PLoS ONE: Vækstdvale af kræftceller med Undertrykkelse af AKT aktivitet bidrager til overlevelse i kronisk Hypoxia

Abstrakt

En hypoxiske mikromiljø i tumorer er blevet anerkendt som en årsag til malignitet eller resistens over for forskellige behandlinger mod kræft. I modsætning til de seneste fremskridt i forståelsen af ​​akutte respons af kræftceller til hypoxi, karakteristika tumorceller i kronisk hypoxi forblive undvigende. Vi har identificeret en pankreatisk cancercellelinie, AsPC-1, der er usædvanlig i stand til at overleve i ugevis under 1% oxygen betingelser, mens de fleste testede cancercellelinier dør efter kun nogle dage under disse betingelser. Ved kronisk hypoxi, AsPC-1 celler ind i en hviletilstand karakteriseret ved ingen spredning, ingen død, og metabolisk undertrykkelse. De reversibelt sættes i aktiv status efter midlertidig anbringelse igen under optimale dyrkningsbetingelser. ATP omsætning, en indikator for energiefterspørgslen, var markant nedsat, og ledsaget af reduceret AKT fosforylering. Tvungen aktivering af AKT medførte øget ATP omsætning og massiv celledød

in vitro

et nedsat antal hvilende celler

in vivo

. I modsætning til de fleste kræft cellelinjer, primære-dyrkede kolorektale cancerceller nemt ind i sovende tilstand med AKT undertrykkelse under hypoxi kombineret med vækstfaktor-udtømte betingelser. Primære kolorektal cancer celler i dvale var resistente over for kemoterapi. Således, evnen overleve i en forringet mikromiljø ved at indgå vækstdvale under kronisk hypoxi kan være en fælles egenskab blandt cancerceller. Målretning reguleringsmekanismen inducerer denne hvilende status kunne give en ny strategi til behandling af cancer

Henvisning:. Endo H, Okuyama H, Ohue M, Inoue M (2014) Vækstdvale af kræftceller med Undertrykkelse af AKT aktivitet bidrager til Overlevelse i kronisk Hypoxi. PLoS ONE 9 (6): e98858. doi: 10,1371 /journal.pone.0098858

Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Januar 27, 2014 Accepteret: 8. maj 2014 Udgivet: 6 juni 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af KAKENHI (25461937) (www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/, HE, MI), Charitable Trust Osaka Cancer Forsker-Fundet (HE), Japan Foundation for Anvendt Enzymology (www.mt- pharma.co.jp/jfae/, HE, HO, MI), Takeda Science Foundation (www.takeda-sci.or.jp/, MI), og The Naito Foundation (www.naito-f.or.jp/, MI). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mikromiljø inden for en fast tumor kan være stærkt heterogen [1]. På grund af ufuldstændige blodkar netværk og ubalancen mellem proliferation og angiogenese, kan mikromiljøet i nogle dele af en fast tumor være hypoxisk og dårligt forsynet med næringsstoffer [2], [3]. Afhængigt af deres mikromiljø, kan cancerceller viser helt forskellige karakteristika af celleaktivitet, herunder proliferation, onkogen-aktivering, og metabolisme [4]. Tumorceller i en hypoksisk område fjernt fra blodkar viser nedsat proliferation [5] og modstandsdygtighed over for kemo- eller strålebehandling [6], [7]. For nylig, ved hjælp af en

in vivo

gen-tagging metode, blev det påvist, at tumorceller i hypoxiske regioner kunne være oprindelsen af ​​tilbagefald efter strålebehandling [8]. Det blev også rapporteret, at ændring af genekspression i kronisk hypoxi var forbundet med høje tilbagefald satser i kolorektal kræftpatienter [9]. Undersøgelse biologi tumorceller i hypoxiske betingelser kan være afgørende for at forbedre terapeutisk effekt og for udryddelse af kræft. Efter opdagelsen af ​​hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α), transkriptionel regulering som respons på akut hypoksi er blevet ganske godt belyst [10]. I modsætning til svarene fra kræftceller til akut hypoxi, men hvordan kræftceller reagerer på den vigtige, men forskellige tilstand af kronisk hypoxi [11] er fortsat undvigende.

