PLoS ONE: Hsa-miRNA-765 som en nøgle Mediator til hæmning vækst, migration og invasion i Fulvestrant-behandlet Prostata Cancer

Abstrakt

Fulvestrant (ICI-182.780) er for nylig blevet vist sig effektivt at undertrykke prostatakræft cellevækst

in vitro

in vivo

. Men det er uklart, om microRNA spille en rolle i reguleringen af ​​onkogen ekspression i fulvestrant-behandlede prostatacancer. Her denne undersøgelsesrapporter

HSA-MIR-765

som den første fulvestrant-drevet, ERp-reguleret miRNA udstiller betydelige tumor suppressor aktiviteter som fulvestrant, mod prostatakræft cellevækst via blokering af celle-cyklus progression i G2 /M overgang, og celle migration og invasion eventuelt via reduktion af filopodia /intens stress-fiber formation. Fulvestrant viste sig at opregulere

HSA-miR-765

udtryk gennem rekruttering af ERp til 5′-regulatoriske-regionen i

HSA-miR-765

. HMGA1, et onkogent protein i prostatakræft, blev identificeret som en downstream mål for

HSA-miR-765

fulvestrant i cellebaserede eksperimenter og en klinisk undersøgelse. Både antiøstrogen og

HSA-miR-765

efterligner undertrykt HMGA1 proteinekspression. I en neo-adjuvant undersøgelse, niveauer af

HSA-MIR-765

blev forøget og HMGA1 ekspression blev næsten fuldstændig tabt i prostatacancer prøver fra patienter behandlet med en enkelt dosis (250 mg) af fulvestrant 28 dage før prostatektomi . Disse resultater afslører en hidtil ukendt fulvestrant signaleringskaskade involverer ERp transkriptionel opregulering af

HSA-MIR-765

som undertrykker HMGA1 proteinekspression som en del af den mekanisme, der ligger til grund tumor suppressor virkning af fulvestrant i prostatacancer.

Henvisning: Leung YK, Chan QK-Y, Ng CF, Ma FM-T, Tse HM, Til KF, et al. (2014) Hsa-miRNA-765 som en nøgle Mediator til hæmning vækst, migration og invasion i Fulvestrant-behandlet prostatakræft. PLoS ONE 9 (5): e98037. doi: 10,1371 /journal.pone.0098037

Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA

Modtaget: Januar 21, 2014 Accepteret: April 28, 2014; Udgivet: May 16, 2014

Copyright: © 2014 Leung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Hongkong Grant Fund University Råd-General Research (M469107 til KML) og kinesiske University of Hong Kong Direkte Research Grants (CU2041252 og CU2041563 til KML), en Veterans Affairs Merit Award (I01BX000675 til SMH) og tilskud fra National Institutes of Sundhed (ES019480, ES020956, ES015584, ES006096, CA112570, CA015776 til SMH) og en bevilling fra Investigator-sponsoreret studie Program for AstraZeneca (til JM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Jodi Maranchie modtog Investigator-sponsoreret studie Program for AstraZeneca. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Den normale udvikling og ondartet vækst af prostata reguleres ikke kun af androgener, men også af østrogen [1]. Østrogenreceptoren (ER) β er den vigtigste receptor udtrykt i prostata epitel og i flere stadier af prostatacancer (PSA), herunder knoglemetastaser [2], [3]. Det syntetiske østrogen diethylstilbestrol (DES), gennem sin androgen-berøvelse handling, var engang frontlinjen behandling for metastatisk PCa [1], [4]. DES sidst mistede fordel på grund af dens høje kardiovaskulære toksicitet og tromboembolisk risiko [5], [6], med parenteral østradiol-17β (E2) vinder seneste popularitet som en terapi for metastatisk, kastrationsresistent PCa (CRPC) [7], [ ,,,0],8] på grund af sin lave kardiovaskulær toksicitet profil og beskyttende virkning mod knogleskørhed [9]. Andre selektive ER-modulatorer (fx tamoxifen, toremifen, og reloxifene) er blevet undersøgt i kliniske forsøg, men viste sig at have begrænset effekt sammenlignet med DES [10] – [13]. Med godkendelsen i 2005 af fulvestrant (ICI 182.780), en ren østrogen receptor antagonist uden kendt agonistisk handling, til behandling af receptor-positiv metastatisk brystkræft, har interesse i dets anvendelse til CRPC opstået.

