PLoS ONE: NF-KB Regulerer Mesenchymale Overgang til Induktion af ikke-småcellet lungekræft Start Cells

Abstrakt

epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) er en de-differentiering proces, der har været impliceret i metastase og generering af kræft initierende celler (CICS) i solide tumorer. For at undersøge EMT i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), anvendte vi en tredimensional (3D) cellekultur system, hvor celler co-stimuleret med tumornekrosefaktor-alfa (TNF) og transformerende vækstfaktor beta (TGFp). NSCLC sfæroide kulturer vise forhøjet udtryk for EMT mester-switch transkriptionsfaktorer,

TWIST1

,

SNAI1 /Snail1

,

SNAI2 /Slug

ZEB2 /Sip1

, og er meget invasiv. Mesenchymale NSCLC kulturer viser CIC egenskaber, viser forhøjet udtryk for transkriptionsfaktorer

KLF4

,

SOX2

,

POU5F1 /Oct4

,

MitCN

, og

KIT

. Som et resultat er disse formodede CIC vise en cancer “stilk-lignende” fænotype ved dannelse lungemetastaser under begrænsende celle fortynding. Den pleiotrope transskriptionsfaktor, NF-KB, er blevet impliceret i EMT og metastase. Således har vi sat os for at udvikle en NSCLC model yderligere at karakterisere rollen af ​​NF-KB-aktivering i udviklingen af ​​CIC. Her demonstrerer vi, at induktion af EMT i 3D kulturer resulterer i konstitutiv NF-KB-aktivitet. Endvidere inhibering af NF-KB resulterede i tab af

TWIST1

,

SNAI2

, og

ZEB2

induktion, og et svigt af celler at invadere og danne metastaser. Vores arbejde viser, at NF-KB er nødvendig for NSCLC metastase, delvis ved transkriptionelt opregulering af mester-switch transkriptionsfaktorer, der kræves for EMT

Henvisning:. Kumar M, Allison DF, Baranova NN, Wamsley JJ, Katz AJ , Bekiranov S, et al. (2013) NF-KB Regulerer Mesenchymale Overgang til Induktion af ikke-småcellet lungekræft Iværksættelse Cells. PLoS ONE 8 (7): e68597. doi: 10,1371 /journal.pone.0068597

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Januar 14, 2013; Accepteret: 30. maj 2013; Udgivet: 30 Jul 2013

Copyright: © 2013 Kumar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet var støttet af National Institutes of Health giver R01CA132580, R01CA104397 (til MWM), og R01CA136705 (til DRJ). Alle finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cancer udvikling fra tidlig præmaligne neoplasma til fuld metastatisk sygdom er en flertrinsproces, der involverer tumor epitel-stromale interaktioner, angiogenese og infiltration af tumorassocierede proinflammatoriske celler [1], [2]. En spirende hypotese foreslår, at dette miljø i celle-celle-vekselvirkninger, vækstfaktorer og cytokiner kendt som tumormikromiljøet, stimulerer morfogenese inden tumorceller benævnt epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) [3] – [5]. EMT inducerer en omfordeling af intracellulær arkitektur, nedsat celle-celle-adhæsion, og tab af cellulær polarisering. Carcinomaceller der har undergået EMT er karakteristisk bevægelige, invasive og meget metastatisk. I løbet af de sidste mange år, har EMT også blevet anerkendt som en de-differentiering program tilskrives generation af tumor-initierende eller kræft-initierende celler (CICS), der er vigtige i opretholdelsen af ​​kræft “stemness” [6] – [9] .

Selvom multiple cytokiner og vækstfaktorer inducerer EMT, en af ​​de bedst undersøgte faktorer er transformerende vækstfaktor beta (TGFp) [2], [3], [10] – [13]. Stimulering af celler med TGFp resulterer i ekspression af EMT mester-switch transkriptionsfaktorer, TWIST1, SNAI1 /Snail, SNAI2 /Slug, og ZEB2 /Sip1 der tilsammen forskelligt regulerer gener for at fremme mesenkymale fænotype [10], [12]. Mens omfattende forskning detaljer evnen til TGF at fremkalde EMT, data viser, at tumornekrosefaktor (TNF) yderligere forstærker overgangen [14], [15]. Under cancer progression, sekretion af TGFp inden for tumormikromiljøet sker gennem mange forskellige celletyper, herunder tumorassocierede fibroblaster, mens sekretion af TNF stammer fra tumorassocierede M2 ​​makrofager [3], [16], [17]. En fremherskende hypotese på området er, at eksponering af cancerceller for disse cytokiner inden for tumormikromiljøet fremmer EMT, de-differentiering, og dannelsen af ​​CIC [2], [5], [17].

