PLoS ONE: samspil mellem Lung Cancer Cells, fibroblaster og makrofager i 3D co-kulturer og indvirkningen på MMP-1 og VEGF Expression

Abstrakt

In vitro

cellebaserede modeller for lungekræft ofte anvendes til at studere invasion og mekanismerne bag metastase. Men disse modeller ofte studere, kun én celletype med todimensionale (2D) monolag cellekulturer, der ikke præcist afspejler kompleksiteten af ​​betændelse

in vivo

. Her blev en tredimensional (3D) celle co-kultur kollagengel model anvendes, indeholdende humane lunge adenocarcinoma celler (HCC), humane lunge fibroblastceller (MRC-5), og makrofager. Celledyrkningsmedier og celle billeder blev indsamlet, og matrixmetalloproteinase-1 (MMP-1) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) produktion blev overvåget under forskellige celledyrkningsbetingelser. Vi fandt, at simulerer hypoxi og /eller serumudsultning betingelser induceret forhøjet sekretion af VEGF i 3D co-kultur model

in vitro

, men ikke MMP-1; morfologi HCC i 2D versus 3D co-kultursystem var yderst forskellige. MMP-1 og VEGF blev udskilt i højere niveauer i blandede cellegrupper snarere end mono-kultur grupper. Derfor inkorporerer lungekræft celler, fibroblaster og makrofager kan bedre afspejler fysiologiske metastase mekanismer i forhold til mono-kultur-systemer. Tumor stromale celler, makrofager og fibroblastceller kan fremme invasion og metastase, som også giver en ny retning for design af terapier rettet mod at ødelægge stroma af tumorvæv

Henvisning:. Liu XQ, Kiefl R, Roskopf C, Tian F, Huber RM (2016) Interaktioner blandt Lung Cancer Cells, fibroblaster og makrofager i 3D co-kulturer og indvirkningen på MMP-1 og VEGF Expression. PLoS ONE 11 (5): e0156268. doi: 10,1371 /journal.pone.0156268

Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: 27. september 2015; Accepteret: 11 maj 2016; Udgivet: May 27, 2016

Copyright: © 2016 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Rapporter om pulmonale maligniteter dato så langt tilbage som oldtiden, og i midten af ​​det tyvende århundrede, var lungekræft blevet epidemi og blev fast etableret som den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i Nordamerika og Europa, efter indførelsen af ​​billige, masseproducerede cigaretter [1]. På nuværende tidspunkt, lungekræft er den mest almindelige form for kræft på verdensplan, der tegner sig for mere end 1.350.000 tilfælde om året [2]. Trods betydelige fremskridt i behandlingen af ​​de tidlige stadier af sygdommen, overlevelsesrater for fremskredne stadier af lungekræft fortsat lavt; de fleste sene stadie lungekræftpatienter dør inden for 18 måneder diagnose [3]. Akkumulerende beviser viser, at mens de fleste kræftforskere fokuserer udelukkende på lungekræft celler, der er en stigende erkendelse af, at tumor mikromiljø (TME) og tumor-stromale interaktioner spiller en vigtig rolle i processen med lungekræft etablering, invasion, og metastase. Tumor stroma består af både ekstracellulær matrix (ECM) og cellulære komponenter. ECM omfatter udskilte proteoglycaner, der spiller både en strukturel og celle-signalering rolle. Cellulære komponenter omfatter immunceller, cancerassocierede fibroblaster (cafeer), endotelceller, adipocytter, knoglemarvafledte celler, myofibroblaster og fibroblaster [4]. Funktionelle genomiske studier har identificeret gen signaturer, som er prognostiske for ikke-lille lungekræft (NSCLC) overlevelse, herunder gener, der koder ECM-proteiner [5], der fremhæver betydningen af ​​stroma i patientens prognose og overlevelse.