I prækliniske modeller, har fulvestrant demonstreret funktioner i en lovende terapi til PCA. I en østrogen-induceret PCa model [14] – [17], fulvestrant forhindrede udviklingen af ​​forstadier til kræft, vendt E2-induceret transkriptom [16], [17], og inducerede sin egen gen signatur [16]. I DU145, en human PCa cellelinie, som udtrykker ERp og ingen ERa, fulvestrant undertrykte cellevækst via receptoren [18] og reguleret et unikt sæt af gener, eventuelt gennem krydstale mellem ERp og NFKB [19]. Endvidere fulvestrant undertrykte væksten af ​​DU145 og PC-3 xenotransplantater gennem en ERp-medieret KLF5 signalvejen [20] og også inhiberede LNCaP-cellevækst ved nedregulering androgenreceptoren [21].

I den eneste fase II undersøgelse af fulvestrant hidtil gennemført [22], 20 CRPC patienter fik en belastning-dosis regime (500 mg på dag 0 og derefter 250 mg på dag 14, dag 28, og månedligt derefter). Efter seks måneders behandling blev fulvestrant veltolereret, selvom ikke blev observeret nogen gunstig klinisk eller PSA respons [22]. Men ved at øge startdosis i den første måned (500 mg hver 14 dage), PSA-niveau blev effektivt ved 40-99% inden for 0.27-2.67 måned i seks af de syv meget forbehandlede CRPC patienter uden nogen indlysende toksicitet [23 ]. Sidstnævnte fund underbygger udføre mere forskning i dosis optimering og dybdegående mekanistiske studier af fulvestrant som en terapi for PSA.

MikroRNA’er (miRNA) er små (17-25 nukleotider) ikke-kodende RNA, der regulerer posttranskriptionel genekspression. Hver miRNA kan binde til en eller flere målsekvenser i 3′-utranslaterede region af sit mål transkripter og fremkalde nedbrydning af mRNA eller suppression af proteintranslation, afhængigt af graden af ​​komplementær baseparring [24]. En enkelt miRNA regulerer normalt ekspression af et stort antal transkripter [25] – [27]. Afvigende ekspression af specifikke miRNA giver en vækstfordel til cancerceller end normale celler ved at ødelægge flere onkogene /tumor-suppressor pathways. Der er identificeret PCa-specifikke miRNA [28] – [30], og nogle er androgen-relateret [31]. Til dato, men ingen enkelt miRNA har været forbundet med østrogener eller anti-østrogener i PSA.

Her undersøgte vi rollen som miRNA i mediering af virkningen af ​​fulvestrant i PSA. Global profilering af miRNA-ekspression i DU145 celler identificeret

HSA-miR-765

som fulvestrant-reguleret miRNA. Promotor analyser defineret en minimal sekvens i 5′-regulatoriske område af

HSA-miR-765 Hoteller, som rekrutterer ERp, og det er afgørende for fulvestrant regulering. Virkningerne af miRNA på PCa cellevækst, migration og invasion blev sammenlignet med dem af fulvestrant. Afhængigheden af ​​fulvestrant handlinger på ERp blev påvist ved Knockdown eksperimenter. Ændringen i udtryk for

HSA-miR-765

og dens downstream onkogene protein, høj mobilitet gruppe AT-hook 1 (HMGA1), blev vurderet i prostatektomi prøver fra patienter, efter at de var blevet behandlet med fulvestrant for en måned.

Materialer og metoder

Fulvestrant behandling

DU145 og PC3 cellelinjer blev købt fra ATCC (Manassas, VA). DU145-celler (ATCC) blev opretholdt som tidligere beskrevet [18]. PC3 (ATCC) celler blev dyrket i RPMI 1640 med 10% varmeinaktiveret FBS (hiFBS). Identiteten af ​​hver cellelinje er for nylig blevet bekræftet af ATCC hjælp korte tandem repeat profilering metode. Alle celler blev holdt i 5% trækul-strippet hiFBS medium i 24 timer før lægemiddelbehandling. Cellerne blev behandlet med enten 10

-6 M fulvestrant i 0,1% eller 0,1% ethanol. Kontrol kulturer blev behandlet med vehikel alene.

miRNA og genekspression

For miRNA profilering, blev de samlede RNA’er udvundet og mærket direkte ved hjælp af NCode Rapid Labeling System (Invitrogen, Grand Island, NY) og ordnet på NCode menneskelige miRNA Microarray V3 (Invitrogen).

