PLoS ONE: Molekylær analyse af Prækursormaterialer Læsioner i familiær Bugspytkirtelkræft Cancer

Abstrakt

Baggrund

Med mindre end en 5% overlevelsesrate pancreas adenocarcinom (PDAC) er næsten ensartet dødelig. For at gøre en betydelig indvirkning på overlevelsen af ​​patienter med denne malignitet, er det nødvendigt at diagnosticere sygdommen tidligt, når kurativ kirurgi er stadig muligt. Detaljeret viden om den naturlige historie af sygdommen og molekylære begivenheder, der fører til dens progression er derfor afgørende.

Metoder og Resultater

Vi har analyseret precursor læsioner, PanINs, fra profylaktiske pankreatektomi eksemplarer af patienter fra fire forskellige slægter med høj risiko for familiær kræft i bugspytkirtlen, der blev behandlet for histologisk påvist Panin-2/3. Således blev materialet indkøbt

før

bugspytkirtelkræft har udviklet, snarere end fra PanINs i et væv felt, der allerede indeholder kræft. Hele genomet transskriptionsprofilering anvendelse af sådanne unika blev udført. Bulk frosne snit viser de mest omfattende, men ikke Mikrodissekterede Panin-2/3 læsioner blev anvendt for at opnå den holistiske syn på både precursor læsioner og deres mikromiljø. Et panel på 76 almindeligt dysreguleret gener, der ligger til grund for neoplastisk progression fra normale pancreas til PanINs og PDAC blev identificeret. Ud over delte gener blev også set nogle forskelle mellem de PanINs enkelte familier såvel som mellem PanINs og PDACs. Dette var særlig udtalt i det stromale og immunrespons.

Konklusioner

Vores omfattende analyse af prækursor læsioner uden invasiv komponent giver den endelige molekylære bevis på, at Panin læsioner avler kræft fra et molekylært synspunkt. Vi demonstrerer behovet for ophobning af transkriptom forandringer under udviklingen af ​​Panin til PDAC, både i epitel og i det omkringliggende stroma. En identificeret 76-gen underskrift PDAC progression præsenterer en rig kandidat pulje til udvikling af tidlige diagnostiske og /eller overvågning markører samt potentielle nye forebyggende /terapeutiske mål for både familiær og sporadisk pancreas adenocarcinom

Henvisning.: Crnogorac-Jurčević T, Chelala C, Barry S, Harada T, Bhakta V, Lattimore S, et al. (2013) Molekylær analyse af Prækursormaterialer Læsioner i familiær kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (1): e54830. doi: 10,1371 /journal.pone.0054830

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: 15. marts 2012; Accepteret: 17. december 2012; Udgivet: 23 Jan 2013

Copyright: © 2013 Crnogorac-Jurčević et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CRUK (https://www.cancerresearchuk.org/). TCJ er finansieret af finansiering af højere uddannelse Rådet for England (HEFCE); https://www.hefce.ac.uk/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA og dens frekvens har været stigende i de senere år [1]. På grund af manglende klinisk åbenlyse symptomer størstedelen af ​​patienter til stede med en dissemineret sygdom og er stort set uhelbredelig. Den abysmally lav overlevelsesrate blive kraftigt forbedret ved effektive metoder til tidlig påvisning, mens kræft stadig kirurgisk helbredes, med en mulighedernes vindue “for rettidig diagnose (f.eks præ-metastatisk stadium af kræft) er, ifølge en nylig rapport, mere end et årti [2]. Sådanne diagnostiske metoder vil næsten helt sikkert omfatter molekylær analyse, og alligevel meget få store studier for at undersøge processen for tidlige udvikling af kræft i bugspytkirtlen er blevet gennemført.