TNF er en kraftfuld pro-inflammatorisk cytokin, som stimulerer signalering kaskader at aktivere nuklear faktor kappa B (NF-KB). Som en transskriptionsfaktor, NF-KB spiller en central rolle i ekspressionen af ​​gener involveret i cancer initiering og progression. Opregulering af NF-KB-aktivitet forekommer ofte i primære faste og hæmatologiske tumorer, direkte korrelerer med de-differentierede morfologi, avanceret tumor stadium, og dårlig klinisk prognose [18]. Vigtigere, har NF-KB blevet forbundet med brystkirtler CIC’er [19], [20]. NF-KB inducerer og vedligeholder EMT i modelsystemer gennem to mekanismer, opregulering af EMT mester-switch transkriptionsfaktorer [21] – [24] og stabilisering af Snail [25]. NF-KB er sammensat af fem Rel familiemedlemmer: RelA /p65, RelB, CREL, P50 og P52. I ustimulerede celler, inhibitoriske IKB-underenheder associere med NF-KB dimerer og udskille dem i cytoplasmaet. Efter cellulær stimulering med pro-inflammatoriske cytokiner, er kBa phosphoryleret af IKB kinase (IKK) kompleks, ubiquitineres af SCF-typen E3 ligase, E3RS

IKB /β-TrCP og nedbrydes af 26S proteasomet [26]. Frigjort NF-KB translokerer derefter til kernen for at aktivere genekspression ved at rekruttere transskriptionelle coaktivatorer [27]. Vores laboratorium har vist, at posttranslationelle modifikationer på RelA er nødvendige for fuld NF-KB transkriptionel aktivitet [27] – [30]

Selvom EMT i brystkræft-modeller kræver NF-KB-aktivitet [31], rolle. denne transskription faktor at stimulere EMT og udvikle CIC i NCSLC er ikke blevet grundigt undersøgt. Der eksisterer dog stærk evidens for tilstedeværelsen af ​​NSCLC stamceller /progenitorceller i primære adenocarcinomer og etablerede cellelinjer [32] – [35]. Her viser vi, at en koordineret aktivering af TNF og TGFp signaleringskaskader effektivt inducerer EMT og ekspressionen af ​​gener relateret til de-differentiering og stemness. Yderligere viser vi, at mesenkymale NSCLC celler besidder konstitutivt aktiv NF-KB, og at inhibering af NF-KB nedsætter EMT, CIC-dannelse og metastatisk potentiale.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og reagenser

NSCLC linjer A549, H359, H1299, og H157 blev opnået fra ATCC og føres som 2D kulturer i DMEM (Cellgro), 10% FBS (Invitrogen) og penicillin /streptomycin (Invitrogen). Antistofferne anvendes, indbefatter: E-cadherin (BD Pharmingen- 610.404), N-cadherin (BD Pharmingen- 610.920), vimentin (V6630), fibronectin (BD Pharmingen- 610.078), α-tubulin (Sigma T6793), HMGA2 (Biocheck 59170AP ), Twist1 (cellesignalering 4119), Snail1 (cellesignalering 4719), Sip1 (SCBT sc-48.789), Slug (Abcam ab27568), kBa (pS32, cellesignalering 2859), kBa (SCBT sc-371), RelA (pS536 , cellesignalering 3031), RelA (SCBT sc-372), og M2-Flag (Sigma F1804). BaculoGold proteaseinhibitorer blev opnået fra BD Biosciences. TGFp (PHG 9204) og TNF (PHG 3015) blev købt hos Invitrogen /Life technologies. Alle andre kemikalier var fra Sigma.

