PLoS ONE: inhiberende aktivitet af (+) – Usnic Acid mod ikke-småcellet lungekræft Cell Motility

Abstrakt

Laver er symbiotiske organismer, der producerer forskellige unikke kemikalier, der kan bruges til farmaceutiske formål. Med det formål at screene nye anti-cancer midler, der hæmmer kræft celle motilitet, vi testede den inhibitoriske aktivitet af syv lavarter indsamlet fra de rumænske Karpaterne mod migration og invasion af humane lunge kræftceller og yderligere undersøgt de molekylære mekanismer bag deres anti- metastatisk aktivitet. Blandt dem,

Alectoria samentosa

,

Flavocetraria nivalis

,

Alectoria ochroleuca

, og

Usnea florida

viste signifikant hæmmende aktivitet over motilitet af human lunge cancerceller . HPLC-resultater viste, at usnic syre er den vigtigste forbindelse i disse lav, og (+) – usnic syre viste lignende inhiberende aktivitet, som råekstrakt har. Mekanistisk, blev β-catenin-medieret TOPFLASH aktivitet og KITENIN-medieret AP-1-aktivitet faldt med (+) – usnic syrebehandling på en dosis-afhængig måde. Den kvantitative real-time PCR data viste, at (+) – usnic syre faldt mRNA-niveauet af CD44, cyclin D1 og c-myc, som er de nedstrøms målgener af både β-catenin /LEF og c-jun /AP-1 . Også, Rac1 og RhoA aktiviteter faldt ved behandling med (+) – usnic syre. Interessant nok blev der observeret højere inhibitorisk aktivitet for celleinvasion når celler blev behandlet med (+) – usnic syre og cetuximab. Disse resultater antydede, at (+) – usnic syre kan have potentielle aktivitet i hæmning af cancerceller metastase, og (+) -. Usnic syre kan anvendes til anticancerterapi med en særskilt virkningsmekanismer

Henvisning : Yang Y, Nguyen TT, Jeong MH, Crişan F, Yu YH, Ha HH, et al. (2016) inhiberende aktivitet af (+) – Usnic Acid mod ikke-småcellet lungekræft Cell motilitet. PLoS ONE 11 (1): e0146575. doi: 10,1371 /journal.pone.0146575

Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, FRANCE

Modtaget: September 2, 2015; Accepteret: 18. december 2015; Udgivet: 11 Jan 2016

Copyright: © 2016 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Grundforskningsfonden Korea (NRF-2013R1A1A2004677, NRF-2013R1A2A2A07067609, NRF-2015R1A4A1041219 og MRC-2011 til 0.030.132) og af Sydkorea National Research Ressourcecenter Program (NRF-2014M3A9B8002115). Denne undersøgelse har også modtaget støtte fra en forskningsbevilling finansieret af Sunchon Forskningscenter for Natural Medicine

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser: AP-1, aktivatorprotein-1; EGF, epidermal vækstfaktor; DMSO, dimethylsulfoxid; HPLC, højtydende væskekromatografi; KITENIN, KAI1 COOH-terminal interagerende tetraspanin; LEF, lymfoide øge faktor; PBD, p21-bindende domæne; PCR, polymerasekædereaktion; RBD, Rho-bindende domæne

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død i de udviklede lande. På grund af manglen på en effektiv behandling for fremskreden sygdom, prognosen for lungekræft er stadig fattige, med mindre end 15% overlevende 5 år efter diagnosen [1]. Tilstødende invasion og fjernmetastaser er de vigtigste årsager til kræft-relaterede dødsfald [2]. Derfor en søgning efter hæmmere til kræftcellen invasion og migration evne kunne afsløre en ny terapi til kræftbehandling. Selvom urter har været ansat i behandlingen af ​​kræft i tusinder af år, de forbliver en meget vigtig kilde til biologisk aktive produkter. Formålet med denne undersøgelse var at identificere potentielle terapeutiske midler til forbedring af overlevelsen af ​​patienter med lungecancer metastase.