i denne undersøgelse valgte vi at undersøge MMP-1 og VEGF som indikatorer for interaktionen mellem tumor og stromaceller, fordi begge er blevet klart forbundet med tumorinvasion og metastase. Tidligere undersøgelser viser, at MMP spille en fremtrædende rolle i kræft [6]. MMP’er kan nedbryde forskellige proteiner forbundet med ECM. Som et resultat heraf kan tumorceller bevæge lettere under processerne for invasion og metastase. MMP-1 hører til MMP familien og er kendt som collagenase eller gelatinase, som nedbryder kollagen IV og forøges i stærkt metastatiske cancerceller [7]. VEGF blev identificeret og isoleret som et endotelcelle-specifikt mitogen, som har kapacitet til at inducere fysiologisk og patologisk angiogenese afgørende for at skabe nye blodkar [8, 9]. I en fast tumor, under ekspansionsprocessen, de centrale dele af tumoren bliver hypoxiske, som fremmer VEGF-produktion og dermed spredning af tumoren [10]. Derudover har nyere undersøgelser vist, at VEGF-inducerede aktiviteter i tumorceller omfatter tumorinvasion og metastase [11].

De fleste forskergrupper har anvendt cellemonolag dyrket på vævskultur plast, som er mindre kompleks, mindre fleksibel, og ikke meget repræsentativ for den fysiologiske ekstracellulære mikromiljø stede i mennesker [12]. Når celler dyrkes på de stive plastoverflader af dyrkningskolber, de kun kan vokse væk fra plasten i en 2-dimensional (2D) måde. Desuden er mange undersøgelser viser, at 2D-cellekulturer ikke kan afspejle tilstrækkeligt den fysiologiske kompleksitet reel væv, og deres anvendelse i cellebaserede assays til en vis grad kan resultere i fejl forudsige vævsspecifikke responser. Celler dyrket i 2D formater undergår spredning og derefter de-differentiering dermed miste deres væsentlige funktioner [13]. I modsætning hertil celler dyrket i en 3D-matrix er dramatisk forskellige med hensyn til proliferation, differentiering, morfologi og cellulære funktionalitet [14, 15]. I denne undersøgelse har vi etableret en organotypisk co-kultur model bestående af lunge adenocarcinom-celler (HCC), lungefibroblaster (MRC-5) og immunceller (makrofag), som ikke kun gør det muligt for udforskning af interaktionerne mellem tumorceller og stromale celler, men også repræsenterer en model, der er mere reflekterende af de betingelser tilstedeværende

in vivo

.

Materialer og metoder

Cell kultur

Alle celle linjer blev leveret af Medical Clinic V Laboratorium Ludwig-Maximilians Universitet. MRC-5 celler blev dyrket i Eagles Minimum Essential Medium (LGC Standards GmbH, Wesel, Tyskland). For at gøre det komplette dyrkningsmedium, vi tilføjet kalvefosterserum (FBS) i en endelig koncentration på 10%. HCC-celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS (Biochrom AG, Berlin, Tyskland). Makrofager blev dyrket i Hams F-12 K-medium (LGC Standards GmbH, Wesel, Tyskland) suppleret med 100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin opløsning, og 2 mM L-glutamin (PAA).

3D kollagengel co-kultur model

Før fremstilling af kollagengelen blev celler optøet og fortyndet til 2 x 10

5 celler pr. Forholdet mellem cellerne blev etableret som følger: 5: 5: 1 HCC: MRC-5: makrofag. For Western blot-analyser blev celler placeret i 2 x 10

5 og 1 x 10

6 celler per gruppe. Til fremstilling gelerne, collagen (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland), steril 10X phosphatbufret saltvand (PBS), sterilt destilleret vand (ddH

2O) og sterilt 1 N NaOH blev blandet på is. Den samlede mængde af kollagen gel blev beregnet som følger:.

I et sterilt rør blande dH

2O, 1N NaOH, og 10X PBS

Den endelige koncentration af collagen var 1 mg /ml og 0,5 ml blev dispenseret i hver dyrkningsskål rum og øjeblikkeligt anbragt på is. Cellerne blev derefter podet i kollagengelen, som blev pipetteret flere gange for at blande godt. Gelerne blev fjernet til stuetemperatur, hvor de størknede hurtigt. Kulturer blev derefter inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator i 30-40 minutter, eller indtil en fast gel var dannet. Hver skål rum modtog derefter et samlet volumen på 1,0 ml dyrkningsmedium.