PI3K /AKT signalering spiller en central rolle i overlevelse, spredning, og metabolisme i cancerceller [12]. På grund af den uhensigtsmæssige aktivering af receptortyrosinkinase (RTK) eller PI3K, eller tab af PTEN funktion, er konstitutiv aktivering af AKT hyppigt observeret i flere humane cancere [12]. Aktiveret AKT fremmer glycolytiske eller biosyntetiske veje ved at aktivere GLUT1, hexokinase 2 eller ATP-citratlyase. En af de nedstrøms molekyler af PI3K /AKT er mTOR kompleks 1 (mTORC1), som fremmer proteinsyntese og cellevækst. Således AKT /mTORC1 veje spiller en vigtig rolle for tumorvækst og stofskifte; men de tilgængelige materialer til biosyntese er ikke altid rigelige i den heterogene tumormikromiljøet. I hypoxiske region fjernt fra blodkar, vedvarende aktivering af AKT /mTORC1 vej kan føre til kritisk udtømning af næringsstoffer og energikrise.

Evnen til at undertrykke den basale stofskifte og indgå en hypometabolic status er en life-saver for mange organismer, når energikilden såsom ilt og næring er begrænset [13], [14]. Faktisk er nedregulering af mTORC1 aktivitet i akut hypoxi kendt [15] – [17], og undertrykkelse af mTORC1 er efter sigende vigtigt for tumorcelleoverlevelse under stressende forhold [4], [18], [19]. Ikke desto mindre, som nævnt, den kroniske respons af kræftceller er mindre godt forstået.

En faktor hæmmer forbedret forståelse af respons af kræftceller til kronisk hypoxi er manglen på etablerede

in vitro

modeller . De fleste undersøgelser med anvendelse af cancercellelinier er udført inden for 24 timer eller op til et par dage, fordi de fleste cancercellelinier ikke kan overleve den alvorlige nedbrydning af oxygen eller næringsstoffer i en længere periode. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at en pankreatisk cancercellelinie, AsPC-1, kan stabilt overleve ved at indgå en inaktiv status, hviletilstand, for uger under hypoxiske betingelser. Ved undersøgelsen den cellulære respons på denne kroniske hypoxi, fandt vi, at phosphorylering af AKT blev nedreguleret, så AsPC-1 celler til at reducere energiefterspørgslen og overleve under stressende forhold. Desuden fandt vi, at primære kolorektale cancerceller nemt kunne komme ind vækstdvale under hypoxiske og vækstfaktor-berøvet betingelser, hvor de viste bemærkelsesværdige kemoterapi tegn.

Resultater

Overlevelse af celle linjer under kronisk hypoxi

for at undersøge effekten af ​​langvarig hypoxi på kræftceller

in vitro

undersøgte vi flere bugspytkirtelkræft og endetarmskræft cellelinjer dyrket i 1% ilt i mere end en uge til at repræsentere den kroniske tilstand, i modsætning til den kortere ramme af en dag eller så for den akutte tilstand (fig S1). De fleste af de testede cellelinier viste ingen bemærkelsesværdige fald i celleproliferation og døde inden for 7 dage. Det var således generelt vanskeligt at cancer kultur cellelinier over en uge under hypoxiske betingelser.

I modsætning hertil AsPC-1, en pankreatisk cancercellelinie, var usædvanligt stand til at overleve under langvarige hypoxiske betingelser (figur 1A og C). I den akutte fase, AsPC-1-celler i hypoxi voksede samt i normoxiske betingelser, men proliferationshastigheden gradvist faldt indtil dag 7, og celleantallet plateau omkring dag 10 til under 80% konfluens i de eksperimentelle betingelser. Cellerne i normoxi viste massiv celledød efter 14 dage, sandsynligvis på grund af udtømningen af ​​vækstfaktorer eller næringsstoffer (Figur 1B og C). I modsætning hertil cellerne i hypoxi var levedygtige i mere end tre uger uden nogen tegn på celledød, mens mediet ikke blev ændret overhovedet. Cellecyklusanalyse afslørede, at S-fase celler drastisk reduceret på dag 7 i hypoxi sammenlignet med i dag 1 i normoxi eller hypoksi (figur 1D). Cellerne blev optalt i enten G0 /1 eller G2 /M-fase. Dette nedsat proliferation var reversibel; gang igen oxygenized og re-belagte i den friske medium, viste AsPC-1 celler en genopretning af spredning sats at kontrollere niveauet med en lille forsinkelse, selv efter at have været dyrket i 14 dage i hypoxi (figur 1E). Disse resultater indikerede, at AsPC-1-celler reversibelt kunne angive en inaktiv status, hviletilstand, under langvarige hypoxiske betingelser.

