PLoS ONE: Epigenetisk Modulation med HDAC-hæmmer CG200745 inducerer Anti-spredning i ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

histon modifikation spiller en central rolle på genregulering, som betragtes som globale epigenetiske markører, især i tumor beslægtede gener. Derfor har kemiske tilgange rettet mod histon-modificerende enzymer opstået på den vigtigste fase af anticancer lægemiddelforskning. Her undersøgte vi de terapeutiske potentialer og mekanistiske roller den nyligt udviklede histondeacetylaseinhibitoren, CG200745, i ikke-småcellet lungekræft celler. Behandling med CG200745 steg den samlede størrelse af histonacetylering, hvilket resulterer i inhibering af celleproliferation. Chip-on-chip-analyse med et H4K16ac antistof viste ændrede H4K16 acetylering på gener kritiske for cellevækstinhibering, skønt de faldt i transkriptionsstartstedet af en delmængde af gener. Altered H4K16ac var forbundet med ændringer i mRNA-ekspression af de tilsvarende gener, som yderligere blev valideret i kvantitativ RT-PCR og western blotting assays. Vores resultater viste, at CG200745 forårsager NSCLC cellevækst hæmning gennem epigenetisk modifikation af kritiske gener i cancer celle overlevelse, giver afgørende spor som en lovende kemoterapeutika mod lungekræft

Henvisning:. Chun SM, Lee JY, Choi J, Lee JH, Hwang JJ, Kim CS, et al. (2015) Epigenetisk Modulation med HDAC-hæmmer CG200745 inducerer Anti-spredning i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 10 (3): e0119379. doi: 10,1371 /journal.pone.0119379

Academic Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, KINA

Modtaget: August 22, 2014 Accepteret: 30 januar 2015; Udgivet: 17 Marts 2015

Copyright: © 2015 Chun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Understøttede tilskud til undersøgelsen var den koreanske Health Technology R D Project, Sundhedsministeriet Velfærd, Republikken Korea (HI06C0868, HI10C2014), Leading Foreign Research Institute Rekruttering Program, Fund Basic Research Promotion, og Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk modifikationer såsom CpG DNA methylering eller histonacetylering betragtes som et vigtigt skridt i udviklingen af ​​kræft, og derfor er blevet undersøgt for at opdage kræft biomarkører og terapeutiske Stratege [1-3]. Når cytosin methylering opstår på CpG-dinukleotider via virkningen af ​​DNA methyl transferase (DNMT), er methyl- cytosin fastholdt til den næste generation på grund af manglen af ​​en DNA de-methyltransferase i pattedyr. Den irreversible histon modifikation er blevet også som en biomarkør til tidlig diagnose eller prognose af cancer, såvel som en effektiv target i kræftbehandling [4,5]. Acetylering eller methylering på lysinrester i H3 og H4 aminoterminale hale er dominerende histon modifikationer, og hver er ansvarlig for ekspressionen af ​​bundne gener. For eksempel er methyleringer på lysin 4 i H3 og lysin 27 af H3 kendt som transkriptionel aktiverende og undertrykker begivenheder for histon bundet gener hhv. Histonacetylering på lysin 16 i H4 er relateret til transkriptionel aktivering og /eller replikation initiering af tilsvarende gener. I normale celler, er histonacetylering præcist styret af histon acetyl transferase (HAT) og histon deacetylase (HDAC). Hyper-acetylering af onkogener eller hypo-acetylering af tumorsuppressorgener imidlertid observeres hyppigt i forskellige cancerformer. HDAC-hæmmere (HDACi) er de mest udviklede anti-cancer medicin rettet mod epigenetiske modulation og er ved at blive anvendt til behandling af forskellige kræftformer, især i solide tumorer, såsom bryst-, tyktarms-, lunge- og ovariecancer samt i hæmatologiske tumorer , såsom lymfom, leukæmi og myelom [6-9]. Desuden er epigenetisk dysregulation i lungekræft ofte relateret til overekspressionen af ​​HDAC1 og afvigende methylering af visse gener, hvilket resulterer i terapeutiske effektivitet af kombinationen epigenetisk terapi målretning DNA-methylering og histondeacetylering. HDAC’er omfatter tre klasser: Klasse I, HDAC 1, 2, 3, og 8; Klasse II, HDAC 4, 5, 6, 7, 9 og 10; og klasse III, HDAC 11 (sirtuins 1-7) [10,11]. HDACi, Trichostatin A (TSA) [12,13] eller vorinostat (SAHA) [14-16] hæmmer klasse I og II HDAC-enzymer, hvilket resulterer i vækst anholdelse, apoptose, differentiering, og anti-angiogenese af kræftceller, når de anvendes uafhængigt eller i kombination med andre anti-cancermidler. Mekanistisk genoprettelse af tavshed tumorsuppressorgener eller undertrykkelse af aktiverede onkogener i cancerceller spiller en kritisk rolle i de anti-cancer virkninger af lægemidler. Dette efterfølges af induktion af standsning af cellecyklus ved G1 stadium gennem ekspression af p21 og P27-proteiner, eller en G2 /M overgang forsinkelse gennem transkriptionel nedregulering af cyclin B1, PLK1, og survivin.