En bredt accepteret paradigme er, at PDAC udvikler sig gennem serier af forløber læsioner kaldet PanINs (pancreas intraepitelialneoplasi). Baseret på graden af ​​cellulære og nuklear atypia, disse læsioner fremskridt fra Panin-1, kendetegnet ved hyperplastisk kolonneformat duktalt epitel med noget nukleart atypia gennem Panin-2, der viser lav kvalitet dysplasi, til Panin-3 (carcinoma

in situ

), der viser højt differentieret dysplasi [3]. Lineariteten af ​​denne progression er stadig uklart, om end, baseret på en række rapporter, der viser hyppige Panin-1 læsioner i ellers raske mennesker, og under hensyntagen til den lave forekomst af PDAC forbundet med Panin-1, disse fase læsioner tidlige er formentlig ugidelig i naturen . I modsætning hertil bygger på tilgængelige molekylære data, Panin-2 og -3 læsioner er meget sandsynligt, at være de sande PDAC forstadier [4], [5].

En væsentlig hindring for detaljeret undersøgelse af PDAC evolution er opnå klinisk materiale fra Panin læsioner, hvilket er et særligt skræmmende opgave, eftersom patienterne er stort set asymptomatiske og disse duktale ændringer er typisk fokal. Faktisk Panin-2 og -3 læsioner er normalt tilfældige fund i patologiske sektioner af prøver med frank malignitet og er ofte ikke optaget i rutine histopatologisk vurdering.

I denne undersøgelse, for at rekonstruere den naturlige historie sygdommen, analyserede vi frisk frosset pancreasvæv, der havde dysplastiske Panin-2 og fokale Panin-3 læsioner som den mest avancerede histologiske abnormiteter i bugspytkirtlen, uden en ledsagende cancer. Dette er kritisk, da brugen af ​​dysplastiske læsioner fra adenocarcinom sager kunne risikere at medtage marken fejl og kanal cancerisation, der er fraværende i prøver, som stadig er kræft-fri. Sådant materiale vil ikke være tilfældigt rådighed; Det blev opnået fra højrisiko-patienter, der arver bugspytkirtelkræft og deltager i en cancer overvågningsprogram udviklet på University of Washington [6], [7].

Undersøgelsen af ​​familier, hvor kræft er nedarvet i en autosomal dominant mode har givet stor indsigt i den molekylære basis af sygdommen; nedarvede pancreascancer udgøre op til 10% af alle pancreascancer [8], [9]. Vi har analyseret fire familiær kræft i bugspytkirtlen (FPC) kohorter, Family X [10] og tre yderligere stamtavler (her betegnet ikke-X familier) og kontrast dem med normal bugspytkirtel og sporadisk kræft i bugspytkirtlen. Family X har en sjælden, stærkt penetrerende, autosomal dominerende form for FPC der er kendetegnet ved en kimcellelinje mutation i Palladin gen, en embryonisk protein, der regulerer cellemotilitet og invasion [11]. De ikke-X FPC familier var en heterogen population med ukendt kimcellelinje mutationsstatus; blev fundet nogen mutationer i CDKN2A (data ikke vist) og yderligere test for BRCA2, PALB2 og ATM blev ikke udført på grund af den generelt lave forekomst af disse genmutationer i FPC og den utilstrækkelige mængde materiale.

transkriptom og proteomiske [12] profilering af avancerede menneskelige PanINs fra sådanne familier er afgørende for at afsløre de molekylære forandringer ligger til grund for udvikling hen imod PDAC og kunne skabe en ramme for at udtænke nye overvågning, forebyggende og behandlingsmodaliteter.

Resultater

De stamtavler fire forskellige FPC familier med mindst to berørte medlemmer er vist i figur 1. Tre mindre Slægter (A, B og C) har i tillæg til PDAC også andre faste maligniteter, mens Family X (X) , som er karakteriseret ved tidlig debut sygdom og ofte forudgået af endokrine (Diabetes mellitus) og eksokrin [10], [13] er kun påvirket af PDAC. Patienterne fra der blev opnået prøver cirkel i figur 1; patienternes kliniske oplysninger er sammenfattet i tabel 1.

(A-C) ikke-X familier og (X) Familie X.

Figur 2 viser, at familiær PanINs lignede sporadiske PanINs; Men mens områder af tilstødende, normalt udseende bugspytkirtlen (markeret med *) blev set i de ikke-X prøver, udtalt udbredt acinært atrofi, fibrose og multicystic udseende blev kun set i familie X.