levedygtige celler (A) og procent celledød (B), i AsPC-1-celler dyrket i normoxi ( 20% O

2) eller hypoxi (1% O

2). C) Fase-kontrast og PI-farvede billeder af aspC-1 celler dyrket under de angivne betingelser. Scale bar = 50 um. D) Cell cyklus analyse af AsPC-1 celler på dag 1 i normoxi eller dag 1 og dag 7 i hypoxi. Celler blev pulset med BrdU i 2 timer og analyseret ved flowcytometri efter farvning med anti-BrdU antistof og PI. Procentdele af celler i S-fase, er angivet. E) Re-vækst i aspC-1 celler i en sovende tilstand. AsPC-1 celler blev dyrket i hypoxi i 14 dage, og celletal blev overvåget efter re-såning i normoxiske forhold.

Fordi de fleste kemoterapi narkotika målrette prolifererende cancerceller, celler dvælende i dvale ville være resistente over for disse cytotoksiske reagenser. Faktisk aspC-1-celler dyrket i hypoxiske betingelser var resistente over for alle tre kemo undersøgte lægemidler (figur S2a). Både ilt niveauer og proliferationshastighed påvirke effektiviteten af ​​strålebehandling [20]. AspC-1-celler i hvilende tilstand var mere resistente over for røntgenbestråling sammenlignet med celler i normoxi eller ved akut hypoxi (fig S2B). Således ASPC-1 celler i hvilende tilstand var resistente over for konventionel kemoterapi eller radio terapi.

Evaluering af energistofskiftet under kronisk hypoxi

Vi vurderede status af energi metabolisme af kræftcellerne yderligere i sovende tilstand. Som forventet, forbruges AsPC-1 celler mere glukose og produceret mere laktat i den akutte fase af hypoxi sammenlignet med normoxi. I modsætning hertil efter 7 dages hypoxi, glucoseoptagelse og lactat produktion gradvist svækkede (figur 2A, S3A og S3B). Forbruget rate oxygen blev også faldet under kronisk hypoxi (figur 2A). Vi beregnede ATP omsætning fra laktat produktionshastighed og ilt forbrug sats (figur 2A) og fandt, at ATP omsætning faldt under kronisk hypoxi. Dette resultat blev også understøttet af en langsommere fald i cellulære ATP-niveauer efter tilsætning af en cocktail af inhibitorer af glykolyse og oxidativ phosphorylering (fig S3C og S3D) [21].

A) laktat produktionshastighed (venstre) blev beregnet ud fra lactat koncentration og integrerende celleantal ved angivne perioder. O

2 forbrugsrate (midten) blev målt ved anvendelse af en Clark typen oxygen elektrode. ATP omsætning (til højre) blev beregnet ud fra laktat produktionshastighed og O

2 forbrug sats (mørkegrå: laktat; lysegrå: ilt). N1, normoksi en dag; H1, hypoxi en dag; H7, hypoxi 7 dage. **

s

0,01, ***

s

0,001. B) Kvantitativ RT-PCR af en glukosetransportør og glycolytiske enzymer i AsPC-1-celler dyrket i hypoxi for de angivne dage.

Ud over disse assays, vi undersøgte genekspressionsniveauer af glycolytiske enzymer og transportører (figur 2B). Efter udsættelse for akut hypoxi, udtryk for

GLUT1

,

HK2

, og

PDK1

steget. I modsætning hertil ekspressionsniveauerne af disse gener faldet i cancercellerne i hviletilstand. Disse resultater stemte overens med den formindskede glucoseoptagelse i kronisk hypoxi (fig S3A). Tilsammen resultaterne viste, at de hvilende kræftceller produceret mindre ATP men bruger mindre ATP sammenlignet med aktivt delende celler, hvilket tyder på en reduceret efterspørgsel efter energi. Således undertrykkelse af den metaboliske proces er en anden karakteristisk for cancerceller i sovende tilstand.