HDAC inhibitoren CG200745, (E) -N (1) – (3- (dimethylamino) propyl) -N (8) -hydroxy-2 – ((naphthalen-1-Loxy) methyl) oct-2-enediamide, er for nylig blevet udviklet og i øjeblikket undergår en fase I klinisk forsøg. Dets inhiberende virkning på cellevækst er blevet påvist i flere typer af cancerceller, herunder prostatacancer, nyrecellecarcinom, og RKO-celler (colon carcinomceller) i mono- og multikombinerbare-behandling med andre lægemidler mod cancer [17-19]. Den mekanisme, der ligger cellevækstinhiberingen af ​​CG200745 i RKO celler er blevet vist at forekomme i en p53-afhængig måde [19]. Vigtigt er, CG200745 øget acetylering af p53 på lysinrester K320, K373, og K382. CG200745 inducerede også akkumulering af p53, fremmet p53-afhængig transaktivering, og øget ekspression af proteiner kodet af p53 målgener,

MDM2

p21

(WAF1 /Cip1) i human prostatacancer celler. I aktuelle undersøgelse vurderede vi de antitumorvirkninger og udforsket direkte mål for en CG200745 på ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler at kontrollere yderligere cancer indikation. Vi analyserede celleproliferation og ændret genekspression mønster ved histondeacetylering gennem Chip-on-chip assay realtids-PCR kvantificering og western blotting. Vores resultater tyder på, at HDAC-hæmmer CG200745 forårsager epigenetisk reaktivering af kritiske gener, der transkriptionelt undertrykt i kræft, og derfor kan være en lovende NSCLC kræft terapeutisk.

Materialer og metoder

Kemi og cellelinier

HDAC-hæmmere (HDACi), suberoylanilid hydroamic (vorinostat, SAHA) og CG200745, blev leveret af Crystal Genomics Co. (Seoul, Rep. Korea). Disse forbindelser blev opløst i DMSO og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer og en udødeliggjort normal bronchieepithelceller cellelinje (Beas-2B) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 gg /ml streptomycin med 5% CO

2 ved 37 ° C.

Western blotting

50 ug af hele celleekstrakter blev kørt på SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membraner. Membranerne blev blokeret og inkuberet med specifikke primære antistoffer mod H4K16ac, CCND1, p21, og caspase 3 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-H4S1 /K5 /K8 /K12Ac fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA) og β- actin fra Sigma (St. Louis, MO). Efter inkubation med passende peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer, blev påvist bånd ved hjælp ECL reagens (Amersham-GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).

Real-time kvantitativ PCR

Total RNA forberedelse og cDNA-syntese blev udført under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved anvendelse Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Grand Island, NY) på IQ5 Flerfarvet Real-Time detektionssystem (Bio-Rad) med hver af forward og reverse primer for

CCNA2

,

CCNB1

,

CCND1

,

CCNE2

,

CDK2

,

Bax-en

,

bcl- 2

,

p16

,

p21

,

p27

, og

Mxi1

(Bionics, Seoul, Korea) (S1 tabel).

cytotoksicitet assay

IC

50 af hver HDACi på lunge kræftceller blev bestemt ved celledeling under anvendelse CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Reagent (Promega, Madison, WI) ifølge fabrikantens protokol. Efter anden periode inkubation med HDAC-hæmmere, blev absorbansen derefter målt ved 490 nm på Wallac 1420 Victor3 med træning to-software.