Tissue ekspression af miRNA blev undersøgt ved at ekstrahere totale RNA’er fra kryosektioner (5-10 um) under anvendelse af RNAzol RT (Molecular Research center, Cincinnati, OH), poly (A) -tailed og revers transkriberet med universal RT-primer under anvendelse af NCode microRNA første streng cDNA (Invitrogen). Real-time PCR blev udført med SYBRGreen PCR Master-Mix (Invitrogen) under anvendelse af enten

HSA-MIR-765

specifik eller spliceosomal U6 lille nukleare RNA (RNU6) -specifik QRT fremadrettet primer (tabel S2) og en universal reverse qPCR primer (Invitrogen).

Totale RNA’er blev forberedt med tilfældig hexamer (Invitrogen). Ribosomprotein 3 (RPS3, tabel S2) blev anvendt som husholdning kontrol. Relativ genekspression blev bestemt ved den ΔΔC

metode T [32].

Kliniske prøver

Patienter med histologisk bekræftet, klinisk lokaliseret PCa fik en enkelt intramuskulær injektion af 250 mg fulvestrant , 28 dage før en planlagt radikal retropubisk prostatektomi. Patienter blev udelukket, hvis de havde en hvid blodlegemer 3000 /pl, et blodpladetal 100.000 /pl, hæmoglobin 11 g /dl, INR 1,6 eller bilirubin AST eller kreatinin niveauer 1,5 gange den øvre grænse for normalområdet. Patienterne blev også udelukket, hvis de kræves kortikosteroider til behandling af andre systemiske sygdomme eller havde en fortid med kongestiv hjerteinsufficiens, aktiv angina, infektion, eller aktiv anden malignitet. Alle emner havde en endelig Gleason beløb på 6 eller 7 ved prostatektomi. Prøver fra ubehandlede patienter med en lignende Gleason sum og alle prøver fra fulvestrant-behandlede patienter blev opnået fra University of Massachusetts Medical School (UMMS) under en protokol (PI. Dr. Maranchie) er godkendt af Udvalget til Beskyttelse af forsøgspersoner i forskning and Institutional Review Board på UMMS. Alle emner forudsat skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse, og de blev de-identificeret.

Knockdown af ERp

siRNA’er for ERP eller scramble siRNA (Invitrogen) blev transficeret ind DU145 celler (2 x 10

5) ved hjælp af X-tremeGENE (Roche, Indianapolis, IN). SiRNA-behandlede celler blev behandlet med enten fulvestrant eller ethanol i yderligere 2-4 dage og derefter udsat for real-time RT-PCR, promotoraktivitet analyse, cellevækst assay og F-actin-farvning.

5 ‘reguleringsmyndigheder region analyser

5′ opstrøms genomiske regioner af

HSA-miR-765

forløber (CHR1:. 156,906,923-156,906,036 tiltrædelsespartnerskaber ingen NC_000001.10) -3.208-100 var forstærket og klonet ind pGL3-basisk (Promega, Madison, WI) som

pGL3-HSA-miR-765

. Serielle deletioner fra 5′-enden af ​​det klonede sekvens i vektoren blev udført for at generere pGL3-MIR-765-Δ1192 bp (DNA-sekvens fra -2016 til +100), pGL3-MIR-765-Δ1766 bp (DNA-sekvens fra – 1442 til +100), pGL3-mIR-765-Δ2414 bp (DNA-sekvens fra -792 til +100), pGL3-mIR-765-Δ2618 bp (DNA-sekvens fra -590 til +100), pGL3-mIR-765- Δ2972 bp (DNA-sekvens fra -236 til +100), og pGL3-mIR-765-Δ3113 bp (DNA-sekvens fra -95 til +100). Reporter aktiviteter i andre trunkerede eller muterede vektorer i DU145-celler blev bestemt med eller uden fulvestrant og /eller ERp siRNA knockdown hjælp af dual luciferase reporter assay-systemet (Promega).

miRNA målretning reporter assay

DU145-celler blev transficeret med luciferase reporter vektor pMIR-mIR-765, som blev klonet med komplementær sekvens af HSA-mIR-765 som perfekt mIR-765 target og derefter behandlet med enten HSA-mIR-765 efterligner eller negativ-kontrol mimic. Lysaterne blev underkastet den dobbelte luciferase reporter assay. Den 3′-translationel region

høj mobilitet gruppe AT-hook 1 Hotel (

HMGA1

) gen (+ 8026- + 9332) blev genereret ved PCR (primere i tabel S2) og klonet ind pMIR-RAPPORT (Invitrogen) som

pMIR-HMGA1-3UTR

.