intracellulær signalering i celler i hvilende tilstand

Dernæst undersøgte vi intracellulær signalering i den passive state kræft celler (figur 3A). Phosphorylering af AKT faldt efter 7 dages hypoxi, selv under vedvarende aktivering af opstrøms RTK’er (Figur S4A). Phosphorylering af S6, en nedstrøms molekyle af mTORC1, blev reduceret fra et tidligere tidspunkt, som det blev rapporteret tidligere [15], [16]. Opregulering af phospho-p38MAPK og nedregulering af phospho-ERK er blevet rapporteret at være en molekylær omskifter til induktion af hvilende tilstand i flere cancercellelinier [22], [23], men vi observeret en lille ændring i deres niveauer, og phospho-p38MAPK blev snarere faldt i kronisk hypoxi. Phosphorylering af eIF2α, som efterfølgende nedregulerer global proteinsyntese [24], blev opreguleret i akut hypoxi men reduceret i kronisk hypoxi (figur S4A), hvilket tyder på en kritisk forskel i celle respons under disse to betingelser. Niveauerne af PHLPP, en AKT Ser473-specifikke fosfatase [25], [26], blev gensidigt steget med AKT de-fosforylering (figur 3A).

A) Immunoblot af AKT /mTORC1 eller ERK /p38 MAPK-vejen i AsPC-1-celler dyrket i hypoxi. B) Immunoblot af AKT-signalering og HIF-1α i AsPC-1 celler, der udtrykker vektor kontrol, AKT-vægt, eller AKT-3A (inaktiv). C) Cell cycle status af cellerne på dag 7 i hypoxi. Procentdele af celler i S-fase er angivet ovenfor plottet og i den højre graf. D) ATP omsætning målt ved tilsætning af inhibitor cocktail for glycolyse og oxidativ phosphorylering. N1, normoksi en dag; H1, hypoxi en dag; H7, hypoxi 7 dage. E, F) levedygtige celler (E) og procent celledød (F) af AsPC-1-celler dyrket i hypoxi. *

s

0,05, **

s

0,01, ***

s

. 0,001

Fordi faldt AKT fosforylering faldt sammen med induktion af sovende tilstand, undersøgte vi den funktionelle rolle af AKT fosforylering i dvale. Vi transduceret tre AKT konstruerer ind AsPC-1 celler: wt-AKT, AKT-3A (inaktiv form af AKT), og AKT-mΔPH (konstitutiv aktiv form for AKT) [27]. Når wt-AKT eller AKT-mΔPH blev overudtrykt, blev AKT phosphorylering opretholdt selv i kronisk hypoxi (figur 3B, s4b). I kontrolceller, ekspressionen af ​​GLUT1 steg i akut hypoxi men faldt i langvarig hypoksi, igen fremhæve en modsat reaktion under de to betingelser. I modsætning hertil WT-AKT-overekspression celler, Glut1 niveauer forblev høj selv i kronisk hypoxi (figur 3B), ledsaget af kontinuerlig glukose forbrug (figur S4C). På den anden side blev S6 phosphorylering i kronisk hypoxi faldt endnu i WT-Akt-overudtrykkende celler (figur 3B). Celle cyklus analyse afslørede, at vt-AKT-overudtrykkende celler i kronisk hypoxi viste en højere proliferationshastighed sammenlignet med kontrolceller (figur 3C, figur S4D). I aspC-1-celler, der udtrykker styrevektor eller inaktiv AKT-3A, ATP omsætning faldt efter 7 dages dyrkning i hypoxi (figur 3D); imidlertid wt-Akt-udtrykkende celler fortsat høje ATP omsætningen, selv i kronisk hypoxi. Disse resultater viste, at vedvarende aktivering af AKT signalering hæmmede AsPC-1 celler i at komme ind i en sovende tilstand i kronisk hypoxi, hvilket indebærer en rolle for AKT undertrykkelse i indtastning dvale. Antallet af levedygtige celler faldet, mens dødeligheden steg efter 14 dage i WT-Akt-udtrykkende celler (figur 3E og F). AKT-mΔPH-udtrykkende celler viste massiv celledød ved tidlige tidspunkter under hypoxiske betingelser (figur S4E og s4f). Endelig, når PTEN, en fosfatase af PI3K, blev slået ned, blev en lille stigning i AKT fosforylering observeret, ledsaget af en stigning i celledød i kronisk hypoxi (Figur S5). Tilsammen disse resultater viser, at undertrykkelse af AKT fosforylering er funktionel i overlevelsen af ​​kræftceller i hvilende tilstand.