FACS assay

Effekten af ​​CG200745 på NSCLC celle cyklus blev analyseret på flowcytometri under anvendelse propidiumiodid (PI) farvning. Efter inkubering med CG200745 eller DMSO blev celler fikseret med iskold 70% ethanol ved 4 ° C natten over. Genomisk DNA blev farvet med 30 pg /ml PI og fluorescens blev målt med en FACS Calibur maskine (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). Den røde fluorescens som følge PI-farvet DNA blev opsamlet ved 560 nm dikroisk spejl og et 600 nm pass filter (båndbredde, 35 um). I alt 10.000 celler blev opsamlet ved FACS og analyseret ved anvendelse af Cell Quest 3.1 software (Becton Dickinson).

chromatin immunoprecipitation (chip)

Chippen assays blev udført ifølge producentens anbefalinger. Kort fortalt blev celler behandlet med 3 uM CG200745 eller DMSO i 24 timer udfældet med et anti-acetyl-H4K16 antistof (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Efter krydsbinding med 1% formaldehyd, blev kromatin opsplittet i 300 ~ 800 bp størrelse ved ultralydsbehandling i Bioruptor, UCD-200 (Diagenode, Denville. NJ). Chromatin /protein komplekser blev udfældet med et modificeret histon specifikt antistof og protein A /G plus immobiliserede agaroseperler. Efter eluering fra perlerne, udfældet DNA-proteiner var revers-tværbundet, og DNA blev oprenset med et PCR-oprensningskit (Qiagen, Valencia, CA) Salg

microarray eksperimenter på chip produkter:. Chip-on-chip eksperimenter

chip-on-chip-analysen blev udført på en Agilent 244k × 2 oligonukleotid microarray som producentens instruktioner (Agilent pattedyr chip-on-chip Protocol V.10). Kort fortalt blev input kontrol for helcelleekstrakter og de oprensede chip produkter amplificeret ved ligering-medieret PCR ved anvendelse af en kunstig oligonukleotidlinker, efter dæmpning DNA-ender under anvendelse af T4 DNA-polymerase. Derefter blev amplificeret input og chip produkter mærket med fluorescerende BioPrime samlet genomisk Labeling System (Invitrogen). Den samme mængde indført DNA og chip produkt med forskellige fluorescerende farvestoffer blev blandet med humant Cot-1 DNA (1 mg /ml) og hybridiseret på en Agilent 488k promotor-array (to 244k arrays), som indeholder ~ 17.000 af de definerede humane transkripter dækker fra -5.5 kb til +2,5 kb af transkriptionsstartstedet (TSS). Hybridiseret billeder blev visualiseret med microarray scanner (Revolution 4200;. Vidar Systems Cor, Herndon, VA)

Dataanalyse og ontologi analyse

Histon acetylering af chip produkter og input blev analyseret ved hjælp af. chip modul af DNA Analytics (Agilent, udgave 4.0.81) med Tukey biweight normalisering, Whitehead fejl model, og Whitehead Per-Array Neighborhood model. Kort fortalt blev log2 ratio for hvert gen af ​​chip produkter og input beregnet som gennemsnittet af prober i 1,000bp, overvejer gener med en P-værdi på mindre end 0,1 som værdifulde. For at skildre H4K16ac status fra transkriptionsstartstedet (TSS), blev afstanden for hver probe forenklet som følger: regionen mellem-1000 ~ -500 fra TSS blev regnet som-2, -500 ~ TSS som-1, og TSS ~ + 500 som en, som TSS definerede position fra-11-10.

Funktionelle anmærkninger gennem kvantitativ RT-PCR og western blotting blev efterfulgt af analyse ved hjælp af DAVID (Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery) bioinformatik ressourcer og Gene Ontologier (Molecular Function, biologisk proces, Cell Components) til signalveje. Alle kategorier udgør mindre end 4% af det samlede antal anvendte gener blev udelukket.