HSA-miR-765

mimic (sekvens i tabel S2) blev klonet i pMIR som

pMIR-miR-765

. Effekten af ​​

HSA-miR-765

efterligne på luciferaseekspression blev bestemt ved luciferaseanalyse (Promega), med

pMIR-tom

inkluderet som en kontrol.

kromatin immunpræcipitationsassay

chromatin immunopræcipitation (chip) assays blev udført ifølge publicerede metoder [19]. Kort fortalt blev DU145-celler behandlet med fulvestrant eller kontrol i 45 minutter. DNA-proteinkomplekser blev tværbundet med 1% formaldehyd. Nukleare komplekser blev sonikeret (250-500 bp). Fem mikrogram af muse IgG (Millipore, Billerica, MA), anti-RNA-polymerase II (Millipore) eller anti-ERβ1 (Serotec, Raleigh, NC) antistoffer blev anvendt til overnatning immunpræcipitation. De DNA-proteinkomplekser blev vasket og elueret. Immunopræcipiterede DNA blev renset op, reverse-tværbundet og renset. PCR og realtime PCR afslørede rekruttering af ERp til en sekvens i 5′-regulatoriske region af

HSA-miR765 Salg (primere er anført i tabel S2).

0N

promotor af ERp [33] blev anvendt som en ikke-ERp bindende kontrol for dette eksperiment.

Cell-vækst assay

Virkninger af fulvestrant eller

HSA-mIR-765

-mimic behandling på DU145 eller PC3 cellevækst blev bestemt ved CellTiter 96 Ikke-radioaktivt celleproliferationsassay (Promega). For HMGA1 ektopisk ekspression eksperiment, fuld længde HMGA1 (pCMV6-AC-HMGA1, OriGene, Rockville, MD) eller en negativ-kontrol (pCMV6-AC) blev transficeret ind DU145 celler. De transficerede celler blev beriget i G418-suppleret medium i en uge. Relativ vækst DU145 celler co-behandlet med fulvestrant i 4 dage, og enten HMGA1 udtryk eller tom vektor i forhold til kontrol celler behandlet med ethanol og tom vektor blev sammenlignet.

Flowcytometri analyser

DU145 celler blev behandlet med fulvestrant /ethanol eller

HSA-miR-765

efterligner /negativ-kontrol efterligne i 2 dage. De behandlede celler blev analyseret i henhold til publicerede protokoller [32].

Western blot-analyser

Fem mikrogram protein fra cellelysat blev elektroforesebehandlet på 10 til 12,5% SDS-PAGE og underkastet Western blot analyse. Primære antistoffer, der er anført i tabel S3 blev anvendt til at detektere proteinniveauer.

Migration og invasion assays

DU145 eller PC3-celler blev behandlet med fulvestrant eller

HSA-MIR-765

mimic og deres respektive kontroller i 2 dage. Sårhelende assays blev udført som tidligere beskrevet [34]. DU145-celler blev forbehandlet med fulvestrant eller ethanol i 5 timer før migration og invasion assays blev udført [34].

Filamentøs-actin (F-actin) farvning

F-actin i fulvestrant- eller ethanol-behandlet DU145 kulturer udsat for RNAi-medieret knockdown af ERp blev

HSA-mIR-765

-mimic transfektion eller kontrolbehandling visualiseret som beskrevet tidligere [34]. Kort fortalt blev fulvestrant- og ethanol-behandlede kontrol DU145 celler med enten ERP siRNA eller negativ-kontrol siRNA farvet med TRITC-konjugeret phalloidin, og fluorescens billeder blev taget til fange.