HIF-1a delvist bidrager til induktion af hvilende status i kronisk hypoxi

Næste, vi undersøgte bidrag HIF i inaktive kræftceller (Figur S6). Proteinniveauer af HIF-1α blev forøget efter eksponering for hypoxi og opretholdt indtil dag 7 (fig S6D). Når HIF-1α niveauer blev tvunget faldt med shRNA (fig S6A), antallet af levedygtige celler faldt efter 7 dage, hvorimod dødeligheden steget (figur S6B og S6c), hvilket antyder, at vedvarende HIF-1α også bidraget til celleoverlevelse under kronisk hypoxi. Knockdown af HIF-1α havde lille indvirkning på AKT /mTORC1 signalering og noget forhøjede PS6 niveauer (fig S6D), men overekspression af AKT havde ingen virkning på induktion af HIF-1α (figur 3B). Disse resultater viste, at HIF-1α og AKT uafhængigt reguleret sovende status i kronisk hypoxi.

Ændring af hvilende status

in vivo

ved tvungen aktivering af AKT

Vi derefter undersøgt karakteristika tumorer afledt af AKT-mΔPH-udtrykkende AsPC-1-celler

in vivo

(figur 4). Phosphorylering af AKT var påviselig kun i AKT-mΔPH tumorer, men ikke i kontrol- tumorer (figur 4A). Vi observerede nedregulering af S6 phosphorylering og bromdeoxyuridin (BrdU) optagelse i pimonidazole-positive området og dets proksimale zone i kontrol tumorer, i overensstemmelse med vores tidligere rapport bruger en anden cancer cellelinje [4]. Disse områder antyder eksistensen af ​​en zone af hypoxi-induceret vækstdvale

in vivo

. I modsætning hertil AKT-mΔPH-udtrykkende tumorer sjældent indeholdt sovende zone i pimonidazole-proximale region. De pS6- eller BrdU-positive celler blev observeret selv ved ydergrænsen af ​​nekrose (figur 4A).

A) Immunhistokemi af xenotumors af AsPC-1-celler, der udtrykker kontrolvektor (øvre) eller AKT-mΔPH (lavere) . N, nekrose; skala bar = 100 um. B) Procent af BrdU-positive celler i området distalt eller proksimalt for pimonidazole-positive zone. C) Width of pimonidazole-positive zone i tumorer fra vektor eller AKT-mΔPH; *

s

0,05, ***

s

. 0,001

Vi kvantificeret yderligere BrdU-positive celler i de områder, proksimale eller distale til den pimonidazole-positive zone (figur 4B). Procentdelen af ​​BrdU-positive celler blev bemærkelsesværdigt reduceret i området proksimalt for pimonidazole region i forhold til den distale område i kontroldyr tumorer. I modsætning hertil AKT-mΔPH-udtrykkende tumorer indeholdt høje niveauer af prolifererende celler selv i den proximale område. Endvidere i AKT-mΔPH tumorer, blev området af pimonidazole-positive celler faldet i forhold til at kontrollere tumorer (figur 4C), hvilket indikerer, at AKT-mΔPH cellerne ikke kunne træde i en sovende tilstand

in vivo

var mere tilbøjelige til døden under hypoxiske betingelser.

induktion af hvilende status i primære kolorektale cancerceller

Dernæst vi undersøgt, om induktion af hvilende status i henhold kronisk hypoxi også blev observeret i primære dyrkede kræftceller . Vi har for nylig etableret en roman primær kultur-system, CTOS (kræftvæv-stammer sfæroid), i kolorektal, lunge- og urotelial kræft [28] – [30]. Vi forberedt CTOs prøver fra kolorektal cancer patienter og dyrkes dem

in vitro

(figur 5A og B). CTOS vækst blev fuldstændigt inhiberet under en kombination af hypoxi og vækstfaktor-berøvet betingelser, selv om hypoksi alene ikke var tilstrækkelig til at eliminere væksten. Vi testede CTOS fra tre patienter kolorektal cancer, og alle prøver igen voksede godt umiddelbart efter re-eksponering for ilt og vækstfaktor-medium (figur 5C). Således blev induktionen af ​​hviletilstand ikke begrænset til AsPC-1-celler, men også blev observeret i primære cancerceller.