Western blotting

Cell kultursupernatanter blev opsamlet efter 48 timer. Vivaspin rør (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Tyskland) blev anvendt til at indsamle proteiner fra supernatanten, der havde en højere molekylvægt end 30 kDa. Proteinkoncentrationer blev målt med et ikke-forstyrrende proteinassaykit (Calbiochem, EMD Bioscience Inc., Darmstadt, Tyskland) under anvendelse af et bovint serumalbumin (BSA) standardkurve (Bio-Rad Laboratories, Munchen, Tyskland)

en anti-MMP-1-antistof produceret i mus blev anvendt (Sigma-Aldrich Saint Louis, USA) med en gede-anti-muse-sekundært IgG-HRP-antistof (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Tyskland). 40 ug protein fra hver prøve blev fortyndet med prøvepuffer, mens ddH

2O blev tilsat til et endeligt volumen på 35 pi. Membranerne blev blokeret i blokerende buffer ved stuetemperatur i mindst 1 time og bagefter inkuberet med primært antistof natten over ved 4 ° C. De primære antistoffer blev fortyndet 1: 200 i blokeringspuffer. Membranerne blev inkuberet med fortyndet 1: 5000 HRP-konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur den følgende dag. Billeder blev analyseret under anvendelse billede reader LAS-R-software (Leica Microsystems, Tyskland). IOD (integreret optisk densitet) værdier blev genereret /analyseret med Gel-pro analysator software (Media Cybernetics USA).

HCC og makrofagceller

Celler blev vasket to gange med forvarmet (37 ° C) PBS for at fjerne eventuelle celledyrkningsmedium. Vi derefter tilsat 10 ml forvarmet (37 ° C) CFDA SE Cell Tracer arbejdsopløsning (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). Cellerne blev derefter inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C. Vi derefter erstattet fyldningsopløsningen med frisk, foropvarmet medium og inkuberet kulturerne i yderligere 30 minutter ved 37 ° C. Denne teknik farves HCC, makrofagceller og MRC-5-celler i 3D-kollagengel model tidligere beskrevet. Efter 48 timers co-dyrkning blev celle morfologier observeret ved konfokal mikroskopi.

Frosne sektioner af kollagengeler farvet med Phallotoxins og DAPI

Frosne sektioner blev fremstillet efter 48 timers 3D kollagengel co-kultur, og prøverne blev monteret på dækglas ved stuetemperatur i 30 min. Prøver blev derefter vasket tre gange med PBS i 3 min hver gang. Prøver blev herefter fikseret i 3,7% formaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Prøver blev derefter vasket yderligere tre gange med PBS. Hver dækglas blev derefter anbragt i et glas petriskål og ekstraheret med en opløsning af 0,1% Triton X-100 i PBS i 3 til 5 minutter og vaskes igen tre gange med PBS. Når farvning med de fluorescerende phallotoxins (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland), vi fortyndet 5 pi methanolisk stamopløsning i 200 pi PBS i hvert dækglas, der skal farves. For at reducere ikke-specifik baggrund farvning med disse konjugater, vi tilsat 1% BSA til pletten opløsning. Dækglas hvor dernæst anbringes i farvningsopløsning i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter farvning blev dækglassene vasket tre gange med PBS. Modfarvning blev udført med DAPI (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). DAPI stamopløsning blev fortyndet til 300 nM i PBS, og ca. 300 pi af denne DAPI farvning opløsning blev tilsat til dækglasset forberedelse dækker fuldstændig dækglas. Dækglas blev inkuberet i 1-5 minutter og skyllet tre gange i PBS i 10 min. Prøverne blev derefter afbildes under anvendelse af et fluorescensmikroskop. Prøverne blev lufttørret, monteret, og opbevaret i mørke ved 2-6 ° C.

Elisa

Cell kultursupernatanter blev opsamlet på forskellige tidspunkter og opbevaret ved -20 ° C . Et humant MMP-1 ELISA Kit (Sigma-Aldrich Saint Louis, USA) og human VEGF DuoSet ELISA Kit (R 0,05 angiver en statistisk forskel.