Tre-dimensionelle flercellede sfæroide kulturer

Tre-dimensionelle flercellede sfæroide kulturer blev oprettet ved hjælp af en modificeret hængende dråbe metoden [36]. Cellerne blev dyrket til ca. 80% konfluens på standard væv-dyrkningsplader. Cellerne blev efterfølgende trypsinbehandlet, resuspenderet i DMEM /10% FBS, og talt. At skabe 25.000 celle sfæroider blev cellesuspensionen fortyndet til en koncentration på 1.000.000 celler /ml, og 25 pi af cellesuspensionen blev pipetteret på undersiden af ​​en steril 10 cm vævskultur plade låg. Hver låg holder cirka halvtreds dråber. Efter indlæsning dråberne, blev låget anbragt på en vævsdyrkningsplade indeholdende 6 ml sterilt PBS og inkuberet i 48 timer for at lette cellulær aggregering og sfæroide formation. De nyligt formede sfæroider blev derefter overført til 10 cm suspension plader indeholdende DMEM og 2% FBS for at forhindre cellebinding til skålen. Suspension plader blev fremstillet ved at tilsætte 8 ml poly-HEMA-opløsning (Sigma-Aldrich P3932, 10 mg /ml) i 95% ethanol til sterile polystyren petriskål plader (Fisher Scientific). Pladerne blev derefter inkuberet i 24 timer i et sterilt miljø for at tillade ethanol at fordampe. Før anvendelse blev pladerne vasket med sterilt PBS for at fjerne eventuelle ethanol eller andre forureninger. Hver suspension plade kan indeholde op til 100 sfæroider. Efter overførsel blev sfæroiderne behandlet med vehikel eller med 10 ng /ml TNF og 2 ng /ml TGFp, og inkuberet i 48 timer. Efter inkubation blev cellerne underkastet en anden behandling af køretøj eller TNF og TGFp, og inkuberet i yderligere 48 timer. Sfæroiderne blev derefter opsamlet og analyseret ved forskellige assays.

immunfluorescensmikroskopi

A549-celler blev podet på dækglas og underkastet EMT induktion eller venstre ubehandlet. Efter induktion blev cellerne fikseret i 100% methanol og efterfølgende inkuberet med primære antistoffer mod det ekstracellulære domæne af E-Cadherin (SCBT, sc-7870). En AlexaFlour-konjugeret gede-anti-kanin-antistof (Invitrogen) blev anvendt som et sekundært antistof, og indirekte immunofluorescens af E-cadherin blev afbildet under anvendelse af et Nikon E3800 fluorescensmikroskop.

Migration og Invasion

In vitro Salg migration og invasion assays blev udført ifølge producentens protokol (BD Biosciences). 2D og 3D kulturer blev opdelt efter trypsin og efterfølgende talt. 1 × 10

5 celler (migration) eller 1 x 10

4 celler (invasion) blev udsået i almindelig DMEM i den øverste brønd i en Transwell kontrol plade (BD 354.578) eller Matrigel invasion plade (BD 354.480). Den nederste brønd blev fyldt med DMEM indeholdende 10% FBS som en kemoattraktant, og pladerne blev inkuberet i otte timer (migration) eller fireogtyve timer (invasion) ved 37 ° C og 5% CO

2. Bagefter blev cellerne på den øvre side af membranen fjernet, og de tilbageværende celler blev fikseret i 100% methanol og farvet med 0,1% krystalviolet. De farvede celler blev afbildet og kvantificeres ved hjælp af Adobe® Photoshop.

Tumor model

Monolagskulturer (2D) og 3D A549 kulturer, som var blevet efterladt ubehandlet eller behandlet med TNF og TGFp blev trypsiniseret, resuspenderes i DMEM /0,5% FBS, og omhyggeligt talt og fortyndet i det passende volumen til injektion. Celler blev subkutant (SC) injiceret i kvindelige udavlede Crl: nu /nu nøgne mus (Charles River). Fem mus blev injiceret pr eksperimentel betingelse. Alle dyreundersøgelser blev udført som tre uafhængige forsøg. Mus blev aflivet fyrre dage efter injektion. De primære SC tumorer blev fjernet og vejet. Derudover blev lungerne fjernet, fikseret i formalin, og overfladen lungemetastaser blev talt. For at kvantificere mængden af ​​total tumorbyrde i formalin-fikserede lungevæv blev genomisk DNA ekstraheret [37] og undersøgt for tilstedeværelsen af ​​humant genomisk materiale som beskrevet under anvendelse kvantitativ realtids-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) primere specifikke for human endogene retrovirus-3 (ERV3, tabel S1) [38], [39].