A) CTOS vækst blev målt ved størrelse i forhold til dag 0. C45 CTOS prøver blev dyrket i medium med (GF +) eller uden (GF-) vækstfaktorer. B) Repræsentative billeder af C45 CTOS dyrket i angivne betingelser. Scale bar = 100 um. C) genvækst af CTOS i hvilende tilstand efter re-iltning og udsættelse for vækstfaktor-medium. D) Immunhistokemi af C45 CTOS dyrket i angivne betingelser i 1 dag. TUNEL-farvning var på dag 14. Scale bar = 50 um. E) Immunoblot af AKT /mTORC1 signalering og HIF-1α i C45 CTOS dyrket i angivne betingelser.

Derudover undersøgte vi intracellulær signalering i CTOS ved immunhistokemi og immunoblot (figur 5D og E). Hypoxi kombineret med vækstfaktor depletion blokerede fuldstændigt AKT signalering. Disse resultater stemte overens med CTOS vækst (figur 5A). Vi målte også ilt og glukose forbrug i CTOs prøver (Figur S7). Hypoxi og vækstfaktor-berøvet betingelser alvorligt svækket disse metaboliske processer, som også blev observeret i AsPC-1-celler.

Vi undersøgte derefter kemo-følsomhed CTOS i hvilende tilstand (figur 6). CTOS prøver blev for-dyrket i hypoxi og vækstfaktor-berøvet betingelser i 7 dage. Derefter blev de udsat for 5FU eller SN38, den aktive metabolit af irinotecan, i 7 dage, efterfulgt af vask og dyrkning i frisk StemPro hESC. De CTOS prøver i hvilende tilstand viste genvækst efter at være vendt tilbage til optimale dyrkningsbetingelser ved en 10 gange højere dosis end de CTOS prøver i den aktive status (figur 6A og B). Disse resultater indikerede, at cancerceller i sovende tilstand var mere resistente over for kemoterapier end dem i en aktiv tilstand. Salg

A) CTOS prøver blev dyrket i medium med (GF +) eller uden (GF-) vækstfaktorer, og under 20% O

2 eller 1% O

2 betingelser. 5FU eller SN38 blev tilsat til medium og behandlet i 7 dage (angivet med sorte søjler). På dag 7 blev mediet skiftet til frisk StemPro embryonale indeholder vækstfaktorer (sorte pile), og CTOs prøver fik lov til at regrow under 20% O

2. B) Repræsentative billeder af CTOs prøverne i (A). Scale bar = 100 um.

Diskussion

Vi demonstrerede i nærværende undersøgelse, at en cancer cellelinje og primære kolorektale cancerceller ændre spredning og metabolisk status under langvarige hypoxiske betingelser. Under kronisk hypoxi, kan cellerne indgå en sovende tilstand, der involverer fire karakteristika:. 1) ingen spredning, 2) ingen død, 3) metaboliske undertrykkelse, og 4) nyttiggørelse til aktiv status efter restaurering af optimale dyrkningsbetingelser

AKT er et centralt molekyle regulering celleproliferation, overlevelse og metabolisme. Det er almindeligt accepteret, at aktiveringen af ​​AKT bidrager til celle overlevelse og resistens i akut hypoxi [1], [31] – [33]. I modsætning hertil som vi demonstreret her, i kronisk hypoxi, er nødvendig for induktion af hviletilstand og overlevelse af cancercellerne undertrykkelse af AKT-aktivitet. Fordi levering af både ilt og næringsstoffer vil være begrænset i et område væk fra blodkarrene i en ondartet svulst, bevare den energikilde, ved at reducere energiefterspørgslen kan være en strategi af kræftceller til at overleve i en kronisk forringet mikromiljø.