Resultater

Ekspression af MMP-1 i 3D mono- eller co-kultur lungecancer modeller

HCC, MRC-5, og makrofag co -Kultur grupper, sammen med MRC-5, HCC, og makrofag mono-kulturgrupper blev dyrket i 10% FBS og O

2, som beskrevet i fremgangsmåderne. Hver gruppe havde 2 x10

5-celler podes, og forholdet mellem HCC, MRC-5, og makrofager i co-kultur gruppe var 5: 5: 1, og HCC og MRC-5 co-kultur gruppe var 1 :. 1

Efter 48 h, udtrykket af MMP-1 i HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur gruppe (1337,00 ± 42,43) var højere end i HCC og MRC-5 co- kultur gruppe (1166,25 ± 56,21), som også var højere end MRC-5 mono-kultur gruppe (991,50 ± 19,09) og var signifikant højere end HCC (284,00 ± 18,38) og makrofag (98,50 ± 7,12) mono-kultur grupper. HCC og makrofag monokultur grupper udviste næsten ingen MMP-1-ekspression. MMP-1 var signifikant højere ved sam-dyrkning grupper end mono-kulturgrupper (n = 3,

P

0,05, tabel 1 og figur 1A, detekteret ved ELISA).

(A) Ekspression af MMP-1 i 3D mono- og co-kultur lungecancer modeller på 48 timer påvises ved ELISA. Ekspressionen af ​​MMP1 i HCC MRC-5 makrofag co-kultur gruppe var højere end i HCC MRC-5 co-kultur gruppe eller MRC-5 /HCC /makrofag monokultur grupper. Der var næsten ingen ekspression af MMP1 i HCC /makrofag mono-kultur gruppe. (B) Ekspression af MMP-1 i 3D mono- og co-kultur lungekræft model på 48 timer detekteret ved Western blotting. I fig 1B, a, molekylvægten af ​​MMP-1 er 52 kD. Fra venstre mod højre, banerne er: HCC mono-kultur gruppe (2 x 10

5 celler); MRC-5 monokultur gruppe (2 x 10

5 celler); MRC-5 og HCC co-kultur gruppe (2 x10

5-celler); HCC monokultur gruppe (1 x 10

6 celler); MRC-5 og HCC co-kultur gruppe (1 x 10

6 celler); MRC-5 monokultur gruppe (1 x 10

6 celler). Ekspression af MMP-1 i co-kultur grupper var højere end i monokultur grupper (både 2 x 10

5-celler og 1 x 10

6 celler). Ekspression af MMP-1 i 1 x 10

6 cell gruppe var højere end 2 x 10

5 cellegruppe, uanset mono-kultur eller co-kultur gruppe betegnelser. I fig 1B, b, er vist de gennemsnitlige IOD værdier af Western blot. (C) Ekspression af MMP-1 under forskellige co-dyrkningsbetingelser. Angivelse af MMP1 under 10% FBS og O

2 (10% FBS cellekulturmedium med O

2) var højere end under w /o FBS og w /o O

2 (uden FBS og uden O

2) ved 7 forskellige tidspunkter. Desuden til udtrykket tendens MMP1 på betingelse af w /o FBS og w /o O

2 fortsatte falde fra 120 t.

Udtrykket af MMP-1 blev yderligere undersøgt ved Western Blot. HCC og MRC-5 mono-kultur grupper og HCC og MRC-5 co-kultur grupper blev inddelt i 2 x 10

5-celler og 1 x 10

6 cellegrupper, som beskrevet i fremgangsmåderne. Forholdet mellem HCC og MRC-5 co-kultur gruppe var 1: 1. Vi fandt, at ekspressionen af ​​MMP-1 i co-kultur grupper var højere end i monokultur grupper, både i 2 x 10

5 cellegruppe og 1 x 10

6 cellegrupper. Desuden udtryk for MMP-1 i de 1 x 10

6 cellegrupper var højere end 2 x10

5 cellegrupper, uanset mono-kultur eller co-kultur gruppering (n = 5, P 0.05, tabel 2 og figur 1B).