Laver er symbiotiske organismer, der producerer et stort antal bioaktive stoffer i løbet af 800 [3], der omfatter mange klasser af forbindelser: aminosyre derivater, sukker alkoholer, alifatiske syrer, y-, δ- og makrocykliske laktoner, monocykliske aromatiske forbindelser, quinoner, chromoner, xanthones, dibenzofuraner, depsides, depsidones, depsones, terpenoider, steroider, carotenoider [4] og diphenylethere [5, 6]. Langsomt voksende organismer i lav-ressource levesteder producere højere niveauer af forsvarsrelaterede kemikalier [7]. Derfor laver er en kilde af unikke kemiske stoffer, hvoraf nogle allerede har vist sig at være effektiv mod forskellige kræft

in vitro

modeller [8]. Her den aktuelle undersøgelse undersøgte den inhibitoriske aktivitet af syv lavarter indsamlet fra de rumænske Karpaterne mod migration og invasion evne af humane lunge kræftceller og yderligere undersøgt de mulige molekylære mekanismer bag deres anti-metastatisk aktivitet for at identificere potentielle forbindelser til nye anti- metastase agenter.

Materiale og metoder

Udarbejdelse af lichen ekstrakter

lichen prøver, der anvendes i denne undersøgelse, indsamlet fra Rumænien i 2011, blev identificeret på den koreanske lichen Research Institute ( KoLRI), Sunchon National University, Korea. Kort fortalt thalli af lichen blev indsamlet fra Rumænien i 2011 under ekskursion i nationalparken Calimani (47 ° 07’28.6 “N, 25 ° 13’34.8” E) og Natural Park Bucegi (45 ° 20’21.7 “N , 25 ° 27’41.4 “E) arrangeret af Dr. Crişan på Babes-Bolyai Universitet, Cluj-Napoca, Rumænien [9]. Tilladelsen til at indsamle lichen prøver fra de steder blev udstedt af administrationen af ​​nationalparken Calimani og administration naturparken Bucegi, med godkendelse af kommissionen for Natural Monumenter (rumænsk Academy). De feltstudier ikke indebar nogen truede eller beskyttede arter. De dubletter blev deponeret i den koreanske Lichen og Allied Bioresource Center (KOLABIC) i den koreanske Lichen Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea. Den tørrede thalli af laverne blev ekstraheret med acetone ved stuetemperatur i 48 timer. Acetonen ekstrakter blev derefter filtreret og tørret i vakuumrotationsfordamper ved 45 ° C. De tørre ekstrakter opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) som 5 mg /ml koncentration (1000 ×) for alle forsøg. Syv rumænske lichen arter og deres kupon eksemplar referencenumrene i denne undersøgelse blev anført i tabel 1.

Højtryksvæskekromatografi (HPLC) analyse af lichen materiale

Acetone ekstrakt af lichen thalli ved en koncentration på 5 mg /ml blev underkastet højydelsesvæskechromatografi (HPLC) analyser (LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan) på en YMC-Pack ODS-a (150 × 3,9 mm ID) omvendt fase søjle, der indeholder fuldt endeafsluttet C18 materiale (partikelstørrelse, 5 um, porestørrelse, 12 nm). Eluering blev udført ved en strømningshastighed på 1 ml /min under følgende betingelser før efterfølgende injektion: kolonnetemperatur, 40 ° C; opløsningsmiddelsystem, methanol: vand: phosphorsyre (80: 20: 1, vol /vol /vol). Analyser blev overvåget af en fotodiodearraydetektor (SPD-M20A, Shimadzu) med en række 190 ~ 800 nm hele HPLC løb. Observerede toppe blev scannet mellem 190 og 400 nm. Standarden anvendes til salazinic syre (t

R = 2,27 ± 0,2 min) blev isoleret fra lav

Lobaria pulmonaria

. Usnic anvendte syre i vores undersøgelse blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) (329967-5G). Voucher prøver blev deponeret i herbarium af Lichen Allied Bioresource Centre på den koreanske Lichen Research Institute, Sunchon National University, Sydkorea.

væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) og optisk rotation analaysis af lichen materiale

LC-MS-spektre blev registreret på et spektrometer med en elektrospray-ioniseringskilde ved hjælp Agilent 6460 tripel kvadrupol LC /MS. Værdierne for optisk drejning blev målt ved 25 ° C under anvendelse af Jasco P-1010 polarimeter med en natrium lampe, og beskrives som følger: [α] D, T (C (g /100 ml), opløsningsmiddel). Specifik rotation af ren (+) – usnic syre (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) er en fysisk egenskab af ved en given bølgelængde og temperatur og kan slås op i litteraturen

Celledyrkning

De humane lungecancer-celler, herunder A549, H460, H1650, og H1975 blev dyrket i RPMI 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin-opløsning under en befugtet 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C.

sårheling assay

A549-celler blev udpladet med en tæthed på 2,5 x 10

5 celler /brønd på 6-brønds vævskulturplader (Corning, New York , USA) og dyrket natten over til konfluens. Monolag celler blev ridset med en pipettespids for at skabe et sår. Cellerne blev derefter vasket to gange med serumfrit RPMI 1640 til fjernelse af flydende celler og inkuberet i RPMI1640 dyrkningsmedium suppleret med 2% FBS med 5 ug /ml af mosser ekstrakt eller 5 uM usnic syre. Fotografier af celler blev udtaget ved 0, 24, 48 og 72 timer efter sårdannelse at måle bredden af ​​såret. For hver prøve blev et gennemsnit på fem sår analyser taget for at bestemme den gennemsnitlige migration ved en given koncentration af acetone ekstrakt eller usnic syre. Forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Invasion assay

Invasion assays blev udført i Transwell kamre (Corning, New York, USA) med 8 um porestørrelse polycarbonatmembran overtrukket med 1% gelatine. Celler blev udpladet ved 2 x 10

5 celler /brønd i RPMI1640 indeholdende 0,2% bovint serumalbumin i det øvre rum af kammeret med eller uden 5 pg /ml rå lichen ekstrakter. Derefter RPMI1640 medium med 10 ug /ml fibronectin blev tilsat til det nederste kammer for at tjene som et kemotaktisk middel. Efter 48 timers inkubation blev cellerne i det øvre kammer fikseret med Diff Quik kit (Sysmex, Kobe, Japan). Så cellerne inde i kammeret blev mekanisk fjernet fra membranen med en vatpind, og cellerne klæber til under-side af membranen blev farvet og talt under lysmikroskop (5 felter pr kammer). Hver invasion assay blev gentaget i tre uafhængige forsøg. Resultaterne udtrykkes som det gennemsnitlige antal celler migrerer per høj-power felt.

Reporter Assay

HEK293T celler blev udpladet i plader med 24 brønde 12 timer før transfektion. Efter transfektion af TOPFLASH eller AP-1 reporterplasmid med den respektive aktivator, β-catenin eller KITENIN blev celler behandlet med usnic syre i 48 timer og derefter analyseret ved anvendelse af en dobbelt-Luciferase

® Reporter Assay System (Promega, Madison , WI, USA). The Renilla luciferase reporter plasmid (pRL-TK) blev anvendt som intern kontrol for transfektionseffektivitet. Forsøgene blev udført tredobbelt, og mindst tre resultater fra uafhængige eksperimenter blev inkluderet i analysen. Fold ændringer blev beregnet under anvendelse værdier normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet.