Det øverste panel viser histologi af tre medlemmer af ikke-X-familier (A1, B1 og C2). Billeder øverst show Panin-1 og -2 læsioner (forstørrelse x 100); og billeder nederst show Panin-3 læsioner fra familie B og C; forstørrelse × 200). Det nederste panel viser histologi af tre forskellige medlemmer af Family X: X1, X5 og X6 i toppen vise deres brutto udseende (forstørrelse × 20); billeder nederst show Panin-1 fra X1 prøve (forstørrelse x 100); og Panin-3 læsioner fra X5 og X6 (forstørrelse x 200). * Angiver tilstødende histologisk normalt udseende væv.

Hele transkriptom analyse

Gen-ekspression af 13 Panin prøver blev sammenlignet med profilering data for hele biopsier fra normalt donor bugspytkirtlen (N1 til fire, to replikerede prøver) og sporadisk PDAC (PDAC1 til 6). Unsupervised hierarkisk klyngedannelse viste en klar adskillelse af prøver i fire forskellige klynger; non-X og Family X PanINs faldt i to diskrete grupper, idet førstnævnte tættere på normale prøver, mens PDACs dannede en enkelt fjernt klynge (Figur S1).

De mest almindeligt opreguleret gener i alle PanINs sammenlignet til de normale prøver var AGR2, S100P, TFF1, LDLR og EMP1 og nedreguleret var OLFM4, REG3G, REGL1, og NMU. Da Panin prøver blev sammenlignet med PDACs, de mest almindeligt opreguleret gener i kræftformer var POSTN, COL1A2, SULF1, FN1, IGHM, VCAN og XIST, og disse nedreguleres var PGC og PPY.

Venn-diagram i Figur 3A viser det samlede antal af gen ændringer på tværs af de tre sammenligninger (ikke-X, X og PDAC) versus normal pancreas og viser det samlede lavere antal differentielt udtrykte gener mellem ikke-X vs normale pancreas sammenlignet med Family X vs normalt væv. Mens dette er delvist på grund af tilstedeværelsen af ​​de resterende normale forekommende væv, der var mere rigelige i ikke-X prøver, som andelen af ​​delte deregulerede gener i Family X og sporadiske PDACs (900/2292, 39%) var højere end i ikke -X familier (125/443, 28%), dette kunne potentielt også ligge til grund for den højere aggressivitet af Family-X PanINs, manifesteret i deres tidligere kliniske præsentation. Dette blev også set ved anvendelse af IPA Multiple sammenligning analyse: den mest betydningsfulde “Molekylær og cellulære funktioner”, som omfatter størstedelen af ​​kræft kendetegnende [14] (Figur 4A) er alle i stigende grad påvirket under neoplastisk progression fra Panin-2/3 til PDAC og er konsekvent højere i Family X end i ikke-X familier. Notatet graferne viser betydningen af ​​modulerne snarere end antallet af berørte gener eller retningen af ​​deres ændringer

(A) Venn-diagram viser antallet af fælles og unikke sonder i PDAC progression.; (B) Heatmap af 93 almindeligt dysreguleret prober (76 gener) er vist til højre. Hver kolonne repræsenterer en type sammenligninger og hver række repræsenterer et gen probe. Niveauet for op- og nedregulering er repræsenteret ved intensiteten af ​​den røde og grønne farve, henholdsvis.

(A) De væsentlige funktionelle moduler almindeligt ændret under overgangen fra normale bugspytkirtlen til Panin og PDAC er vist. (B) Forskelle i mest markant påvirket kanoniske veje mellem PanINs og PDAC prøver præsenteres. De vandrette linjer parallelle med x-aksen i begge billeder indikerer en P = 0,05 tærskel.

Ud over fælles træk, forskelle mellem ikke-X og X PanINs og PDAC prøver blev også set, især i den “syvende kendetegnende for kræft«, immune funktioner [15], [16]. De mest berørte kanoniske veje er vist i figur 4B. Den højest rangerende “Antigen Præsentation” blev overvejende påvirket i ikke-X familier, med faldet i de centrale elementer i antigen-præsentere maskiner (CD74, HLA-A /B, HLA-DMA, HLA-DRA /B1, HLA-DQA1 /B1, HLA-DPA1 /B1). I modsætning hertil antigenpræsentation i Family X forekom mere lig de normale pancreas, mens PDAC blev karakteriseret ved opregulering af HLA-B, HLA-DPA1, HLA-DQA1, HLA-DRB4, TAP2, såvel som gener involveret i migration af antigen-præsenterende celler dvs. DMBT1 og CD29, som ikke ændres i familiær PanINs. Dendritiske celle migration og makrofag rekruttering blev også nedreguleret i ikke-X familier (fald i CXCL12, CXCR4, VCAM-1 og ICAM2 udtryk).

