og inkuberet 1-2 minutter. Gitre blev farvet med 20 pi af 2,0% phosphowolframsyre (pH 6,5) og fik lov til at tørre. En Hitachi 7650 Transmission Electron Microscope på 80kv blev anvendt til at se prøver. Repræsentative elektronmikrofotografier blev taget med et Gatan Erlangshen 11 megapixel digitalkamera.

RNA forberedelse

Urin blev indsamlet fra HG patienter på operationsstuen efter induktion af generel anæstesi. Urin blev indsamlet fra raske frivillige ved ambulante klinikker. Urin blev behandlet straks for fjernelse af cellulær detritus og store ekstracellulære vesikler ved seriel lav hastighed og høj hastighed centrifugering [40]. Urin blev derefter opdelt i alikvoter i 40 ml prøver og lagret ved -80 ° C indtil den endelige patologi blev bestemt.

Kun prøver fra patienter, som havde endelige cystektomi tumor patologi pT2-pT4 blev yderligere bearbejdet til RNA under anvendelse af urin exosome RNA isolation kit ifølge producentens instruktioner (Norgen). RNA blev indgivet straks efter isolering for RNA-sekventering. Den resterende RNA blev opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-sekventering data blev stillet til rådighed og RNA var nødvendigt for bekræftelse af RNA-sekventering resultater.

Cell line exosome RNA blev fremstillet under anvendelse af TRIzol (Thermo Fisher Scientific) som pr producentens anbefalinger. Cellelinie RNA blev fremstillet ved anvendelse af RNeasy mini plus kit (Qiagen) i henhold til producentens anbefalinger. Tissue RNA blev isoleret med RNeasy FFPE (Qiagen) i henhold til producentens anbefalinger. I alle tilfælde blev RNA fremstillet og umiddelbart anvendt til cDNA generation og efterfølgende QRT-PCR.

cDNA blev genereret med Bio-Rad iScript cDNA-syntese kit. QRT-PCR blev udført med Bio-Rad SYBR-green og Bio-Rad CFX96 Real-Time-systemet. House holde gener inkluderet GAPDH og 18S, som begge er pakket ind i exosomer [57]. Den Normfinder programmet blev anvendt til at bestemme den passende housekeeping-gen til normalisering af QRT-PCR data. Baseret på evalueringen af ​​beta-actin, GAPDH og 18S, valgt analysen enten GAPDH eller 18S. Den valgte housekeeping-genet er dokumenteret i hver figur legende [58]. Primer sekvenser er anført i S1 tabel.

Resultater

UBC cellelinier indeholder tumor-associerede mRNA og lncRNA

For at identificere mål lncRNA til analyse i UBC vi screenet valgt lncRNAs og mRNA’er impliceret i tumorudvikling i andre epiteliale tumorer. Vi valgte fem lncRNAs (hotair, Hoxa-AS-2, lincRNA-ROR, MALAT1, og ANRIL) og tre mRNA Homeoboxen A13 (HOXA13), SRY-box 2 (SOX2) og POU klasse 5 homeobox 1 (POU5F1 /OCT4) impliceret i en række cancere, herunder UBC.

for eksempel har Hoxa-AS-2 er påvist at undertrykke apoptose i promyelocytiske leukæmiceller [59]. Den lincRNA-RoR viste sig at fremkalde EMT i bryst og hepatocellulære kræft [60]. Navnlig hotair blev vist at blive pakket i exosomer og derved påvirke kemosensitivitet og overlevelse under hypoxiske betingelser i recipientceller [16].