udtrykket af MMP-1 i en 3D co-kultur lungekræft model under forskellige co-dyrkningsbetingelser

udtryk for MMP- 1 i HCC og MRC-5 co-kultur model blev analyseret under forskellige dyrkningsbetingelser: 10% FBS og O

2 (10% FBS cellekulturmedium med O

2), hvor ingen (uden FBS og O

2) at udforske effekten af ​​at simulere hypoxi og udsultet af føtalt bovint serum tilstand på MMP-1-sekretion. Cellekultursupernatanter blev indsamlet separat fra 3D co-kultur kollagen modeller på syv forskellige tidspunkter fra 48 til 192 t. Hver gruppe havde et lige antal celler (2 x 10

5) med et forhold på 1: 1. Vi fandt, at ekspressionen af ​​MMP-1med 10% FBS og O

2 var højere end udtrykket uden FBS og O

2 for alle syv tidspunkter. Endvidere MMP-1-ekspression uden FBS og O

2 faldt fra 120-192 timer (n = 3, P 0,05, tabel 3 og figur 1C).

Ekspression af VEGF i 3D mono eller co-kultur lungecancer modeller

HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur grupper, sammen med MRC-5, HCC, og makrofag mono-kulturgrupper blev dyrket i 10% FBS og O

2, som beskrevet i metoder. Hver gruppe havde 2 x10

5-celler podes og forholdet mellem HCC, MRC-5, og makrofager; co-dyrkning gruppe var 5: 5: 1, og HCC og MRC-5 co-kultur gruppe var 1:. 1

HCC, MRC-5, og makrofag mono-kulturgrupper blev dyrket hver for sig, og cellekultursupernatanter blev opsamlet efter 48 timer. Vi fandt, at ekspressionen af ​​VEGF i HCC mono-kultur gruppe (241,97 ± 78,56) var signifikant højere end i MRC-5 mono-kultur (12,69 ± 5,46) og makrofag mono-kultur (13,65 ± 7,44) grupper (n = 3,

P

0,05, tabel 4 og figur 2A)

(A) Ekspression af VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag mono-kulturer grupper.. Ekspression af VEGF i HCC mono-kultur var væsentligt højere end ekspression i MRC-5 /makrofag monokultur gruppe under 10% FBS og O

2 dyrkningsbetingelser. (B) Ekspression af VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur grupper sammenlignet med HCC mono-kultur gruppe. Ekspression af VEGF i HCC MRC-5 Makrofag co-kultur gruppe var højere end i HCC MRC-5 co-kultur gruppen og HCC mono-kultur gruppe dyrket med 10% FBS og O

2 i 48 timer. (C) Ekspression af VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur grupper under forskellige co-dyrkningsbetingelser. Udtrykket af VEGF i celler dyrket w /o FBS (udsultet af FBS, men med O

2), w /o FBS og w /o O

2 (uden FBS og uden O

2) var højere end den 10% FBS eller O

2 (10% FBS cellekulturmedium med O

2), mens ekspressionen af ​​VEGF i de tre forskellige betingelser steg først og faldt derefter.

HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur gruppe, HCC og MRC-5 co-kultur gruppe, og HCC monokultur gruppe (som kontrol) blev dyrket hver for sig, og cellekultursupernatanter blev opsamlet efter 48 timer. Udtrykket af VEGF i både HCC, MRC-5, og makrofag (492,84 ± 51,43) og HCC og MRC-5 (429,63 ± 54,13) co-kultur grupper var højere end i HCC mono-kultur gruppe (208,31 ± 46,45). Ekspressionen af ​​VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur gruppe var også højere end HCC og MRC-5 co-kultur (n = 3,

P

0,05, tabel 5 og figur 2B).

ekspressionen af ​​VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag 3D co-kultur lungekræft model under forskellige co-dyrkningsbetingelser Salg

HCC, MRC -5, og makrofag co-kultur grupper blev dyrket under tre forskellige betingelser: 10% FBS med O

2 (10% FBS cellekulturmedium med O

2), 0% FBS med O

2 ( udsultet af FBS, men med O

2), og uden begge (uden FBS og uden O

2). Cellekultursupernatanter blev opsamlet ved ti forskellige tidspunkter. Vi fandt, at ekspressionen af ​​VEGF under forhold med 0% FBS og O var højere end udtrykket i 10% FBS med O

2-gruppe

2 og uden begge, mens tendensen af ​​VEGF-ekspression i alle tre betingelser steg først, derefter faldt (n = 3,

P

0,05, tabel 6 og figur 2C).