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med henstillingen fra Animal Care og brug Udvalg (ACUC) fra University of Virginia. Protokollen blev godkendt af ACUC Number 3914. Alle forsøg blev afsluttet efter 40 dage på hvilket tidspunkt SC tumorer var mindre end 1,0 cm

3 i størrelse; således, begrænser tumorbyrde. blev gjort alt for at minimere smerte og lidelse.

QRT-PCR, immunblots, og elektroforetiske mobilitet shift assays (EMSAs)

QRT-PCR og immunoblot blev udført som beskrevet tidligere [28 ]. PCR-primere er vist i tabel S1. Nukleare ekstrakter blev fremstillet under anvendelse af sfæroider fra A549.V og A549.I cellelinier behandlet med eller uden TNF og TGFp. EMSAs og supershift blev udført som beskrevet tidligere [40].

Statistik

Når det er relevant, blev der sammenligninger mellem forsøgsgrupper udføres ved at udføre en ensidet Students

t

test i Microsoft excel. Data for alle eksperimenter blev betragtet som statistisk signifikant, når p. 0,05

Resultater Salg

En model til at studere EMT i NSCLC

TNF har vist sig at forstærke TGFp-medieret EMT gennem aktiveringen af ​​co-stimulerende veje [15]. For at bekræfte denne observation i vores tre-dimensionelle (3D) model blev en tidsforløbet udført ved hjælp af begge cytokiner i tandem og alene. Flercellede sfæroide kulturer blev oprettet ved hjælp af en modificeret hængende dråbe metoden [36]. Efter to dage blev sfæroider suspenderet i poly-HEMA overtrukne plader og behandlet hver anden dag med de angivne cytokiner at inducere EMT (figur 1A). Prøver blev opsamlet fra ubehandlede (0 dage) og cytokin-behandlede kulturer (1-8 dage). Epithelial (E-cadherin) og mesenchymale (N-cadherin, vimentin, og fibronectin) markører blev målt ved immunoblot. Behandling med TNF resulterede i en beskeden stigning i N-cadherin og fibronectin, men undlod at vise forskelle i andre markører (figur 1b). I overensstemmelse med induktionen af ​​EMT, TGFp behandling resulterede i et tab af E-cadherin ekspression og en stigning i N-cadherin, vimentin, og fibronectin. Endvidere co-stimulering med TNF og TGFp gav et mere mesenchymal fænotype og bestod under ottendedagen tidsforløbet (figur 1B). Vigtigere, stimulation med TNF og TGFp effektivt induceret EMT i både A549 og H358 cellelinjer inden for fire dages behandling, sammenlignet med H1299, som allerede viser ændringer i E-cadherin og vimentin (figur 1C). Baseret på resultaterne i Figur 1, brugte vi de fire dages tidsramme hele vores resterende eksperimenter.

(A) En tidslinje viser proceduren bruges til at skabe en tredimensionel mesenchymale cellepopulation fra sammenflydende monolag. (B) sfæroid kulturer af A549-celler blev behandlet med TNF, TGFp, eller begge cytokiner hver otteogfyrre timer i de angivne tidsrum. Immunoblotanalyse målte ændringer i epithelial (E-cadherin) og mesenchymale (N-cadherin, vimentin, og fibronectin) markører over en otte dag tidsforløb. (C) 3D kulturer af multiple NSCLC cellelinier (A549, H358, H1299) blev inkuberet i seksoghalvfems timer i fravær eller nærvær af TNF og TGFp. Epitel- og mesenchymal markører blev efterfølgende målt ved immunoblot. Resultater fra figur 1B og 1C er repræsentative eksempler fra mindst tre uafhængige forsøg; α-tubulin fungerer som et protein lastning kontrol.

3D kulturer undergår EMT mere effektivt end 2D kulturer

For at afgøre, om 3D-A549 kulturer undergår EMT mere effektivt end todimensionale (2D ) monolagskulturer målte vi ekspression af epitel- og mesenchymale markører som reaktion på stimulering med TNF og TGFp som beskrevet i figur 1. Efter cytokin behandling, 3D kulturer viser signifikant tab af

CDH1 /E-cadherin

ekspression sammenlignet til 2D kulturer (figur 2A). Desuden sfæroiderne også besidder forøget ekspression af mesenkymale markører