MALAT1 har vist sig at være en prædiktor for metastase i en række cancere, herunder UBC [61 , 62]. ANRIL øger celledeling og nedsætter apoptose i UBC celler [63]. Mens HOXA13 øger både proliferation og invasion samt inhiberer apoptose i glioblastom mangeartet celler [64]. Transskriptionsfaktorerne SOX2 og OCT4 normalt drive pluripotens af embryonale stamceller, men er nu blevet impliceret i opretholdelse af cancer stamceller, der kan tjene som tumor-initierende celler for et stort antal tumorer [65].

sammenligning med niveauet af ekspression af disse valgte lncRNA og mRNA i kontrolgruppen SV-40 immortaliserede ikke-tumorigene urotelial cellelinie SV-HUC, fandt vi forhøjet ekspression af hotair, Hoxa-AS-2, ANRIL, og HOXA13 i T24 UBC celler . Mens der i TCC-SUP UBC cellelinie vi fundet hotair, HOX-AS-2 blev Linc-ror, ANRIL og HOXA13 forhøjet (Fig 1A og 1B, henholdsvis).

QRT-PCR blev udført på cellelysater fra en række UBC cellelinier og kontrol SV-40 immortaliseret urotelial cellelinie SV-HUC. Niveauet af mRNA og lncRNA ekspression var først normaliseret til GAPDH og fold-change af genekspression i enkelte UBC cellelinier blev sammenlignet med kontrollen SV-Huc celler. (A) T24 cellelysater (B) TCC-SUP cellelysater. (C) QRT-PCR af hotair i UBC cellelinjer normaliseret til SV-HUC celle line transcript niveauer. (n = 3 eksperimenter). Students t-test blev anvendt til alle eksperimenter for at identificere statistisk signifikans i ekspression mellem UBC og kontrol SV-HUC celler (Fig 1A-1C) * p 0,05, ** p 0,001, *** p. 0,0001

i betragtning af betydningen af ​​hotair i tumor progression vi evaluerede sit udtryk i antallet af UBC cellelinjer spænder fra Grade II til lønklasse IV. Vi fandt, at UBC cellelinjer har en bred vifte af hotair udtryk med TCC-SUP (grad IV), der har den højeste og T24 (grad III) et mellemliggende niveau af ekspression (fig 1C). Disse data understøtter nylig offentliggjort observationer af den brede vifte af hotair udtryk i UBC cellelinjer [66]. Eftersom T24 udtrykte mellemliggende niveauer og TCC-SUP udtrykte relativt højere niveauer af hotair sammenlignet med andre UBC cellelinier (Fig 1C), valgte vi disse to cellelinjer at vurdere de funktionelle roller hotair i UBC.

hotair påvirker UBC celle migration og invasion

in vitro

hotair har vist sig at påvirke migration og invasion i bryst, mave, esophageal og tarmkræft [3,51,67,68]. For at vise, at hotair har funktionelle roller i UBC, vi først genererede hotair knockdown cellelinjer med shRNA mod hotair i T24 og TCC-SUP celler. (S1A og S1B Fig henholdsvis). Knockdown af hotair i T24 og TCC-SUP UBC cellelinjer førte til nedsat migration i en standard scratch-sår assay (Fig 2A og 2B).

Afstand af migration blev målt efter scratch-sår assay af lentiviral shRNA knockdown af hotair over for kontrol shScramble (A) T24 og (B) TCC-SUP UBC cellelinier. Trans-brønd invasion assay af shHOTAIR vs. kontrol shScramble (C) T24 og (D). TCC-SUP cellelinier (E) 3-D invasion assay sammenligner shScramble kontrol TCC-SUP-celler til shHOTAIR TCC-SUP-celler. Celler podes i microtissue

® genereret caster geler og lov til at danne sfæroider. Efter sfæroider er dannet, BME forsigtigt overtrukket over caster gel. Mørke cirkulære sphæroider vises og pile peger på fremskrivninger af invaderende celler i det omgivende BME. F. Efter 7 dages dyrkning blev projektion længder målt fra klumpformet overflade til den distale spids ved hjælp ImageJ og den gennemsnitlige længde af fremspringet bestemt for hver celletype. T-test blev anvendt til bestemmelse af statistiske forskelle i hvert forsøg præsenteret (AF) * p 0,1, ** p 0,05, *** p. 0,01 (n = 3-6 eksperimenter /panel)

invasion blev undersøgt af både trans-godt og 3-D analysesystemer (microtissues

®). I 3-D kultur tumorceller danner spontant sfæroider. Det er velkendt, at celler dyrket som 3-D sfæroider maksimere celle-til-celle interaktioner og efterligner nærmere endogent væv opførsel [55,56]. Hotair Knockdown celler var mindre invasive i både trans-brønd (figur 2C og 2D) og 3-D assays (fig 2E og 2F).