Computational forudsigelse af miRNA mål

Miranda /mirSVR [35] (https://www.microrna.org), Targetscan R5.2 [36] (https://www.targetscan.org), RNAhybrid [37], og EIMMo2 [38 ] blev anvendt til at forudsige de formodede mål for

HSA-mIR-765

. Genomisk alignments, BLAT (https://www.ensembl.org), blev anvendt til yderligere validering af forudsagte sites.

immunfarvning af HMGA1 og AR

Frosne sektioner (5 um) af PCa prøver fra patienter behandlet eller ikke behandlet med fulvestrant før prostatektomi blev fikseret i 3% formaldehyd ved stuetemperatur og derefter med methanol ved -20 ° C. HMGA1 og AR blev immunodetekteret med 1:100 anti-HMGA1 antistof (sc 8982, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og anti-AR henholdsvis (sc 816, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i overensstemmelse med offentliggjorte protokoller [39 ]. Immunopositivitet blev bestemt ved procentdelen af ​​positivt signal (nukleare eller cytoplasmatisk) i Gleason grad 3/4 foci.

Resultater

A. Fulvestrant inhiberer cellevækst, cellecyklusfremadskriden, migration og invasion i en ERp-afhængig måde

Fulvestrant hæmmede væksten af ​​DU145 celler med 40% og PC-3-celler med 30% gennem en ERp-afhængige vej (Figur 1A, fig S1A) og standset celledeling ved G2 /M-fasen, som indikeret ved en signifikant fald i G0 /G1-cellepopulation og en ophobning af G2 /M-celler (Figur 1B). Forstyrrelsen i cellecyklusfremadskriden blev ledsaget af forøget ekspression af G2 /M markører cyclin A (G2), cyclin B (M), og phosphoryleret Cdc2 (G2), men ikke af S-fase markører de cyclin E og Cdc25C (figur 1C).

(A) Fulvestrant inducerer vækstinhibering af DU145 celler via en ERp-afhængig mekanisme. Vækst af fulvestrant-behandlede DU145 celler med eller uden ERp siRNA knockdown i 4 dage i forhold til de ethanol-behandlede kontrolceller med negativ-kontrol siRNA præsenteres og sammenlignes (n = 8). ERp ekspression blev også slået af en anden siRNA (siRNA # 2) og lignende resultater blev opnået (figur S5). (B) Fulvestrant inducerer DU145 celle-cellecyklusstandsnings ved G2 /M-fasen. Repræsentative DNA histogrammer af 48 timer fulvestrant -OR ethanol-(kontrol) behandlede celler og procentvise fordelinger af cellerne ved G0 /G1 og G2 /M-faser (n = 3) præsenteres og sammenlignes. (C) Fulvestrant inducerer ekspression af G2 /M-markører. DU145-celler blev behandlet med fulvestrant eller ethanol i 2 dage (kontrol) og cellecyklus markører blev bestemt ved Western blot analyse. To uafhængige forsøg blev udført, og en repræsentant datasæt blev præsenteret. (D) Fulvestrant undertrykker celle migration. En sårhelende assay blev udført på de fulvestrant- og ethanol (EtOH) -behandlede DU145 celler (n = 3). Repræsentative mikrografer af de fulvestrant- og ethanol-behandlede cellekulturer med ridser på 0 timer og efter 16 timer er vist. Såret er markeret med stiplede linier. (E) Fulvestrant inhiberer transwell migration (venstre felt) og invasion (højre panel) i DU145-celler (n = 3) efter 5 timers fulvestrant behandling. (F) Reduktioner af filopodial celler og celler med intense stress fibre fulvestrant (behandlet med 48 timer) via en ERP-afhængig mekanisme. Repræsentative mikrografer og procentdele af cellerne med intense stress fibre og de filopodial celler (n = 3) præsenteres. Student t-test blev udført for at bestemme signifikans med en cutoff p-værdi på 0,05. ** P 0,01; barer = SD

Fulvestrant inhiberede cellemigrering i sårhelende assay (figur 1 D), og transwell migration (figur 1E, venstre felt) og celle invasivitet i transwell invasion assay (figur 1E, højre panel) ved ~ 40% (

s Restaurant 0,01, n = 3) i DU145-celler (figur 1E) samt i PC-3-celler (figur S2). Behandling med fulvestrant reducerede signifikant andelen af ​​filopodial celler fra 90,1% til 55,9% (

s

0,005, n = 5), og af celler med intens stress fiber fra 96,4% til 64,2% (

s

0,001, n = 5) (fig 1F). RNAi-medieret knockdown af ERP effektivt vendt fulvestrant-induceret hæmning (figur 1F).

B. Fulvestrant opregulerer

HSA-miR-765

udtryk i PCA celler

Blandt de 211 påviselige miRNA, 6 meget rigelige miRNA herunder HSA-miR-185, HSA-lad-7b, HSA-miR- 765, HSA-lad-7a, HSA-miR-601, og HSA-miR-768-5p ( 300 relativ normaliseret signal intensitet) blev opreguleret efter fulvestrant-behandling ( 2-fold;

p

0,005) (figur 2A).