VIM

,

HMGA2

, og EMT mester-switch transkriptionsfaktorer,

TWIST1

,

SNAI1 /Snail1

,

SNAI2 /Slug

ZEB2 /Sip1

(figur 2A og 2B). Immunoblotanalyse af kugleformede kulturer bekræfter, at forskellen mRNA-ekspression resulterede i en tilsvarende ændring i protein-niveauer (figur 2C). Derudover undersøgte vi ændringer i cellulær morfologi og E-cadherin lokalisering ved mikroskopi. Både 2D og 3D kulturer blev behandlet med cytokiner som beskrevet, trypsiniseret, re-udpladet på dækglas, og indirekte immunfluorescensfarvning blev udført atten timer senere. Som forventet, ubehandlet monolag og sfæroide A549 prøver viste robust E-cadherin udtryk, selvom junktionel lokalisering optrådte formindsket i celler fra 3D-kulturer (Figur S1). Endvidere celler afledt af cytokin-behandlede sfæroider viste forøget tab af E-cadherin i sammenligning med 2D-behandlede prøver, hvilket antyder, at 3D-kulturer undergik mere effektiv EMT. Resultaterne vist i figur 2 og figur S1 illustrerer signifikant EMT induktion i 3D-kulturer som målt ved ændringer i mesenkymale markører, EMT mester-switch transkriptionsfaktor ekspression og cellulær morfologi.

(A og B) monolag (2D) og 3D kulturer af A549 celler blev efterladt alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGF (TNF /TGF) i halvfems-seks timer. Angivelse af epitelial markører (

CDH1

), mesenkymale markører (

VIM, HMGA2

), og EMT mester-switch transkriptionsfaktorer (

TWIST1, SNAI1, ZEB2, SNAI2

) blev målt ved QRT-PCR. (C) Immunoblotanalyse af 3D A549 kulturer, alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGF (TNF /TGF), blev udført på E-cadherin, vimentin, HMGA2, Twist1, Snail1, Sip1, Slug, og α- tubulin. Resultater i figur 2A og 2B blev normaliseret til

GAPDH

, og beregnes middelværdi ± SD, * p 0,05, N = 3. Immunoblots i figur 2C er repræsentative eksempel fra mindst tre uafhængige forsøg

.

mesenchymale NSCLC celler er invasive og endogent udtrykkelige gener er kendt for at fremme stamceller-lignende egenskaber

Fænotypisk, mesenkymale celler har høje migration satser og udskiller enzymer, der nedbryder ekstracellulære matrix for at lette cellulær invasion. Brug

in vitro

transwell analyser, vi målte migrationen og invasion karakteristika A549 celler dyrket som enten 2D eller 3D kulturer. Interessant, viste ubehandlede 3D sfæroide kulturer højere migration end 2D monolagskulturer (figur 3A, venstre). Men behandling af 3D kulturer med TNF og TGFp yderligere forstærket migration, når sammenlignet med ubehandlede 3D kulturer. Sphæroider behandlet med cytokiner invaderet gennem Matrigel mere effektivt end nogen anden betingelse (figur 3A, højre). Derudover cytokin behandlet A549 sfæroider vises opreguleret ekspression af

MMP9

,

LOX

, og

COL22A1

(figur 3B), gener, der vides at potensere invasion [41], [42 ]. Disse resultater viser, at dyrkning af 3D sfæroider i nærvær af TNF og TGFp etablerer en stærkt invasiv mesenchymale population. Endelig viste cytokin-behandlede sphæroider endogene opregulering af markører associeret med de-differentiering og vedligeholdelse af CIC [43] – [48], herunder

KLF4, SOX2, POU5F1 /Oct4, MitCN

, og

KIT

(figur 3C). Data vist i figur 3 indikerer, at co-stimulering af sfæroider med TNF og TGFp fremmer fænotypiske forandringer i A549-celler, som resulterer i forøget invasion og ekspression af genprodukter er forbundet med stamceller-lignende egenskaber. Salg

Monolagskulturer og 3D A549-kulturer blev efterladt alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGF (TNF /TGF) i halvfems-seks timer. (A) Celler blev opdelt og efterfølgende udsat for migration og invasion-assays. (B og C) Ekspression af invasion (

MMP-9, LOX, COL22A1

) og stamcellemarkører (

KLF4, Sox2, POU5F1, MitCN, og KIT

) blev målt ved QRT- PCR. Resultater i figur 3 beregnes middelværdi ± SD, * p. 0,05, N = 3. Resultater fra 3B og 3C blev normaliseret til