hotair påvirker epitel-til-mesenkym overgang genekspression

EMT menes at være en væsentlig onkogen overgang som kræftceller dissocierer fra epitelbaner og invadere ind omgivende væv. Hotair er blevet vist at påvirke både aktivering og repression af talrige EMT pathway-medierende gener i flere epiteliale cancere [3,69,70]. EMT gener har vist sig at regulere tumor invasion i

in vitro

assays, såsom det transeuropæiske godt assay og

in vivo

under tumor invasion i hvert undersøgte tumor [71,72].

vi forventede, at den reducerede migration og invasion, som vi observerede i UBC hotair knockdown celler er vist i fig 2A-2F skyldtes virkningerne af hotair på EMT genekspression. Hotair har vist sig at både inducere og undertrykke adskillige gener involveret i EMT herunder SNAI1, LAMC2, LAMB3, ABL2, JAM2, PCDHB5, og PCDHB10 [3]. Men hotair ikke regulere disse gener i hver tumortype [48].

For at løse hotair /EMT pathway forhold i UBC, vi brugte QRT-PCR til at evaluere de hotair målgener tidligere identificerede ud over flere andre EMT faktorer i shScramble kontrol celler sammenlignet med shHOTAIR UBC cellelinjer.

fig 3A og 3B viser, at både shHOTAIR T24 og shHOTAIR TCC-SUP-cellelinjer havde reduceret ekspression af SNAI1, en mester regulator af EMT, samt som EMT pathwaygener LAMB3 og LAMBC2 mRNA sammenlignet med shScramble kontroller. Men vi fandt ikke, at hotair knockdown påvirkede udtryk for JAM2, ABL2, PCDHB5 eller PCDHB 10 (data ikke vist). Derfor kontrolleres vi det basale niveau af ekspression af disse kendte hotair mål i T24 og TCC-SUP celle (S2 Fig). Selvom de tidligere identificerede mål for hotair blev udtrykt i både T24 og TCC-SUP, blev deres udtryk ikke påvirket af tab af hotair (data ikke vist).

(A) QRT-PCR af kendte hotair målgener og klassisk EMT faktorer mRNA i shHOTAIR T24 sammenlignet med shScramble T24 UBC celler. (B) EMT målgen mRNA-ekspression i shHOTAIR TCC-SUP-celler sammenlignet med shScramble TCC-SUP-celler (i panel A og B EMT-mRNA-niveauer blev normaliseret til GAPDH). (C) siRNA rettet mod hotair eller GFP blev anvendt i T24-celler og EMT faktorer ZEB1 og SNAI1 mRNA-ekspression vurderet ved QRT-PCR (mRNA blev normaliseret til 18s). (D) Immunoblot af T24 siGFP og siHOTAIR celler som frembyder reducerede protein niveauer af ZEB1 og SNAI1. GAPDH er et loading kontrol. Beta-actin blev anvendt som en loading kontrol. T-test blev anvendt til bestemmelse af statistiske forskelle mellem kontrol og hotair Knockdown celler i QRT-PCR-forsøg præsenteret (AC) * p 0,1, ** p 0,05, *** p 0,01 (n = 3-6 eksperimenter /panel).

det er vigtigt, at ekspressionen af ​​to andre klassiske markører af EMT, Zink-finger E-box bindende homeobox 1 (ZEB1), og Twist familie bHLH transskription faktor 1 (TWIST1) blev reduceret i shHOTAIR knockdown UBC cellelinier (fig 3A og 3B).