Hsa-miR-765

var en af ​​de Mirs der udviste den største relative stigning (3,8 gange) og største absolutte udtryk i fulvestrant behandlet DU145 celler (tabel S1). Fulvestrant inducerede også en signifikant stigning i ekspressionen af ​​dette miR i PC3-celler i en ERp-afhængig måde (figur 2B, fig S1B).

(A)

Hsa-MIR-765

er stærkt udtrykt i fulvestrant-behandlede DU145 celler. Totale RNA’er af behandlede celler blev mærket direkte og ordnet på NCode menneskelige miRNA Microarray. De median og lineær regression-normaliseret data præsenteres i en scatterplot. (B)

Hsa-MIR-765

induceres af fulvestrant i to prostata cancercellelinier. HSA-MIR-765 i fulvestrant- og ethanol-behandlet kontrol DU145 og PC-3-celler blev kvantificeret ved miRNA QRT-PCR-analyse. Relative fold ændringer mellem ekspression af

HSA-miR-765

i fulvestrant-behandlede og kontrol celler præsenteres. Student t-test blev udført for at bestemme deres betydning ved anvendelse af en cutoff p-værdi på 0,05 (n = 3). ** P 0,01; barer = standardafvigelse

C.

Hsa-miR-765

hæmmer cellevækst, celle-cyklus progression, migration og invasion

En

HSA-miR-765

efterligne eller en negativ kontrol blev udtrykt i DU145 celler der bærer luciferase reporter vektor

pMIR-miR-765

. Ektopisk ekspression af

HSA-MIR-765

mimic, men ikke den negative kontrol, undertrykkes effektivt luciferaseaktivitet af 70% i DU145-celler (figur 3A). Overekspression af

HSA-MIR-765

efterligne i DU145-celler induceret hæmning af cellevækst (40%, figur 3B) og celle-cellecyklusstandsnings ved G2 /M (G0 /G1 til G2 /M-forhold faldt fra 3,5 ± 0,26 til 2,7 ± 0,10,

s

= 0,0074) (figur 3C) og opreguleres ekspressionen af ​​cyclin A, cyclin B, og phosphoryleret-cdc2, men ikke cyclin E eller Cdc25C (figur 3D). Endelig faldt cellevandring og invasivitet (~ 80%, figur 3E), og dannelsen af ​​filopodia /intens stress fiber (figur 3F) i mængder større end eller sammenlignelige med dem fremkaldt af fulvestrant (se figur 1C 1D). Samlet set handlinger

HSA-miR-765

i DU145 celler er meget lig dem af fulvestrant. Udover DU145 celler, de hæmmende virkninger af har-miR-765 efterligner blev også observeret i PC-3 celler (Figur S3).

(A)

Hsa-miR-765

efterligner effektivt genkender reporter med komplementær sekvens af

HSA-mIR-765

i DU145-celler. Fold ændringer af luciferase aktiviteter

HSA-MIR-765

efterligner behandlede celler i forhold til cellerne behandlet med den negative kontrol efterligner præsenteres (n = 3). Transfektionsreagenser blev anvendt som kontrol. (B)

Hsa-miR-765

efterligne reducerer DU145 cellevækst. MTS-assay blev udført på de celler behandlet med

HSA-MIR-765

efterligne eller negativ-kontrol efterligner eller transfektion kontrol i 4 dage (n = 8). (C)

Hsa-miR-765

efterligne signifikant reducerer G0 /G1 til G2 /M-forhold i DU145. Repræsentative DNA-histogrammer (n = 3) er præsenteret. (D)

Hsa-MIR-765

mimic behandling forårsager opregulering af cyclin A, cyclin B, og phosphoryleret-cdc2 ekspression i DU145-celler. Protein-ekspressionsniveauer af cellecyklus regulator-proteiner blev bestemt ved Western blot-analyser. To uafhængige forsøg blev udført, og en repræsentant datasæt blev præsenteret. (E)

Hsa-MIR-765

mimic undertrykker DU145 cellemigration og invasion, som vist i transwell migration assay (øverst til venstre) og invasion assay (øverst til højre), hhv. Repræsentative mikrografer af celler efter transwell migration (øverst til venstre) eller invasion assay (øverst til højre) er vist. Fold ændringer af migration (nederst til venstre) og invasion (nederst til højre) af DU145 celler med enten