humorale immunrespons blev også væsentligt påvirket i ikke-X familier, med lavere ekspression af RGS1 (B-celle-udvikling, aktivering og proliferation [17]) og komplementsystemet, nemlig C3, C1QA /B /C, C4b, CFB og SERPING1 (figur 4B). I modsætning hertil EBF1, IL7R og PRDM1 /BLIMP1 var opreguleret kun Family X, mens opregulering af POU2AF1 og BCL6 (B cellevækst, modning og dannelse af kimcentre) [18]) blev set i både Panin-X og PDAC prøver. I PDAC kun blev C3, C1S, og CD55 opreguleret, og PDAC var præget af en stærk pro-inflammatorisk reaktion (opregulering af TGFB1, TGFBR1, STAT2, STAT6, SPP1, LIF). Som BCL6 nylig blev vist at være en af ​​de 12 stromale gener, der kan skelne preinvasive fra invasiv sygdom i esophageal carcinoma baseret på profilering af mikrodissekeret stroma kun [19], har vi udvalgt dette gen til validering i pancreas væv. Vi viser, at den øgede BCL6 udskrift ( 2 gange) set i Panin-X og PDAC er bidraget med stærke kernekraft immunoreaktivitet i stromale inflammatoriske celler (figur 5A). Af 24 Panin læsioner på TMA1, 16 (67%) viste inflammatorisk infiltrat, hvoraf ni (56%) (2/2 Panin-1, 4/7 Panin-2 og 3/7 Panin-3) omfattede BCL6 positive celler. Af 15 PDAC tilfælde, 13 (87%) omfattede inflammatorisk infiltrat; 11 af disse (85%), herunder fire cancere med PanINs viste BCL6 immunreaktivitet.

(A) Repræsentative billeder af BCL6 positive celler (brun farvning) i stroma i nærheden af ​​Panin læsioner er vist i top to paneler (både forstørret × 100); to nederste billeder viser inflammatorisk infiltrat med BCL6 immunreaktive celler i to PDAC tilfælde (forstørrelse x 100 og × 50, henholdsvis). (B) HMGB1 nukleare udtryk (brun farvning) blev set i alle pancreas rum, herunder stromale immune infiltrat: top paneler viser Panin-1 (venstre) og -2 (højre) (forstørrelse x 50, indsætte og andet panel x100); bundpaneler viser Panin-3 (venstre) og PDAC (højre) (forstørrelse × 100 og × 50, henholdsvis).

En prototypisk molekylær mønster skader-associerede (DAMP) af HMGB1 /2 signalering var også tydeligt, overvejende Panin-X og PDAC (figur 4B); denne vej signaler gennem RAGE [20]. At etablere lokalisering og ekspression af HMGB1, blev IHC analyse udført (figur 5B). Den nukleare immunoreaktivitet blev set i både exokrine og endokrine celler, såvel som i immun- stromale komponent. HMGB1 ekspression blev set i 67% (16/24) af PanINs (3/4 Panin-1, 5/10 Panin-2 og 8/10 Panin-3) fra TMA1 i alle PanINs fundet inden for 15 PDAC sager og i 13 /15 (87%) PDAC læsioner (to PDAC sager uden /svag udtryk var dårligt differentieret). Notatet har HMGB1 udtryk allerede blevet forbundet med forskellige kræftsygdomme (for gennemgang se [21]). I PDAC blev serum HMGB1 nylig rapporteret at korrelere med scenen, resectability og tidlig vs sene PDAC [22]