2D og 3D co-kultur model

En 3D kollagengel co-kultur model blev etableret (fig 3A). Celledyrkningsmediet gennemsyret ind i kollagengelen, og de dyrkede celler blev suspenderet i 3D rummet.

(A) 3D kollagen co-kulturmodel. Fig 3A, a: 1,0 ml celledyrkningsmedium gennemsyret ind kollagengelen fra toppen, og de dyrkede celler blev suspenderet i 3D kollagengel plads inden. Fig 3A, b: 0,5 ml kollagen gel blev bekræftet i hver kultur fad rum uafhængigt af hinanden. (B) Cell morfologier i 2D og 3D co-kultur-modeller på 48 t. Fig 3B, a: Billede af HCC-celler og makrofager i 2D co-kulturmodel. Pilespids betegner en HCC celle, som er flad og ikke-sfærisk. Pilespids betegner makrofager omgiver en HCC celle ved 40X forstørrelse. Fig 3B, b: Billede af HCC celler og makrofager i vores 3D co-kultur model. Pilespids betegner en HCC celle, som er subsfæriske og stikkende. Arrowhead betegner en makrofag. Dette billede viser, at disse celler er i kontakt med hinanden, som det ses ved anvendelse CFDA SE Tracker på et konfokalt mikroskop. (C) Billeder af HCC, MRC-5, og makrofag co-kulturer efter 48 og 168 timer ved 40X forstørrelse. Fig 3C, en: makrofager kontakt og angribe HCC celler efter 48 timers co-kultur. Pilespidser angiver HCC, makrofag, og MRC-5-celler. Fig 3C, b: Co-kultur efter 7 dage. Som det ses i billedet efter 7 dages dyrkning, begyndte cellerne at frigøre og flyde i mediet, der har mistet deres vitalitet og normal cellemorfologi. De fleste HCC og makrofagceller var døde. (D) fluorescensmikroskop billeder af MRC-5, makrofag, og HCC i 3D-modellen. Fig 3D (øvre): fluorescensmikroskop billeder af MRC-5, makrofag og HCC kulturer (fig 3D, a). Celler blev farvet med DAPI (fig 3D, c) og phallotoxins (fig 3D, b). Fig 3D (lavere): Fluorescens mikroskop billeder af makrofager (fig 3D, d). Celler blev farvet af DAPI (fig 3D, f) og phallotoxins (fig 3D, e).

Cell morfologier i vores 2D og 3D-modeller blev sammenlignet (figur 3B). I 2D co-kulturmodel, formen af ​​HCC-celler var flad og ikke-sfæriske (fig 3Ba), mens i 3D-modellen, HCC-celler subsfæriske og stikkende (fig 3bb). Derfor formen af ​​HCC-celler var dramatisk anderledes mellem 2D- og 3D-modeller.

Desuden opsamlet celle billeder, efter 48 timers co-dyrkning viste, at makrofager havde kontaktet og angrebet HCC-celler (Fig 3ca), mens efter 7 dages co-kultur, vi kunne se, celler flyder i det medium, der mistede deres levedygtighed og havde ændret morfologier. Både HCC og makrofag populationer var stort set døde (fig 3cb). Fluorescens mikroskop billeder af frosne sektioner af MRC-5, makrofag, og HCC model og 3D-makrofag-modellen blev også indsamlet (Fig 3D).

disscussion

Udfordringen i at udvikle nye målrettede behandlinger ligger i at etablere

in vitro

modeller, der bedre afspejler de betingelser tilstedeværende

in vivo

. Tidlige 2D modeller leveres mekanistisk indsigt i grundlæggende NSCLC metastaser. Dog kan disse modelsystemer ikke omfatte hele spektret af signalering redundans og /eller kompenserende mekanismer. 3D-celle co-kultur teknikker, der bruger kræftceller i kombination med stromaceller kunne være en lovende vej til at opbygge en mere repræsentativ model.