ekspressionen af ​​E-cadherin (CDH1) og vimentin (VIM) mRNA blev evalueret i shScramble og shHOTAIR T24 og TCC-SUP-cellelinjer. Både CDH1 og VIM mRNA blev udtrykt ved ekstremt lave niveauer og var uændret mellem shScramble og shHOTAIR cellelinier indikerer, at hotair betyder sandsynligvis ikke mægle UBC cellelinje invasiv via ændringer i disse to EMT-afspillere (data ikke vist). Disse data er i overensstemmelse med tidligere publicerede rapporter, der viser, at CDH1 og VIM minimalt udtrykkes i T24 og TCC-SUP [73,74].

Interessant, Matrix-metallopeptidase 1 (MMP1) mRNA-ekspression blev reduceret i shHOTAIR TCC- SUP UBC-celler (fig 3b). MMP-1 protein spalter interstitielle kollagener i den ekstracellulære matrix, hvilket vil lette tumor invasion [75]. Omvendt vi observeret forøget ekspression af Tight junction protein 1 (TJP1 /ZO1) mRNA i shHOTAIR TCC-SUP UBC celler sammenlignet med shScramble kontrolceller (fig 3B). ZO-1 protein opretholder intercellulære tætte forbindelser vigtige for epitelial ark integritet [76]. Korrelationen for tab af hotair med forøget ekspression af ZO1 antyder, at shHOTAIR TCC-SUP celler at vende tilbage til en mere epitelial fænotype. Endvidere antyder disse data at hotair kan spille en rolle i at undertrykke nogle epitel-relaterede gener i TCC-SUP-celler.

For at understøtte resultaterne af shHOTAIR knockdown data, vi anvendte tidligere offentliggjorte siRNA rettet mod hotair at generere siHOTAIR knockdown T24 UBC celler [51] (S3 fig). Eftersom ekspressionen af ​​SNAI1 og ZEB1 mRNA blev begge ramt af hotair knockdown i T24 og TCC-SUP UBC celler (Fig 3A og 3B henholdsvis), vi evaluerede mRNA (fig 3C) og proteinniveauer (Fig 3D) af SNA1 og ZEB1 i siGFP og siHOTAIR T24-celler. Både mRNA og protein niveauer af SNA1 og ZEB1 blev reduceret i siHOTAIR knockdown T24-celler (fig 3D). Samlet set understøtter disse data sammenhængen mellem et tab på hotair udtryk med reduceret migration og invasion og EMT faktor udtryk i UBC cellelinjer.

HGMI (pT2-pt4) UBC tumorer er beriget i tumor-associerede lncRNA og mRNA

Tumorer og DNT fra kemoterapi naive patienter, der gennemgår cystektomi for HG sygdom (bekræftede endelige patologisk etape pT2-pT4) blev isoleret med IRB godkendelse. Patient kliniske karakteristika er featured i S2 tabel.

Vi brugte QRT-PCR til at identificere tumor-associerede lncRNA og mRNA i tumorer i forhold til DNT epitel fra de samme patienter (Fig 4A). Vi fandt, at hotair, HOX-AS-2, MALAT1 og to mRNA OCT4 og SOX2 har højere niveauer af ekspression end DNT (ekspressionsniveauet af individuelle tumorer blev samlet og sammenlignet med puljede DNT ekspressionsniveauer).

( A) QRT-PCR af tumor-associerede mRNA og lncRNAs i tumorer fra patienter, som gennemgik cystektomi for HG sygdom (endelig patologi pT2-pT4). Tumor og distal normalt væv (DNT) mRNA eller lncRNA blev normaliseret til 18s og derefter forholdet mellem tumor til DNT blev beregnet. Statistisk signifikans blev bestemt under anvendelse af Students t-test til sammenligning tumor til DNT normaliseret ekspression, * p 0,05. (N = 10 patienter). chemotherapy.

doi:10.1371/journal.pone.0147236.s006

(DOCX)

Acknowledgments

Functional