Den mekanisme, hvorved AKT aktivitet undertrykkes i kronisk hypoxi stadig et åbent spørgsmål. Mulige kandidater indbefatter 1) inaktivering af opstrøms kinaser, såsom RTK’er og PI3K, 2) feedback loop af S6K aktivering, eller 3) aktivering af phosphataser såsom PTEN og PHLPP. De to første muligheder er usandsynligt i betragtning følgende resultater i det nuværende arbejde: 1) phosphorylering af erbB familien RTK’er og MET forblev høj selv i kronisk hypoxi (figur S4A), og 2) mTORC1 aktivitet undertrykkes både i akut og kronisk hypoksi (figur 3A). Den tredje mulighed er understøttet af vores resultater, at niveauerne af PHLPP steg parallelt med AKT inaktivering (figur 3A), og at tvungen undertrykkelse af PTEN forfremmet død i kronisk hypoxi (Figur S5B). Yderligere undersøgelse vil belyse den præcise mekanisme.

I stressreaktion i hypoxi, nedregulering af mTOR aktivitet, udfoldet protein reaktion, og transkriptionel aktivering af HIF er blevet godt undersøgt [10], [34]. REDD1 undertrykker mTORC1 aktivitet gennem TSC1 /2 i hypoxi, hvilket resulterer i hæmning af Cap-afhængig mRNA translation [15], [16]. I udfoldet protein reaktion, en ER resident kinase, PERK, phosphorylerer eIF2α og undertrykker mRNA translation [24]. Fordi proteinsyntese er en energikrævende proces, kan veje undertrykker det spille rolle i induktionen af ​​hviletilstand under kroniske hypoxiske betingelser. Faktisk observerede vi suppression af mTORC1 aktivitet og øget phosphorylering af eIF2α i akut hypoksi (figur 3A, figur S4A). Fordi celledeling og stofskifte blev opretholdt i akut hypoxi, kan de være nødvendige, men ikke nok til at fremkalde hviletilstand i kronisk hypoxi. HIF-1α og HIF-2α er vigtige transkriptionsfaktorer, som regulerer den hypoxiske respons [10]. Ved akut hypoxi, er HIF proteiner stabiliseres og aktivere transkription af forskellige nedstrøms gener. På den anden side, i langvarig hypoxi, HIF proteiner sigende nedreguleres ved feedback-mekanismer. I vores resultater dog udtryk for HIF-1α blev fastholdt i hvilende tilstand i løbet af langvarig hypoxi (figur S6D), og knockdown af HIF-1α medført øget celledød i kronisk hypoxi (figur S6A og S6B), hvilket indikerer, at vedvarende udtryk for HIF-1α var også nødvendigt for overlevelse AsPC-1 celler under kronisk hypoxi.

Selvom ukontrolleret spredning er kendetegnende for kræft, humane tumorer samt xenografter af humane tumorer udviser proliferative indeks så lavt som 20% [ ,,,0],35]. Disse ikke-prolifererende celler i tumorer er undertiden blevet benævnt hvilende celler. For nylig, kræft stamceller teori, hvori antages tumorer, der skal vedligeholdes af deres egne stamceller, er blevet intensivt testet [36]. Fordi ubevægelighed er kendetegnende for normale voksne stamceller, har hvilende cancer stamceller blevet spekuleret, men deres eksistens i humane solide tumorer er ikke direkte undersøgt [36]. I voksne stamceller, er hviletilstand defineret som en celle cyklus fase, G0 [37], mens AsPC-1 celler i hvilende tilstand var til stede i det aktuelle arbejde i både G1 /G0 og G2 /M-faser (figur 1C). Den sovende status i denne undersøgelse kan være forskellige fra hvile, men foreningerne forbliver åbne spørgsmål.

Tumor vækstdvale er blevet undersøgt som den tilstand, som tumorer forbliver asymptomatisk i en lang periode, året i nogle tilfælde [37], [38]. To modeller eksisterer for tumor hviletilstand, tumormasse hviletilstand og tumorcelle hviletilstand. Den tidligere antager en tilstand af ligevægt mellem celledeling og celledød, mens der i sidstnævnte tilfælde tumorceller indtaste cellecyklusstop og forblive i hvile. Hypoxi-induceret hviletilstand identificeret i denne undersøgelse, som er resultatet af kronisk snarere end akut hypoxi, kan dele funktioner med sidstnævnte, men de vigtigste molekyler identificeret her er forskellige. I en epidermoid carcinom-cellelinie, for eksempel den resterende phospho-ERK og phospho-p38 MAPK er blevet rapporteret at være den molekylære kontakt til induktion af tumorcelle hviletilstand [39]. Signalering fra en ugunstige microenvironment eller celleoverfladereceptorer opregulerer phospho-p38 MAPK, og cellerne derefter indtaste G1 /G0 fasen. I modsætning hertil vigtigste begivenhed for induktion af inaktiv status i det nuværende arbejde var nedregulering af Pakt men ikke aktivering af p38 MAPK (figur 3A).