Kvantitativ realtids-PCR

kvantitativ real-time PCR blev udført som tidligere beskrevet [9]. Kort beskrevet blev totalt RNA isoleret fra humane lungecancer-celler ved hjælp RNAiso Plus (Takara, Otsu, Shiga 520-2193, Japan) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA (1 ug) fra hver gruppe af behandlede celler blev omdannet til cDNA under anvendelse af en M-MLV revers transkriptase-kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) og SYBR green (Enzynomics, Seoul, Korea). De anvendte primere til real-time PCR var cyclin D1 (frem) 5′-ccgtccatgcggaagatc-3 ‘og (tilbage) 5′-gaagacctcctcctcgcact-3′; c-myc (fremad) 5’-aatgaaaaggcccccaaggtagttatcc-3 ‘og (revers) 5′-gtcgtttccgcaacaagtcctcttc-3′; CD44 (frem) 5’-tgccgctttgcaggtgtat-3 ‘og (tilbage) 5′-ggcctccgtccgagaga-3′; GAPDH (frem) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ‘og (tilbage) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. Real-time PCR-reaktion og analyse blev udført ved anvendelse CFX (Bio-Rad, Hercules, USA).

Affinity Præcipitation af Cellular GTPaser Salg

De cellulære Rac1 og cdc42 aktiviteter blev bestemt ved anvendelse GST-RBD /PBD som tidligere beskrevet [10, 11]. Kort fortalt blev cellerne lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, og inhibitor-blanding protease) . Lysaterne blev inkuberet med GST RBD /PBD perler ved stuetemperatur i 1 time. Perlerne blev derefter vasket fire gange med vaskebuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, og inhibitor blanding protease). De bundne Rac1 og Cdc42 proteiner blev påvist ved immunoblotting under anvendelse af et monoklonalt antistof mod Rac1 (Millipore 05-389) og Cdc42 (Santa Cruz SC-87). Den relative aktivitet af hver GTPase blev bestemt ved kvantificering hvert bånd af GTP-bundne GTPase og den totale mængde af GTPase metoden Multi-Gauge 3,0 og værdierne af GTP-bundne bånd blev normaliseret til værdien af ​​det samlede beløb. Alle resultater blev bestemt ved hjælp af tre forskellige eksponeringer fra mindst tre uafhængige forsøg.

Resultater

Hæmning af A549 celle motilitet ved lichen ekstrakter

Cell migration spiller en afgørende rolle under kræft metastase. For at finde den anti-vandrende lichen sekundær metabolit på humane lunge kræftceller, sårheling blev udført blandt syv acetone ekstrakter af rumænske lav nævnt i tabel 1. Laver producere unikke polyketid sekundære metabolitter herunder depsides, depsidones, dibenzofuraner og depsones; og disse hydrofobe forbindelser blev normalt ekstraheret med acetone [12]. Som vist i figur 1A,

Alectoria samentosa

,

Flavocetraria nivalis

,

Alectoria ochroleuca

, og

Usnea florida

hæmmede A549 celle migration i en koncentration på 5 ug /ml. Længden mellem kanterne af såret ved 72 timer med disse kandidater var væsentligt bredere end i DMSO-behandlede gruppe eller den ikke-aktive prøve (

Bryoria capillaris

). Især

F

.

nivalis

viste mere end 60% inhibitorisk aktivitet sammenlignet med kontrol (fig 1A og 1B).

(A-B) Kvantitativ analyse af migration assay af A549-celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakter af

Alectoria samentosa

,

Flavocetraria nivalis

,

Alectoria ochroleuca

,

Bryoria capillaris

,

Hypogymnia physodes

,

Usnea florida

Evernia divaricata Hotel (A), og som er repræsentative billeder af migration assay af A549 celler behandlet med ekstrakter af

A

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

A

.

ochroleuca

,

U

.

florida

B

.

capillaris

(B). (C-D) Invasion assay af A549 celler behandlet med 5 ug /ml acetone ekstrakter af

A

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

A

.

ochroleuca

,

U

.

florida

B

.

capillaris

(C), og kvantitativ analyse af invaderede celletal i hver gruppe (D). Repræsentative billeder blev vist fra tre uafhængige forsøg, n = 3. Data repræsenterer gennemsnit ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel i forhold til 0,01% DMSO-behandlede A549 celler.