DAMP superfamilien inkluderer også S100 gener, hvoraf flere var op-reguleret i Panin-X:. S100A4 , S100A6, S100A7A, S100A10, S100A13 og S100A16. Deregulering af S100A2 og S100A11 blev desuden set i PDAC, mens S100P var almindeligt opreguleret i alle Panin læsioner (X og ikke-X) og PDACs, yderligere underbygger betydningen af ​​S100 gener i udviklingen og progressionen af ​​FPC som set i sporadisk sager [23], [24]. Yderligere kanoniske veje, hvis betydning øges med kræft progression var cytoskelet og motilitet /invasion ( ‘aktincytoskelettet signalering “,” Regulering af actin-baserede motilitet af Rho “og” Ephrin signalering) (tabel S1); vedhæftning ( ‘Integrin signalering’, ‘ILK signalering “og” FAK signalering) (tabel S2); og stromal respons, med højere udtryk og antal ECM gener ses som PanINs videre til PDAC (figur 4B). Et stort antal af disse klynger inden ‘Nedsat fibrose og stjerneformet celle aktivering «(tabel S3) og kan potentielt repræsentere aktivering af pancreas stjerneformige celler, som er blevet rapporteret til at have meget lignende profiler til hepatiske stjerneformige celler [25]. Endvidere foruden COL1A1, COL1A2 og COL3A1, andre collagener (COL4-6A2 og COL12A1), og ECM-gener (BGN, VCAN, DCN, SPARC, SPON1 og THBS1) var opreguleret i Panin-X læsioner og PDACs; i PDACs blev stromal inddragelse karakteriseret ved en endnu højere mangfoldighed af collagener (COL10A1, COL11A1, COL14-16A1 og COL18A1 blev yderligere set), og endog højere ekspression end i Panin-X læsioner af ECM-gener er nævnt ovenfor. Vigtigere er det, COL11A1 blev for nylig vist sig at være en specifik markør af pancreas stjerneformige celler [26], hvilket indikerer, at deres ophobning især er udtalt i PDAC. Signifikant akkumulering af matrix metalloorganiske proteinase og cysteinproteinaser blev set allerede i Panin-X læsioner ,, med øget MMP1, MMP2 og MMP19, og CTSC, CTSE og CTSK hhv. Yderligere proteaser (MMP7, MMP9, MMP11, MMP14, MMP28 og CTSA og CTSB) blev dereguleret kun PDAC prøver.

Family X prøver afveg fra både ikke-X PanINs og PDACs i dereguleringen af ​​en række gener, involveret i insulin signalering og diabetes (INSR, IRS1 og 2, IGF1, IGFBP2-BP7, CASR, ADIPOQ og NR5A2); Dette er illustreret i figur S2 og S3, med tilhørende diskussion).

Sammenligning af familiemæssige PanINs til data fra sporadisk PDACs

Flere sammenligninger af vores data med tidligere offentliggjorte rapporter blev opnået ved hjælp af bugspytkirtlen Expression database (https://www.pancreasexpression.org/). Når data fra ikke-X og X PanINs blev sammenlignet med offentliggjorte profiler fra Mikrodissekterede PanINs fra sporadiske PDACs [5], [27], blev 44 og 185 deregulerede gener delt henholdsvis (tabel S4). Tre af de almindeligt deregulerede gener lykkedes valideret af QRT-PCR: AGR2, S100P og EGR1. Derudover blev højere udtryk for FOS i Family X PanINs og størstedelen af ​​PDACs også bekræftet (figur 6)

QRT-PCR-analyse valideret den differentierede udtryk for AGR2, S100P, FOS og EGR1 i primære Panin læsioner.: PanA1, B1-3 og C1,2 repræsenterer ikke-X familier, mens PanX1 og 3 hører til Family X prøver; PDAC1-7 repræsenterer syv forskellige PDAC prøver.

Når ikke-X og X Panin data blev sammenlignet med dissekerede og bulk sporadiske PDAC profiler (referencer er anført i pancreas Expression database), omkring 5% og 25 % overlap blev set henholdsvis. Dette er mindre end blev set i vores Panin vs PDAC sammenligning og det er i høj grad tilskrives forskellige platforme og eksperimentelle teknikker, der anvendes.

Endelig ikke-X og X Panin transcriptomes blev sammenlignet med vores Panin-3 proteomanalyse [ ,,,0],12], 46/900 (5%) og 132/900 (15%) proteiner matches RNA-transkripter, henholdsvis; disse data uafhængigt validere vores resultater på proteinniveau (tabel S5A og B).