HSA-miR-765

efterligne eller negativ-kontrol efterligner forhold til kontrol celler med negativ-kontrol efterligner præsenteres (n = 3). (F)

Hsa-miR-765

efterligner reducerer stress fibre og filopodia formationer i DU145 celler. Repræsentative mikrografer og procentdele af cellerne med intense stress fibre og de filopodial celler (n = 3) præsenteres. T-test blev anvendt til sammenligninger med en afskæringsfrekvens p-værdi på 0,05. ** P 0,01; bar = standardafvigelse

D. Fulvestrant inducerer opregulering af

HSA-miR-765

udtryk via rekruttering af ERp til en formodet regulatorisk element

DU145 celler blev udsat for siRNA’er-medieret knockdown af ERP forudgående fulvestrant behandling. SiRNA effektivt slået ned ERp udtryk (figur S4). Denne knockdown blokerede fuldstændigt fulvestrant-induceret forøgelse af

HSA-MIR-765

ekspression (figur 4A) og ophævede transaktiveringsassays aktiviteter af fulvestrant på en 5′-regulatorisk sekvens af

HSA-MIR-765

(mellem -3208 og +100 3.3 kb) (figur 4B). Seriel sletning analyse identificeret en 141 bp sekvens (mellem -236 og -95) inden for 3,3 kb 5′-regulatorisk sekvens som afgørende medierende den stimulerende virkning af fulvestrant på

HSA-miR-765

transskription. Chip assays yderligere demonstreret rekruttering af ERp til denne korte sekvens efter fulvestrant stimulering (figur 4D). Disse data understøtter en rolle ERp i mediering fulvestrant-induceret

HSA-miR-765

opregulering.

(A) ERp siRNA Knockdown blokerer fulvestrant-induceret opregulering af

HSA-miR- 765

ekspression i DU145-celler. Ekspressionsniveauer af

HSA-MIR-765

bestemt ved QRT-PCR-analyse af fulvestrant-behandlede celler med ERp-siRNA (siERβ) eller forvrænge negativ-kontrol (siNeg) blev sammenlignet (n = 3). (B) SiRNA knockdown af ERp blokke fulvestrant-induceret transaktivering af 5’opstrøms regulatoriske region af

HSA-MIR-765

i DU145-celler. 5’opstrøms regulatoriske region af

HSA-MIR-765

blev klonet ind i en luciferase vektor. De reporter aktiviteter med ERP-knockdown (siERβ) eller klatretur negativ-kontrol (siNeg) i tilstedeværelse af fulvestrant blev sammenlignet (n = 3). (C) Sletning kortlægning analyse definerer en fulvestrant-responsiv segment i

HSA-miR-765

regulatorisk region i DU145 celler. De 5 ‘opstrøms DNA-sekvens af

HSA-miR-765

fra nt. -3208 Til +100 blev analyseret ved anvendelse luciferase reporter system. Serielle deletioner fra 5′-enden af ​​det klonede sekvens i vektoren blev udført. Reporter aktiviteter blev sammenlignet mellem fulvestrant-behandlede (Fulvestrant) og kontrol (EtOH) celler for hvert reporter vektor (n = 3). (D) Fulvestrant-inducerer rekruttering af ERp på formodede

HSA-miR-765

regulatorisk region. Kromatin-immunopræcipitation afslørede rekruttering af ERp til en sekvens i 5′-regulatoriske område af

HSA-miR765

. Mus IgG og RNA-polymerase II tjener som negativ og positiv kontrol hhv. Fulvestrant inducerede 17 gange stigning i ERp ansættelse, når sammenlignet med ikke-ERp bindende region (den 0N promotoren fra ERp [33], [41]). T-test blev udført for at bestemme betydningen af ​​mellem grupper under anvendelse af en cutoff p-værdi på 0,05. ** P 0,01; bar = standardafvigelse

E. HMGA1 er et mål for

HSA-miR-765

Bioinformatik analyser med flere miRNA target forudsigelse programmer foreslået HMGA1 som et mål for

HSA-miR-765

; en konserveret anerkendelse websted på 8982-9002 med -22,6 kcal /mol for mindste fri energi blev forudsagt (figur 5A, tabel S4). Reporter assays viste, at transfektion af