Resultater

CG200745 hæmmer spredning af NSCLC celler

For at bestemme de hæmmende virkninger af CG200745 på celleproliferation, vi målte IC

50 af CG200745 af følgende lungekræft cellelinier: Calu6, H358, H596, A549, HOP62, HOP92, H226, H460, og H522, samt Beas2B celler. IC

50 værdier af CG200745 i de testede lunge kræftceller var på mikromolære niveauer, og var sammenlignelige med dem, der opnås fra henvisningen narkotika, SAHA (tabel 1), hvilket indikerer en betydelig vækst undertrykkelse effekt af CG200745 om forskellige NSCLC cellelinjer. Blandt dem, A549, Calu6, HOP92, og H522 celler var de mest følsomme med IC

50 3 uM. Virkningen af ​​CG200745 på Calu6 celleproliferation blev bekræftet som celleantal og morfologi på optisk mikroskopi efter udsættelse for 3 uM CG200745 ved forskellige tidsperioder (fig. 1). Calu6 celler viste ordinær celle voksende mønstre i en tidsafhængig måde, indtil 8 timer efter lægemiddelbehandling. Men efter 8 timers CG200745 behandling blev væksten i Calu6 celler reduceres, og celledød med morfologiske ændringer blev noteret. Den negative virkning af CG200745 på Calu6 cellevækst blev analyseret ved at udføre MTT assay med forskellige betingelser, hvilket bekræfter, at lægemidlet reducerede celleproliferationen til 40% af ubehandlede celler (fig. 1A).

Calu6 celler dyrket på plader med 6 brønde blev behandlet med 3 uM CG200745 for de angivne tidsperioder for at analysere anti-spredning virkning CG200745, og blev observeret under mikroskop. (B) Væksten af ​​Calu6 celler i 96-brønds plader blev analyseret via MTS assay ved behandling med forskellige koncentrationer af CG200745 (0 til 10 pM) i tidsforløbet (0 til 48 timer). Statistisk signifikans af ændringer i cellelevedygtighed blev beregnet ved hjælp t-test (*** angiver p 0,001)

CG200745 behandling inducerer G2 /M cellecyklusstop og apoptose i Calu6 celler

HDACi forbindelser vides at inducere standsning af cellens cyklus, en vigtig cancer target mekanisme, i forskellige cancerceller. For at undersøge om CG200745 induceret cellecyklusstandsnings i Calu6 cellelinien, blev disse celler behandlet med denne HDACi molekyle til forskellige tidspunkter fra 0 til 24 timer, efterfulgt af flowcytometrisk analyse (FACS). Som vist i fig. 2A, en stigning i G2 /M population blev observeret i en tidsafhængig måde. CG200745-behandlede Calu6 celler viste en signifikant øget celle andel i G2 /M-fase (69%) sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (26%) (fig. 2B og 2C). Disse resultater indikerer, at CG200745 forårsager cellevækstinhiberingen gennem G2 /M-fase-cellecyklusstandsnings. Salg

Calu6 celler behandlet med 3 uM CG200745 blev analyseret cellecyklus på flowcytometer. Hvert histogram består af to sorte toppe og en ridset region indikerer G0 /G1-fasen, G2 /M-fase, og S-fasen, hhv. Virkningen af ​​CG200745 på fordelingen cellecyklus blev analyseret på forskellige tidspunkter (A), eller i sammenligning med ubehandlede celler (B) afbilder som en grafisk visning (C).

CG200745 forårsager øget histon acetylering

for at undersøge de HDAC hæmmende effekt af CG200745 på ikke-småcellet lungekræft celler, vi behandlede Calu6 celler med forskellige koncentrationer af CG200745 og analyseret histonacetylering ved western blotting, samt HAT og HDAC-aktivitet ved forskellige tidspunkter. Som vist i fig. 3A, lav koncentration af CG200745 behandling øgede acetylering af histon H3 og H4 på forskellige steder, herunder K9 på H3, og K16 samt S1 /K5 /K8 /K12 på H4, i en tidsafhængig måde op til 24 timer efter betydeligt behandling i western blotting-analyse. For at bekræfte de hæmmende virkninger af CG200745 på histondeacetylering målte vi HAT og HDAC-aktivitet i nukleare ekstrakter af Calu6 celler før og efter CG200745 behandling. I modsætning til den uændrede HAT aktivitet efter CG200745 behandling (fig. 3B), HDAC-aktivitet i CG200745-behandlede Calu6 celler var signifikant lavere end det i ubehandlede kontrolceller (fig. 3C), hvilket indikerer, at CG200745 øget histonacetylering niveau på grund af inhiberingen af HDAC-aktivitet.

(A) Acetylering status histoner blev analyseret på Western blotting af Calu6 celler behandlet med forskellige koncentrationer af CG200745 (0 til 10 uM) med anti-H3K9ac, anti-H4K16Ac, anti-H4S1 /K5 /K8 /K12Ac og /eller anti-acetyl H4 antistoffer. (B, C) hat og HDAC aktiviteter i kontrol og CG200745-behandlede celler blev bestemt ved hjælp af 50 pg af nuklear ekstrakt på angivne tidspunkt.