Fælles Panin-PDAC progression gen signatur

Heatmap i figur 3B og tabel S6 vise de 93 sonder, der repræsenterer 76 almindeligt differentielt udtrykte transkripter tværs af alle sammenligninger (X vs Normal, non-X vs Normal, PDAC vs Normal).

Mere end 10 forskellige enzymer blev almindeligt nedreguleres, herunder de der er involveret i syntesen ettaller og katabolisme af amino syrer (NMU, BCAT1, miljøpolitiske årsberetninger, SARS, yars, PSAT1); desuden deregulering af flere opløste luftfartsselskaber peger på en forringet aminosyre transport (SLC1A2, SLC1A4, SLC25A22). Expression ændringer i SLC20A1, en natrium-phosphat symporter, og KCTD14 (kalium kanal tetramerisation domæne-holdige-14) foreslår forringet ion transport samt.

Almindeligt udtrykte stromale gener omfatter COL1A1, THBS1, FMOD og SERPINE1 tværs alle Panin læsioner og PDAC. COL1A1, en vigtig komponent i bugspytkirtlen desmoplasia fremmer invasion og metastase i PDAC [28]. Forøget ekspression af THBS1 er en prognostisk indikator for øget invasivitet i PDAC [29] og korrelerer med progressionen af ​​metaplasi-dysplasi og cancer i spiserøret [19]. Derudover THBS1 øger også ekspressionen af ​​SERPINE1 [30], som er beskedent opreguleret i både ikke-X og X PanINs og stærkt opreguleret i PDAC. Derfor, mens disse stromale gener tidligere har været forbundet med PDAC, viser vi, at de allerede er over-udtrykt i Panin læsioner før dannelse kræft.

En af de vigtigste regulatorer af NFkB vej, NFKBIZ, ses dereguleret i alle PanINs. Dens opregulering kan bidrage til øget inflammation i bugspytkirtlen, der favoriserer tumorudvikling [31]. Ekspression af et interleukin-receptor, IL22RA1, blev reduceret i PanINs og PDACs, men da dette gen hovedsagelig udtrykkes i ø-cellerne [32], ø-celle tab potentielt kunne forklare en sådan resultat. CXCL12 blev også almindeligt berørt; Det spiller en rolle i kræft spredning /metastaser via interaktion med dets receptor CXCR4. Både CXCL12 og CXCR4 blev nedreguleret i ikke-X PanINs, mens kun CXCL12 nedreguleres i Panin X læsioner, og CXCR4 niveauer er normal. I modsætning hertil viste PDACs forøgede niveauer af CXCR4; . Dette er et veletableret element i mange cancertyper [33], og er en indikator for dårlig overlevelse i PDAC [34]

Der blev også fundet flere transkriptionelle faktorer opreguleret i både PanINs og PDACs: KLF3, KLF6 og EGR1.

Endelig REG3G og REGL, markører for bugspytkirtlen skade [35] var konsekvent under-udtrykt i både PanINs og PDACs, og indikerer tab af acinære celler under PDAC udvikling.

i silico

sammenligning af vores 76 almindeligt differentielt udtrykt Panin /PDAC udskrifter med vores sporadiske og familiære Panin-3 proteomics data ([12], og upublicerede data) fremhævede udtryk for ni af de 76 gener også på proteinniveau: ACTA2, AGR2, AHCY, COL1A1, COPB2, HSPA5, HSPA8, S100P og TFF1, giver således en uafhængig validering af vores profilering data. Mens vi tidligere har vist, at AGR2 udtrykkes i både sporadiske og familiære PanINs [36], vi her yderligere valideret TFF1 ved IHC under anvendelse sektioner afledt fra Family X væv (figur 7). Dette viste den næsten universelle udtryk for TFF1 i de familiære precursor læsioner (5/10 Panin-1, 9/9 Panin-2 og 4/4 Panin-3) som vist tidligere i sporadiske tilfælde [37].