I vores undersøgelse etablerede vi en tredimensionel co-kultur collagen model med lunge cancer adenocarcinomceller, lungefibroblaster og immunceller (makrofager). Denne model blev udviklet for at udforske tumormikromiljøet og samspillet mellem lungekræft og stromale celler under processen med lungekræft invasion og metastase. Roskelley et al. og Mitragotri et al. fandt, at celler dyrket i en 3D-matrix viste dramatisk forskellige egenskaber med hensyn til proliferation, differentiering, morfologi og cellulære funktion [14, 15]. Ligeledes fandt vi, at morfologien af ​​HCC lunge adenocarcinomceller var signifikant forskellig mellem 2D- og 3D-co-kultur modeller. I 2D co-kulturmodel, blev formen af ​​HCC-celler fladtrykte og arklignende, æglæggende på bunden af ​​cellekultur skålen, mens i 3D-modellen, HCC-celler subsfæriske og stikkende. Denne 3D co-kultur lungekræft modellen ikke kun giver en ekstracellulær matrix for lungekræft celler, som er afgørende for deres form og funktion, men det synes også at bedre simulere det levende miljø og cellulære interaktioner, der opstår

in vivo

.

i vores undersøgelse fandt vi, at MMP-1-niveauer var næsten ikke målbart i HCC og makrofag monokultur grupper. VEGF-niveauer var også næsten upåviselig i MRC-5 og makrofager monokultur gruppe, selv om begge MMP-1 og VEGF rigeligt blev udtrykt i co-kulturer af disse celler. Disse resultater viser samspillet mellem lungekræft og stromale celler er vigtige for ekspression af disse markører for metastase. Desuden udtrykkene for både MMP-1 og VEGF var højest i den model, der kombinerede alle tre celletyper (HCC, MRC-5, og makrofager), endnu højere end de niveauer i den dobbelte dyrkningssystem med HCC og MRC-5. Vores resultater tyder også på, at makrofager i 3D co-kultur modeller ikke blot øge ekspressionen af ​​MMP-1, men også forbedre muligheden for lungecancerceller at fremme angiogenese. under processen med co-kultur, fandt vi, at makrofagerne også angrebet og dræbt HCC-celler. Denne observation antyder, at funktionen af ​​makrofager i lungekræft kan være et “tveægget sværd”, hvor de udviser både anti-tumor og tumorfremmende effekter er relevante for invasion, metastase, og lungeskader. Nogle rapporter har forbundet en overflod af tumorassocierede makrofager (TAM) med en dårlig patient prognose [16, 17]. Thomsen et al. rapporterede, at cigaretrygning forårsager en inflammatorisk reaktion i lungerne, der rekrutterer inflammatoriske celler følgelig ændring cytokinsekretion på en sådan måde, der fører til en disposition for lungecancer [18]. Shaked et al. viste, at knoglemarvafledte celler, såsom lymfocytter, makrofager, neutrofiler, og mastceller (MCS) ofte rekrutteres til lungen som reaktion på lungeskade; sammen med fibroblaster, endothelceller og pericytter, immunceller synes at hjælpe konditionere tumormikromiljøet (TME) [19].

Tumor microenvironmental iltmangel (hypoxi) øger også den maligne opførsel af cancerceller, delvis via hypoxi-inducerbare faktor (HIF) familie af transkriptionsfaktorer. HIFs regulere ekspressionen af ​​EMT-gener, samt fremme angiogenese, celle-proliferation, og vævsremodellering [20]. I den foreliggende undersøgelse påvist vi ekspressionen af ​​VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur gruppe under tre forskellige betingelser: 10% FBS med O 2 (normal tilstand)