CG200745 inducerer histon modifikation ændringer i Calu6 celler

H4K16ac er en velkendt aktivator af global gentranskription. For at undersøge om gener, der regulerer celleoverlevelse var påvirket af histonacetylering følge af CG200745 behandling, udførte vi Chip-on-chip assay under anvendelse af et H4K16ac specifikt antistof. Gener bundet til H4K16ac blev immunpræcipiteret og analyseret på oligonucleotid mikroarray fokuseres ved promotorregionen. Hovedformålet med dette forsøg var at bestemme, hvor mange og hvilke gener relateret til H4K16ac status påvirkes af CG200745 behandling. Som vist i tabel 2, blev påvist mere end 10.000 gener bundet til H4K16ac i både styre- og CG200745-behandlede celler, med ekspressionsniveauerne af tusinder af gener, der viser ændringer på H4K16ac Chip-on-chip assay efter CG200745 behandling.

Vi undersøgte derefter mønsteret af H4K16ac ændres alt efter afstanden fra TSS ved at plotte en gennemsnitlig logaritmiske værdi af chip /input for alle prober (fig. 4), hvori X-aksen betegnet afstanden fra TSS område som beskrevet i et tidligere afsnit. Den H4K16ac var overraskende faldt på det tilstødende område til TSS, især på-500 nt fra TSS, efter CG200745 behandling, hvorimod H4K16ac ved fjernt område fra TSS var ingen forskel med det i ubehandlede kontrol celler, som er fælles på grund af den transkriptionelle aktiveringsfunktion af H4K16 (fig. 4A). Den gennemsnitlige log-forhold på chip /inputdata viste klart, at færre gener med H4K16ac ved 500 nt fra TSS blev set i behandlede celler sammenlignet med kontrolceller, selv om en større ændring site for H4K16ac stadig var tydelig omkring TSS (fig. 4B) . Disse resultater blev bekræftet i gentagne forsøg, hvilket indikerer, at CG200745 behandling undertrykker H4K16 acetylering 500 nt fra TSS af mange gener.

H4K16 acetylering siden af ​​TSS blev vurderet ved at beregne den gennemsnitlige chip /input log ratio i samme afstand fra TSS. Tallene i X-aksen angiver afstanden fra TSS. Y-aksen repræsenterer det gennemsnitlige chip /input log ratio. (A) H4K16 acetylering status af gener omkring TSS var individuelt afbildet i CG200745-behandlede eller ubehandlede Calu6 celler. (B) Niveauet af H4K16 acetylering blev sammenlignet mellem CG200745-behandlede og ubehandlede celler efter afstanden fra TSS. To separate eksperimenter blev udført for at beregne fejlen bar for hver position.

Sammenhæng mellem ændringer i H4K16ac og genekspression efter CG200745 behandling

H4K16ac-induceret genekspression er drevet af løsne af kromosomal DNA bundet til histonproteiner, hvilket resulterer i åbningen af ​​DNA sites for forskellige transkriptionsfaktorer. Under en hypo-acetyleret status imidlertid den positive ladning af lysinrester på aminoterminalen af ​​histon halen virker som en kilde til høj affinitet binding til den negative ladning af phosphatskelettet i kromosomalt DNA. Dette tæt binding tillader chromatin at danne mere kompakte strukturer, hvilket resulterer i inhibering af transkription af beslægtede gener. Som vist i tabel 2, blev H4K16ac niveauer af tusinder af gener ændret efter CG200745 behandling. For at kontrollere sammenhængen mellem H4K16ac status og tilsvarende genekspression blev mRNA-niveauer undersøgt for gener, der undergik betydelige H4K16ac ændringer omkring TSS-området. Som vist i tabel 3, de mRNA ekspressionsniveauerne af

s

21,

GSN-b

, og

Mxi1

, som viste øget H4K16ac, blev alle steg efter CG200745 behandling , mens andre gener med nedsat H4K16ac, såsom

HOXD11

,

HOXD9

, og

PIM1

viste reduceret mRNA-ekspression. Hertil kommer, at mRNA ekspressionen af ​​

HAT1

, som viste lignende H4K16ac niveauer med og uden CG200745 behandling, blev ikke ændret.