Blandt de fem cellelinier vi testede, kun aspC-1 celler kunne indtaste sovende status under betingelser med kronisk hypoxi (figur 1 og S1). I modsætning hertil kunne alle tre primære colorektale cancerceller undersøgt indgå en sovende tilstand under en kombination af hypoxi og vækstfaktor depletion (figur 5). Fordi cancercellelinier udvælges celler med en vækstfordel under dyrkningsbetingelser med høj oxygen, ernæring og vækstfaktorer, måske de har mistet evnen til at undertrykke proliferation under forringede forhold. Således kunne CTOS skabe en platform til at undersøge hviletilstand af cancerceller. Selv om hvilende cancerceller ikke direkte bidrager til tumorvækst, kan de være et reservoir og en kilde til tumorigene celler og kemoresistens. Mekanismen af ​​Pakt nedregulering under kronisk hypoxi kunne være et mål for nye lægemidler designet til at overvinde terapeutisk modstand.

Materiale og metoder

Etik Statement

Udarbejdelse og kultur af primær kolorektal kræft fra patienter blev godkendt af den etiske komité, Osaka Medical center for cancer og hjertekarsygdomme (OMCCCD), og kirurgiske prøver blev opnået ved skriftlig informeret samtykke. Dyreforsøg blev godkendt af OMCCCD Institutional Animal Care og brug Udvalg, og udføres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier.

Celler og cellekultur

En bugspytkirtelkræft cellelinje, AsPC-1, blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum. Hypoksisk kultur blev opnået ved at inkubere celler med 1% O

2 og 5% CO

2 i en Multigas Incubator (ASTEC, Fukuoka Japan). Celler blev podet ved en tæthed på 1 x 10

5 celler pr 35 mm skål for optælling celletal og 2,5 × 10

5 celler pr 60 mm skål for RT-PCR og Western blotting. Cellernes levedygtighed blev vurderet af trypanblåt udelukkelse farvestof analyse eller propidiumiodid (PI) farvning.

Primær kultur af kolorektal cancer

Forberedelse og kultur af primære colorektale cancerceller blev udført ved hjælp af CTOS metoden [28]. Kort fortalt blev kirurgiske prøver eller xenotransplantattumorer af NOD /SCID-mus delvist fordøjet med Liberase DH (Roche, Mannheim, Tyskland) og filtreret gennem celle filtre. Fragmenter på 100 um eller 40-um cellefilter (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) blev opsamlet og dyrket i StemPro hESC (GIBCO). For hypoksisk kultur blev CTOS prøver indlejret i BD Matrigel Matrix vækstfaktor Reduceret (GFR) (BD Biosciences, San Jose, CA) og dyrket i StemPro embryonale eller basale medium (DMEM F12 /Glutamax, 0,1 mM 2-mercapthoethanol, 2% bovint serumalbumin). For kemosensitivitet assayet under den inaktive periode, CTOS prøver blev for-dyrket i basal medium under 1% O

2 betingelser i 7 dage, og derefter behandlet med 5-FU eller SN38. Efter 7 dages eksponering for disse lægemidler blev CTOS prøver igen iltet, og dyrkningsmediet blev ændret til frisk StemPro embryonale. Salg

Cellecyklusanalyse Salg

aspC-1 celler blev dyrket i de angivne perioder og mærket med 10 uM BrdU for den sidste time af hver behandling. Cellerne blev farvet med 5 pg /ml PI og anti-BrdU-antistof (BD Pharmingen). Cellerne blev analyseret ved anvendelse af en Attune Acoustic Fokusering cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Måling af glucose og lactat koncentration

Glucose koncentrationen i dyrkningsmediet blev målt ved anvendelse Glucose Test 2 (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan). Lactat blev målt ved anvendelse af F-Kit L-mælkesyre (Roche, Darmstadt, Tyskland).

Måling af oxygenforbrug

Opløst oxygen blev målt ved anvendelse af en Clark-typen oxygen elektrode (Model 203 , Instech Laboratories).