Panel (A) viser Panin-1 uden TFF1 immunreaktivitet, (B) og (C) Panin-2 og (D) Panin-3 læsion i centrum med stærk TFF1 ekspression (alle forstørret x100).

diskussion

Mens tidlig beskrivelse af PDAC forstadielæsioner daterer sig tilbage til 1950 [38], og den hypotese, at atypisk hyperplasi og karcinom

in situ

er forløbere for PDACs er mere end 30 år [39], den konsensus Panin nomenklatur blev etableret relativt nylig [3].

på trods af flere detaljerede histologiske og kliniske undersøgelser [40], og en rapport om øget forekomst af Panin læsioner i både sporadisk [41 ] og familiære PDAC patienter [42], er vores viden om de underliggende molekylære begivenheder i disse prækursorer læsioner stadig begrænset. Dette skyldes i høj grad den manglende adgang til Panin prøver.

Her har vi analyseret Panin-2/3 læsioner fra pankreatektomi prøvemateriale fra FPC

uden

tilstedeværelsen af ​​invasive karcinom, hvilket er kritisk da det ofte er vanskeligt at skelne mellem sande Panin-3 læsioner og cancerisation af kanaler ved veldifferentieret invasiv cancer i prøven, der indeholder begge. Kun to lignende undersøgelser små er blevet rapporteret om Panin læsioner påvist i fravær af kræft: Zhang et al [43] analyserede KRAS mutationer og protein udtryk for p53, p16 og cyklin D1 i PanINs i tumor-fri heterotopisk bugspytkirtel af PDAC patienter og Baumgart et al [44] analyserede Panin prøver fra en patient med kronisk pancreatitis, der havde Panin-3 læsioner; begge undersøgelser direkte bevis for Panin-PDAC progression model. De omfattende molekylære analyser præsenteres her ikke kun giver endelig støtte til progression model, men også muligt for os at undersøge de underliggende molekylære veje og vurdere ligheder mellem de sporadiske og familiære prækursorer læsioner på en genom-plan.

Mens lignende forekomst af ‘signatur’ mutationer i sporadiske og familiære PDAC prøver tidligere er blevet rapporteret [45], og mutation analyser i Family X var i overensstemmelse med disse oplysninger [6], vi nu vise, at på transkriptomet niveau, Panin læsioner i vores familiære tilfælde har også gennemgået lignende ændringer som dem, der ses i sporadisk cancer. Baseret på sammenligning af data fra SEER (Surveillance Epidemiologi og slutresultater) database og data om familiær PanINs fra Brune et al [46] Schwartz og Henson [47] foreslog, at familiær PDACs kan have lignende eller overlappende veje til dem af sporadiske tilfælde. Vi har nu give molekylære beviser for, at dette er tilfældet

To transkriptom undersøgelser af sporadiske PanINs i fastsættelsen af ​​kræft i bugspytkirtlen er blevet rapporteret.; Prasad et al [27] sammenlignede Mikrodissekterede Panin-1B /2 læsioner med normale kanaler; Buchholz et al [5] brugte mikrodissekeret materiale at sammenligne PanINs af alle kvaliteter til normale kanaler og PDACs, viser en støt stigning i antallet af differentierede udskrifter med fremskreden dysplasi. Disse undersøgelser anvendte skræddersyet cDNA og oligo-baserede arrays, henholdsvis med forstærket fluorolabelled materiale fra sporadiske PDACs; vi brugte meget større dækning Affymetrix arrays med uforstærkede materiale fra beriget primære Panin-2/3 læsioner, der fandt sted i fravær af kræft. Overlappet mellem generne på tværs af de tre undersøgelser var omkring 4% for ikke-X PanINs og 18% for Family X PanINs. I betragtning af den begrænsede kongruens rapporteret mellem profilering undersøgelser [48] og forskellene mellem de tre datasæt, det er i virkeligheden en hel del overlap. Opdagelsen af ​​fælles gener gennem sådanne forskellige undersøgelser viser, at disse er robuste gener ensartet dereguleret under Panin progression.