For yderligere at bekræfte korrelationen af ​​mRNA-ekspression og ændringer H4K16ac efter CG200745 behandling, mRNA udtryk for

CCND1

p21

gener blev vurderet. De H4K16ac niveauer i

CCND1

p21

-promoter region blev analyseret i ubehandlet (kontrol) og CG200745-behandlet (CG5) Calu6 celler ved hjælp af en helt gen sonde microarray. Som vist i fig. 5, det H4K16ac niveauet i

CCND1

p21

gener efter CG200745 behandling, især nær TSS position, viste sig at være væsentligt ændret (fig. 5A) og til at være korreleret med udtrykket af mRNA når kvantitativt (fig. 5B). Ekspression af

Mxi1

blev forøget efter 24 timers behandling af CG200745 på Semi kvantitativ analyse med to forskellige sæt primere (fig. 5C). Protein-ekspressionsniveauer af

cyclin D1

p21 Salg gener blev dramatisk reduceret og forøget henholdsvis ikke kun i Calu6 celler, men også i flere andre NSCLC celler, herunder A549, H358, og H596-celler (fig. 6). Desuden CG200745 behandling resulterede i aktivering af den indre apoptotiske caspase 3, i Calu6 celler såvel som i flere NSCLC celler, herunder A549, H358, og H596-celler (fig. 6A og 6B). Tilsammen viste disse data, at ekspressionsniveauerne af visse gener blev ramt af CG200745 behandling gennem H4K16ac niveau ved TSS-regionen.

(A) Niveauerne af H4K16 acetylering på CCND1 og

p

21 gener blev betegnet efter afstanden fra TSS i ubehandlet (kontrol) og CG200745-behandlede celler (CG5). (B) mRNA niveauer i CCND1 og

s

21 gener blev kvantificeret ved real-time RT-PCR. (C) Ekspression af Mxi1 genet blev bestemt ved RT-PCR i A549 og Calu6 celler.

Celler blev analyseret på Western blotting med cyclin D1, p21, caspase-3, c-myc, acetyl-H4, H3, og p-actin-antistoffer. Cellelysater af lægemiddel-behandlede A549, Calu6 (A), H358 og H596 (B) celler blev sammenlignet med tilsvarende ubehandlede celler.

Discussion

HDACi molekyler er blevet rapporteret til inducere en række anticancer effekter, herunder tumorcelle apoptose, standsning af cellens cyklus, differentiering, aldring, modulering af immunreaktioner, og ændret angiogenese [20]. Endvidere brugen af ​​HDACi er blevet vist, at forøge følsomheden af ​​NSCLC cellelinier til gefitinib eller erlotinib [21,22]. CG200745, (E) -N (1) – (3- (dimethylamino) propyl) -N (8) -hydroxy-2 – ((naphthalen-1-Loxy) methyl) oct-2-enediamide, er et nyligt udviklet HDACi , der i øjeblikket gennemgår en fase I klinisk forsøg. Dets inhiberende virkning på cellevækst er blevet påvist i flere typer af cancerceller, herunder prostatacancer, nyrecellecarcinom, og RKO-celler (colon carcinomceller) i mono- og multikombinerbare-behandling med andre lægemidler mod cancer [17-19]. Dette stof i kombination med docetaxel induceret tumorregression i DU145 prostatacancercelle xenograft via aktivering af apoptose. Også, det forårsagede celledød i coloncarcinomceller udtrykker vildtype p53 ved acetylering af p53. I vores aktuelle undersøgelse, vi undersøgte antitumor virkninger af HDACi på NSCLC celler til potentielt udvide sin kliniske anvendelse med brede tumor indikationer. Vi yderligere til formål at belyse den underliggende mekanisme i ny HDAC-hæmmer, som nu er i kliniske forsøg for leukæmi og solid tumor, hvorved korrekt klinisk anvendelse ville blive opnået, såsom co-behandling og /eller adjuverende behandling med målrettede kemoterapeutika. HDACi behandling inducerede inhibering af lungekræft cellevækst, celle vækststandsning ved G2 /M-fasen, og apoptose fremgår af caspase 3 spaltning ved sammenlignelige IC

50 koncentrationer til det i SAHA (også kendt som Vorinostat), den eneste HDACi øjeblikket godkendt til den kliniske behandling af kutant T-celle lymfom [23-25]. Selvom H4K16 acetylering stadig forekom stort set promotorområder, interessant, CG200745 specifikt faldt histon H4K16 acetylering at-500 nukleotider fra TSS som vist ved gentagen CHIP-on-chip-analyse. Disse resultater indikerer, at HDAC inhibitor-medieret cellevækstinhiberingen involverer den transkriptionelle regulering af multiple gener. Dybdegående analyse af gener involveret i cellecyklus regulering, såsom

CCND1

,

p21

, og

Mxi1

, viste, at CG200745 behandlingsresultater i transkriptionelle ændringer i disse gener .