GAPDH

mesenchymceller er meget metastatisk og display kræft initierende fænotyper

for at undersøge, om induktion af EMT fremmer udviklingen af ​​CIC

in vivo

, vi udnyttet en xenograft tumor model i nøgne mus. TNF og TGFp behandlet 2D og 3D-kulturer var opdelt og cellesuspensioner var SC injiceret i den højre flanke hos nøgne mus. Fyrre dage senere blev dyrene aflivet, og SC tumorer blev reseceret og vejet, mens lungerne blev udskåret og scoret for overfladevand metastaser. Til vores overraskelse, TNF og TGFp-behandlede celler ikke udgjorde SC tumorer i samme omfang som cytokin-behandlede 2D kulturer (figur 4A, venstre). Imidlertid undersøgelse af lungeoverfladen i disse mus afslørede omfattende metastase (figur 4A, højre). Den eneste plausible forklaring på disse resultater er, at mesenkymale celler fra 3D kulturer invaderet og metastaseret til lungerne uden at udvikle SC tumorer.

(A) Monolagskulturer og 3D A549 kulturer blev behandlet med TNF og TGFp i halvfems-seks timer . Celler blev disaggregeret og SC injiceret i nøgne mus (1 x 10

6 celler /dyr). Fyrre dage senere blev de primære SC tumorer resekteret og vejet. Derudover blev lungerne udskåret og antallet af overflade- metastaser var bestemme. (B) Monolagskulturer og 3D A549 kulturer blev enten efterladt ubehandlet eller behandlet med TNF og TGFp og begrænsende celleantal (1 × 10

3 /dyr) var SC injiceret i nøgne mus for at vurdere tilstedeværelsen af ​​CIC. Metastase blev bedømt ved overfladen lungetumor tælle og lunge tumorbyrde blev vurderet ved anvendelse af genomisk QRT-PCR til påvisning af humant DNA i alt lungevæv. Vægt og lungemetastaser data fra figur 4 er gennemsnit ± S.D. af fem mus pr betingelse, * p 0,05, N = 3 uafhængige forsøg. Genomisk QRT-PCR data fra figur 4B er normaliseret til total lungevæv (mg).

Måling af omfanget af metastase under begrænsende cellefortynding viser en pålidelig test for tilstedeværelsen af ​​berigede CIC i epitel-afledte tumorer [49]. Derfor er eksperimenter blev gentaget ved anvendelse af en tusind celler pr SC injektion. Cellesuspensioner, der stammer fra TNF og TGFp behandlede sfæroider, produceret flere overflade lungemetastaser under begrænsende cellefortynding end cytokin-behandlede monolag eller ubehandlede 3D kulturer (figur 4B venstre). Begrænsende cellefortynding assays indikerer, at induktionen af ​​EMT i 3D kulturer frembringer en CIC befolkning, der effektivt metastaserer til lungerne. Som forventet, analyse af DNA isoleret fra muselunger bekræftede tilstedeværelsen af ​​metastatisk byrde og kontrolleret, at læsionerne var af human oprindelse (figur 4B højre). Vi konkluderer fra eksperimenterne i figur 4, at de-differentiering, CIC dannelse, og metastatisk potentiale er alle væsentligt højere i EMT-inducerede sfæroide kulturer.

NF-KB er konstitutivt aktiv i 3D kulturer og er nødvendig til induktion af EMT

TNF, en potent NF-KB-aktivator, øger induktion af EMT i NSCLC cellelinjer. Derfor har vi vurderet, om EMT induktion resulterer i aktivering af NF-KB-signalering ved immunoblot. Interessant mesenkymale A549 sfæroider viste konstitutiv IKK-aktivitet som målt ved phospho-specifikke antistoffer, der registrerer kBa pS32 og RelA pS536 (figur 5A og figur S2A). Skift i E-cadherin og vimentin niveauer bekræftet effektiv EMT i cytokin-behandlede sfæroider. Desuden QRT-PCR eksperimenter viste forøget ekspression af NF-KB-regulerede gener

IL8

BIRC3 /cIAP2

i mesenchymale 3D-kulturer (figur 5B). Tilsammen indikerer disse data, at cytokin-behandling af 3D A549 kulturer resulterer i øget phosphorylering af IKK-regulerede substrater og konstitutiv NF-KB transkriptionel aktivering.