, 0% FBS med O

2 (udsultet af føtalt bovint serum, men med O

2), og 0% FBS uden O2 (simulering hypoxi og serum hungersnød). Vi fandt, at ekspressionen af ​​VEGF under hypoxi eller serum sult var højere end under normale efter 72 timer af co-kultur, mens tendensen i VEGF-ekspression viste en initial stigning, efterfulgt af et tilsyneladende fald. Dette kan skyldes HCC celledød over tid medieret af makrofager, som forårsagede en latent fald i VEGF-ekspression. Som det også underforstået, udover hypoxi, kan hungersnød fremme ekspressionen af ​​VEGF

in vitro

. Men i HCC og MRC-5 co-kultur gruppe, som blev anvendt til at sammenligne ekspressionen af ​​MMP-1 under hypoxi eller serumudsultning med normale betingelser, viste ingen signifikante forskelle i ekspression. Vi fortolket dette til at betyde, at hverken hypoxi eller serum sult er faktorer, der har indflydelse på ekspressionen af ​​MMP-1. Endvidere ekspressionen af ​​MMP-1 under disse betingelser faldt støt over 120 timer eksperimentet. En forklaring kan være, at cellerne opbrugt de nødvendige næringsstoffer i dyrkningsmediet og /eller lav ilt spænding fik dem til at vokse dårligt og /eller stoppet celledeling.

Det er tid til at genoverveje den nuværende 2D modeller, der anvendes at teste lungekræft terapi som tumor mikromiljø, tilstedeværelse af stromale celler, ECM komponenter, og signalmolekyler i høj grad påvirke udseende, sundhed og aktiviteter af kræftceller. Vi foreslår, at en bedre fremgangsmåde ville være at konstruere terapier, der også målrettet mod tumormikromiljøet og stromale celler, som også er vigtige for metastase og angiogenese. Terapier, der er målrettet kun og arbejder direkte på lungekræft celler kan ikke være så effektive, fordi de ikke tager vigtige faktorer involveret i tumor progression. Lungecancerceller er heterogene, og de har forskellige histologiske egenskaber, sammen med det faktum, at de er genetisk ustabil under progression af sygdom; alle disse er væsentlige årsager til den manglende af lungekræft behandlinger, der fokuserer på meget specifikke mål på lunge kræftceller. Desuden er en høj grad af resistens sædvanligvis ledsager terapier rettet direkte til tumorceller. Sammenfattende ser vi fordelene ved terapier rettet tumormikromiljøet og stromale celler: 1) de ikke målrette et specifikt aspekt af meget varierende tumorceller, 2) de mål stromale celler, som besidder en stabil genetisk baggrund og arvelige stabilitet, og 3) stromale celler er mindre tilbøjelige til genetiske mutationer og resistens, men de har en betydelig indvirkning på tumorprogression og metastase, således at hæmme deres funktion kan effektivt langsom eller standse tumor progression /spreder.

konklusioner

tumormikromiljøet består af cancerceller, interstitielle celler, cytokiner og kemokiner. Generelt er de interstitielle celler, herunder fibroblaster, immunceller, endotelceller og umodne celler afledt af knoglemarv. Fokus på at forstå, hvordan det interstitielle celler funktion i tumormikromiljøet kan føre til forbedringer i anticancerterapier. Vores arbejde har vist, at morfologi HCC celler er signifikant forskellig mellem 2D og 3D co-kultur-modeller. Ekspressionen af ​​MMP-1 og VEGF opreguleres i 3D co-kultur modeller sammenlignet med monokultur modeller, der viser, at interaktionerne mellem lunge- cancerceller og stromale celler kan spille en vigtig rolle i at muliggøre og fremme metastase. I 3D co-kultur lungekræft model, simulerede hypoxi og sult betingelser inducerede sekretion af VEGF, men ikke MMP-1. Makrofager i tumor mikromiljø kan tjene dobbelte roller i at angribe tumorceller, samtidig med opregulering signalveje, at støtte i tumor invasion og metastase.

Outlook

Behandlinger rettet mod tumor stromale celler kan repræsentere en mere effektiv tilgang til bekæmpelse af kræft. Men lidt nuværende kendskab til samspillet mellem stromale celler og tumorceller;