Mxi1

, en antagonist for

c-Myc

onkogen, koder for et protein betegnet MAD2, som er en transkriptionsfaktor i Myc-Max-Mad netværk. The Mad /MXI heterodimer forventes at modvirke Myc funktion ved at afskaffe rådighed Max for myc transkriptionsaktivitet. Transskriptionsfaktoren c-myc er overudtrykt i mange humane tumorer, og dens aktivering kræver heterodimerisering med partner Max. C-myc reguleres gennem ubiquitinering og proteasom nedbrydning [26,27]. Faktisk har inhibering af Myc /Max binding af små molekyler blevet identificeret som en særdeles lovende mål for cancerterapi [28]. Mxi1-relaterede spredning medieres gennem IGFBP-3 signalering [18], og øget FoxO3a udtryk opregulerer ekspression af medlemmer af Mad /MXI vej [29]. Opreguleres ekspression af Mxi1 af CG200745 behandling kan derfor spille en rolle i reguleringen af ​​celleproliferation via Myc-Max-Mad netværk.

SAHA HDACi, har vist sig at nedsætte ekspressionsniveauerne af ERK1 /2-og MMP-9, øge ekspressionsniveauerne af p53, som igen ændrer celleproliferation og apoptose, og fremme acetylering af histoner H3 og H4 i ovariekarcinomceller [30]. Desuden har en tidligere undersøgelse rapporterede, at SAHA aktiverer p53, men kræver ikke p53 for sine anticancer effekter. Den samme undersøgelse viste, at entinostat-induceret cytotoksiske virkninger er delvis afhængig p53, hvilket indikerer, at forskellige HDACi forbindelser har forskellige krav til p53 [31]. Den mekanisme, der ligger cellevækstinhiberingen af ​​CG200745 i RKO celler er blevet vist at forekomme i en p53-afhængig måde [19]. I denne undersøgelse, CG200745 øget acetylering af p53 på lysinrester K320, K373, og K382. CG200745 inducerede også akkumulering af p53, fremmet p53-afhængig transaktivering, og øget ekspression af proteiner kodet af p53 målgener,

MDM2

p21

(WAF1 /Cip1) i human prostatacancer celler. De antitumorvirkninger af CG200745 på NSCLC-celler blev imidlertid fundet i vores nuværende analyser for at være uafhængig af mutation status generne kodende p53. De NSCLC-celler anvendte vi, herunder p53 vildtype og null /mutantceller, viste cellevækstinhiberingen efter behandling med en HDACi, hvilket indikerer, at CG200745 regulerer cellevækst ved forskellige mekanismer ifølge celle kontekst.

Som konklusion resultater af vores nuværende undersøgelse udvide den generelle anvendelighed CG200745 til behandling af NSCLC, hvor det er en lovende ny HDACi. Derudover vores resultater viser, at virkningerne af dette HDACi kan forekomme via en p53-uafhængig mekanisme. Desuden viser dataene, at HDACi kan undertrykke c-myc signalvejen gennem induktion af

Mxi1

, men dette fund kræver yderligere undersøgelser. Endelig potentiale CG200745 forbedre styrken af ​​lægemidler mod cancer som del af en kombinationsbehandling bør undersøges nærmere

Støtte Information

S1 Table. Primer sekvenser for kvantitativ RT-PCR-reaktion

doi:. 10,1371 /journal.pone.0119379.s001

(DOCX)

anerkendelser

Understøttede tilskud til undersøgelsen var koreanske Sundhed Technology R D Project, Sundhedsministeriet Velfærd, Republikken Korea (HI06C0868, HI10C2014), Leading Foreign Research Institute Rekruttering Program, Fund Basic Research Promotion, og Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (MEST ) (2011-0030105, KRF-2008-355-E00006, NRF-2014R1A1A2006192).