Monolagskulturer og 3D kulturer af A549-celler blev inkuberet med cytokiner i halvfems -seks timer. (A) Mesenkymale A549 celler udviser konstitutiv NF-KB aktiverede veje, som bestemt ved anvendelse phospho-specifikke antistoffer mod kBa og RelA. (B) Ubehandlet og TNF og TGFp stimuleret 2D og 3D kulturer af A549-celler blev høstet og analyseret for ekspression af NF-KB regulerede gener ved QRT-PCR. (C og D) Tredimensionelle kulturer af A549.V (vektorkontrol) og A549.I (SR-IKB) blev inkuberet i seksoghalvfems timer i fravær eller nærvær af TNF og TGFp. (C) Immunoblots bekræfte ekspressionen af ​​FLAG-mærket SR-kBa i A549.I linje, som med succes blokeret nuklear translokation og DNA-binding, som målt ved EMSA. (D) QRT-PCR bekræftede den manglende evne af A549.I celle at opregulere NF-KB-regulerede gener følgende TNF og TGFp behandling. Immunoblots i figur 5A er et repræsentativt eksempel fra tre uafhængige forsøg. Resultater i figur 5B og 5D beregnes middelværdi ± SD, * p 0,05, N = 3. RNA-værdier blev normaliseret til

GAPDH

For at bestemme betydningen af ​​NF. KB-aktivitet under induktion af EMT i NSCLC cellelinjer, blev stabile klonede puljer udtrykker den super-repressor kBa (SR-kBa) genereret. SR-kBa er modstandsdygtig over for proteasomalaktivitet nedbrydning og følgelig sekvestrerer NF-KB i cytosolen. Celler, der udtrykker SR-kBa proteinet viser derfor en inhibering af NF-KB-medieret transkription [50]. Figur 5C (øverst) bekræfter udtryk for Flag-mærket SR-kBa i A549 stabile celler (A549.I) sammenlignet med tomme vektor kontrol celler (A549.V). Endvidere nukleare proteinekstrakter fra A549.I sfæroide kulturer, behandlet med TNF og TGFp, manglede NF-KB-DNA-bindingsaktivitet sammenlignet med A549.V ekstrakter (figur 5C, nederst). Supershift eksperimenter bekræfter, at NF-KB-aktivitet består overvejende af en RelA-P50 heterodimer kompleks (fig S2B). QRT-PCR-analyser viser, undertrykte cytokin-medieret induktion af

IL8

BIRC3 /cIAP2

i A549.I celler sammenlignet med kontrol celler A549.V (figur 5D). I modsætning til høje doser af TNF (100 ng /ml), lave doser (10 ng /ml) resulterede ikke i et tab af cellelevedygtighed i A549.I linjer, eftersom ekspression af huset holde genet, HPRT, ændrede sig ikke og blev anvendt til normalisering i figur 5D. Disse data bekræfter, at SR-kBa ekspression i A549.I cellelinien effektivt blokerer NF-KB transkriptionel aktivitet.

Karakterisering af NF-KB i potensering af mesenkymale fænotype

NF-KB har været vist at regulere ekspressionen af ​​EMT mester-switch transkriptionsfaktorer i flere modelsystemer [21] – [24]. Derfor vi hypotese, at hæmme NF-KB-aktivitet i A549.I cellelinje ville dæmpe EMT induktion. Immunoblotanalyse bekræftede, at A549.I celler ikke nedregulere E-cadherin ekspression eller opregulere mesenchymale markører (vimentin, N-cadherin og fibronectin) sammenlignet med kontrolceller (figur 6A). Desuden viste cytokin-behandlede A549.I celler kun minimal opregulering af

TWIST1

,

ZEB2

og

SNAI2

genekspression efter TNF og TGF behandling (figur 6B). Disse resultater viser, at NF-KB er forpligtet til at opregulere

TWIST1

,

ZEB2

og

SNAI2

, mens ekspressionen af ​​

SNAI1

synes uafhængig af NF KB-afhængig transskription i A549.I cellelinie. Disse resultater tyder på, at ekspressionen af ​​kritiske EMT mester-switch transkriptionsfaktorer kræver NF-KB-aktivitet.