HSA-MIR-765

mimic, men ikke af en negativ-kontrol mimic, faldt betydeligt

HMGA1 3’UTR

-afhængige luciferaseaktivitet (figur 5B); ingen sådan forskel blev observeret i DU145 celler der bærer pMIR-tom vektor. Vigtigt er det, transfektion af

HSA-miR-765

efterligner helt blokeret udtryk for HMGA1 protein (figur 5C øverste panel), sammen med et lille fald i mRNA niveau (figur 5C, nederste panel). Af interesse, behandling med fulvestrant også effektivt lukke ekspressionen af ​​HMGA1 protein (figur 5D). Disse data understøtter en inhiberende rolle

HSA-MIR-765 til salg på HMGA1 ekspression på proteinniveauet og en mediator rolle i fulvestrant virkning på PCA-celler. Endelig ektopisk udtryk for HMGA1 effektivt reducerede væksthæmmende effekt af fulvestrant på DU145 celler (figur 5E), en konstatering i overensstemmelse med den rapporterede onkogene virkning HMGA1 i prostata [40].

(A) 3 ‘UTR af

HMGA1

8910-8929 forventes at være

HSA-miR-765

bindingssted. (B)

Hsa-miR-765

interagerer med 3’UTR af

HMGA1

i en målrettet reporter assay. DU145-celler blev transficeret med enten pMIR-tomme eller pMIR-HMGA1-3UTR hvori 3’UTR af

HMGA1

(+ 8026- + 9332) blev klonet i 3′-enden af ​​luciferase. Reporter aktiviteter pMIR-HMGA1-3UTR transficerede celler behandlet med

HSA-miR-765

efterligne eller negativ-kontrol efterligner sammenlignes (n = 3). (C)

Hsa-miR-765

efterligner reduceret HMGA1 proteinekspression i DU145 celler. Protein og mRNA-niveauer af HMGA1 i

HSA-MIR-765

mimic- og negativ-kontrol efterligner-behandlede celler blev bestemt ved Western blot-analyse (øvre) og real-time RT-PCR-analyse (lavere), henholdsvis. Resultater fra

MIR-765

efterligne vs negativ kontrol efterligner sammenlignes (n = 3). (D) Fulvestrant reducerer HMGA1 proteinekspression i DU145-celler. Proteinniveau af HMGA1 og β-actin i fulvestrant-behandlede og ethanol-behandlet kontrol (CTL) -celler blev bestemt ved Western blot analyse. (E) Ektopisk ekspression af HMGA1 blokke fulvestrant-induceret DU145 cellevækstinhiberingen. blev bestemt den relative cellevækst efter 4 dages behandling med fulvestrant eller ethanol efter stabil transfektion af

HMGA1

(eller tom vektor til kontrol) i en uge. Proteinniveauer af HMGA1 blev vist i fig S6. Cellevæksten af ​​fulvestrant-behandlede celler med HMGA1 overekspression vs tom vektor sammenlignes (n = 8). T-test blev udført for at bestemme signifikans mellem grupperne ved anvendelse af en cutoff p-værdi på 0,05. ** P 0,01; bar = standardafvigelse

F.

Hsa-miR-765

er forhøjet, men HMGA1 protein er reduceret i fulvestrant behandlet PCa prøver

prostatektomi væv blev opnået fra patienter med lokaliseret PCa, der modtog eller ikke modtog fulvestrant behandling (250 mg, im 28 dage før prostatektomi). Real time RT-PCR-analyser viste opregulering af

HSA-miR-765

mRNA (2,7-fold,

s

0,05, n = 7) i PCA prøver fra fulvestrant patienter i forhold til dem fra ubehandlede kontroller (n = 7) (figur 6A). I modsætning hertil immunologiske analyser viste en markant reduktion i HMGA1 immunopositivitet med eksemplarer fra fulvestrant-behandlede patienter (figur 6B). HMGA1 blev lokaliseret primært i kernerne i PCA-celler i kræft foci, med kun svag cytoplasmatisk farvning i stromaceller. Immunfarvning var ubetydelig i fulvestrant-behandlede prøver i næsten alle kræft foci (figur 6C,

s

0,01, n = 5). Androgenreceptor er tidligere vist at blive nedreguleret af fulvestrant i en gnaver [41] og en celle model [21]. Her viste vi AR var også signifikant nedreguleret i vores kliniske forsøg (figur 6B og C). * P 0,05;