Baseret på mængden af ​​transkriptionelle ændringer i PanINs afledt af Family X og ikke-X familier, med omkring 40% af delte differentierede udskrifter med PDAC, de Panin læsioner i Family X optrådte mere molekylært afstemt til kræft. Disse transkriptionelle ændringer afspejler både den histopatologiske og klinisk mere aggressiv billede, som PDAC i Family X udvikler -20 år tidligere (median 40 år) og kræft i ikke-X familier 5-10 år tidligere (median 54 år) end i sporadisk cancer

de mest markante forskelle mellem Panin læsioner fra Family X og ikke-X familier blev set i immunresponset:., mens det inflammatoriske respons i ikke-X familier var generelt mangelfuld, med betydelig underrepræsentation af gener i antigenpræsentation og humorale respons veje, immunresponset profil i Family X var i mange aspekter ligner PDAC. Interessant, opregulering af KIT, blev dens ligand KITLG /SCF og tryptase TPSAB1 set allerede i Family X PanINs. KIT er en proto-onkogen forbundet med flere tumorer, der forbedrer proliferation og invasion af bugspytkirtelkræft cellelinjer [49]; KITLG /SCF og TPSAB1 er mast cellemarkører indikerer en tidlig infiltration af stroma omkringliggende PanINs med mastceller. En pro-inflammatorisk miljø bestående af makrofager og mastceller har vist sig at fremme cancervækst og invasion [50], [51]; mastcelle inhibering er blevet foreslået som en terapeutisk strategi til PDAC [52]

En yderligere mærkbar forskel ses mellem PanINs afspejler Family X histologi, som viser en omfattende desmoplastiske ændring.; dette blev karakteriseret med både højere ekspression og forøget antal stroma-associerede gener, hvilket indikerer, at stroma co-udvikler sig med epiteliale elementer i PDAC forstadielæsioner. Lignende resultater er blevet rapporteret i bryst precursor læsioner, hvor omfattende genekspression ændringer i stroma er forbundet med duktalt carcinoma in situ (DCIS) [53]. Yderligere betydelige stigninger i ekspressionen af ​​stromale gener blev set i vores PDAC data betydningen af ​​stroma i biologi sporadisk pancreascancer er velkendt [54], [55]. Alt sammen indikerer disse data, at samarbejdsvillige transkriptionelle ændringer i både tumor og dens mikromiljø kan dramatisk ændre den naturlige historie af sygdommen, og at overvåge begge rum kan også give en bedre indikator for bugspytkirtelkræft evolution i familiær omgivelser.

Seventy-seks almindelige gener ensartet ramt hele sygdommens udvikling og synes at være afgørende for neoplastisk progression i bugspytkirtelkræft, uanset om det er sporadisk eller familiær. Inden for dette gen sæt, fremhæver vi to gener, S100P og AGR2, der med COL1A1 viser den højeste overekspression i både Panin og PDAC læsioner i den aktuelle analyse samt i vores tidligere offentliggjorte data. Begge har allerede været involveret i udvikling og progression af sporadisk PDAC: S100P udtryk stiger med Panin klasse [24], og AGR2 er ensartet udtrykt fra tidligste Panin-1 læsioner [36], [56]. Da disse to proteiner er også udtrykt i familiær læsioner de repræsenterer lovende diagnostiske, præventive og terapeutiske mål.

De 76 fælles gener observerede er markører for dysplastiske læsioner, der ligger til grund for neoplastisk progression, vi derfor foreslå, at denne kerne neoplastisk profil måske være nyttig i monitorering af Panin progression og kunne danne grundlag for udformningen af ​​en molekylær test, der skal anvendes i forbindelse med EUS /MRCP overvågning. Mens antallet af berørte medlemmer i de beslægtede stiger risikoen for PDAC udvikling, da de varierende risici for PDAC mellem Slægter med heterogene kliniske syndromer, er det en udfordring at skelne de patienter, der vil udvikle hurtige neoplastisk progression fra dem med stabil sygdom, og at identificere, hvilke grupper vil drage størst fordel af en omfattende bugspytkirtlen program kræft overvågning. I øjeblikket, hvis unormal EUS og MRCP resultater berettiger en væv diagnose, er en delvis pankreatektomi med detaljeret histopatologisk undersøgelse udført. Optagelse af et ekstra, følsom molekylær analyse, kunne være medvirkende til beslutningen om hvordan vi kommer videre (yderligere overvågning versus pankreatektomi).