(A) A549.I celler undlader at vise ændringer i mesenkymale markører, bestemt ved immunoblotanalyse. (B) NF-KB er påkrævet for at opregulere mRNA-ekspression af mester-switch transkriptionsfaktorer. (C) sfæroide kulturer af A549 og H157 cellelinjer, der udtrykker tom vektor eller Flag-IKB super-repressor, blev efterladt alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGF (TNF /TGF) i halvfems-seks timer. Cellerne blev opdelt og underkastet invasion assays. (D) A549.V og A549.I 3D kulturer blev efterladt alene (Ingen Add) eller behandlet med TNF og TGF (TNF /TGF) i halvfems-seks timer. Cellerne blev opdelt og SC injiceret i nøgne mus (1 x 10

6 /dyr). Fyrre dage senere blev dyrene aflivet, og antallet af overfladen lunge metastase blev bestemt. Desuden blev SC tumorer udskåret og våd tumorvægt bestemt. Vægt og lungemetastaser data fra figur 6 er gennemsnit ± standardafvigelse af fem mus pr betingelse, * p 0,05, N = 3 uafhængige forsøg. Graferne i figur 6 er gennemsnit ± S.D., * p 0,05, af tre uafhængige forsøg. Data med

P

værdier større end 0,05 blev anset for ikke signifikant (

ns

). QRT-PCR-forsøg normaliseres til

GAPDH

udtryk.

Dernæst vi vurderet, om NSCLC krævede NF-KB for invasion hjælp Transwell analyser. Hæmmet NF-KB-aktivitet i A549.I celler afskaffet invasion gennem Matrigel sammenlignet med styreledningerne (Figur 6C). Denne virkning blev ikke cellelinje specifikt, da en anden NSCLC der udtrykker SR-IKB (H157.I) viste lignende resultater som A549.I celler. Fordi data vist i figur 6 viser, at NF-KB er påkrævet for NSCLC underkastes EMT, testede vi A549.V og A549.I celle for deres evne til at metastasere til lungerne under anvendelse af en nøgen musemodel. Som forventet, cytokin-behandlede A549.I celler mislykkedes at danne lungemetastaser (figur 6D, venstre). Den manglende evne af disse celler til at metastasere til lungerne skyldtes ikke et tab af cellelevedygtighed eller manglende evne til dannelse af primære tumorer, eftersom ubehandlet A549.I dannet SC tumorer med lignende vækstrater som A549.V celler (figur 6D, højre). Således data vist i figur 6 indikerer, at TNF og TGFp behandlede 3D NSCLC kulturer kræver NF-KB at opregulere mester-switch transkriptionsfaktorer, inducerer EMT, og fremme invasive egenskaber. Desuden uden NF-KB transkriptionel aktivitet A549 celler mister deres evne til at metastaserer til lungerne uden at påvirke primær tumor vækst.

Discusson

NF-KB regulerer EMT at forstærke metastatisk progression af NSCLC

Vi implementeret en enkel og relativt hurtig 3D-kultur-system til at undersøge betydningen af ​​NF-KB-signalering under EMT induktion og CIC formering inden NSCLC cellelinjer. Som reaktion på TNF og TGFp eksponering, A549 sfæroide kulturer udviste et tab af E-cadherin og forhøjet ekspression af mesenchymale markører, N-Cadherin, vimentin, og fibronectin. Den øgede ekspression af mesenkymale proteinmarkører sandsynligvis opstår på grund af induktion af EMT mester-switch transkriptionsfaktorer,

TWIST1

,

SNAI1

,

SNAI2

og

ZEB2

. Desuden sfæroide populationer af mesenkymale A549 celler viser forhøjet udtryk for endogene transkriptionsfaktorer kendt for at forstærke dedifferentiering, herunder

KLF4

,

SOX2

,

POU5F1

,

MitCN

og

KIT

. Interessant mesenkymale A549-celler fra kugleformede kulturer undladt at frembringe store SC tumorer, sammenlignet med 2D kulturer. Trods denne effekt, cytokin-behandlede 3D A549-celler viste forhøjede lunge overflade metastatiske læsioner. Disse resultater understøtter den hypotese, at CIC’er ekstravaseret i kredsløbssystemet og metastaserer til lungerne uden dannelse SC tumorer. Vi endvidere dokumenteret, EMT-inducerede A549 3D kulturer effektivt metastaserer til lungerne under begrænsende celle fortyndinger, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af ​​en beriget “stamceller-lignende” CIC befolkning.