Virkningerne af acetone ekstrakter af

A

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

A

.

ochroleuca

, og

U

.

florida

på A549 celle invasion blev derefter bestemt under anvendelse af Transwell kammer invasion assay. Som et resultat, lichen ekstrakter faldt betydeligt den invaderede celleantal med så meget som 50% sammenlignet med DMSO eller

B

.

kapillærer

(negativ kontrol) (Fig 1C og 1D). Disse resultater viste, at acetone ekstrakter af

A

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

A

.

ochroleuca

, og

U

.

florida

hæmmede både migration og invasion evne A549 lunge kræftceller.

Usnic syre er den aktive hæmmer fra lavarter

For at identificere komponenterne i acetone ekstrakt af lichen,

A

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

A

.

ochroleuca

, og

U

.

Florida

ekstrakter blev kørt på HPLC. Som vist i figur 2A, blev usnic syre identificeret som den primære forbindelse i alle fire af disse kandidater efter sammenligning med den interne standard af renset (+) – usnic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), og disse var konsistent med foregående rapport (tabel 1) [13-20]. Identitet usnic syre og deres optiske status blev analyseret ved LC-MS-analyse og optisk aktivitet analyse, henholdsvis (S1 File). Den% intensitet top for den usnic syre i kandidat- lav ved en koncentration på 5 mg /ml blev opnået ved sammenligning med den for top for rent 5 mg /ml usnic syre. Det er værd at bemærke, at usnic syreindholdet er størst i

F

.

nivalis

ekstrakt, hvilket kan forklare sin potente hæmmende effekt på celle migration (figur 2A). Det blev spekuleret, at (-) – usnic syre har tilsvarende eller mere kraftig inhibitorisk aktivitet på cellemotilitet acetone ekstrakt af

A

.

samentosa

og

A

.

ochroleuca

som vides at have (-) – usnic syre som deres underkomponent [13, 16, 18] udviste tilsvarende eller mere kraftig inhibitorisk aktivitet på migration og invasion, henholdsvis end (+) – usnic syreholdige

U

.

florida

(figur 1). I vores tidligere rapport, viste vi, at acetone ekstrakt af lichen

F

.

cucullata

og dens komponenter, usnic syre, hæmmet tumorgenicitet og motilitet af cancerceller [9]. I overensstemmelse med dette, (+) – usnic syre i en koncentration på 5 uM inhiberede signifikant migration og invasion af A549-celler (figur 2). Ved denne koncentration havde usnic syre ikke viser cytotoksicitet og /eller inhibere celleproliferation (IC

50 værdi usnic syre på A549-celler = 65,3 ± 0,65 uM) [9]. Som vist i fig 2B-2E, inhiberende aktivitet af (+) – usnic syre ved 5 uM er så høj som 50% ved 72 h behandling for migration og er omkring 40% efter 48 h behandling for invasion. For yderligere at undersøge den inhibitoriske aktivitet af (+) – usnic syre på de andre lungekræft celler, blev invasion assay udført ved hjælp af H1650, og H1975 celler. Som et resultat, (+) – usnic syrebehandling faldt betydeligt invaderede celle antal H1650 og H1975-celler ved en koncentration på 5 uM (Fig 3A). Den kvantitative analyse viste, at inhibering var så højt som 40% i begge celler sammenlignet med vehikel-behandlede celler (fig 3B). Tilsammen viste resultaterne, at (+) – usnic syre har inhiberende aktivitet over for cellemotilitet af humane lungecancerceller

(A) Højtryksvæskekromatografi (HPLC) analyse af mosser acetoneekstrakter.. Den% intensitet top for den usnic syre i ekstrakten i en koncentration på 5 mg /ml blev opnået ved sammenligning med den for top for rent 5 mg /ml usnic syre. (B-C) Migration assay af A549-celler behandlet med 5 pM (+) – usnic acid (B), og kvantitativ analyse af sår længde (C). (D-E) Invasion assay af A549-celler behandlet med 5 pM (+) – usnic acid (D), og kvantitativ analyse af invaderede celletal i hver gruppe (E). Repræsentative billeder vises fra tre uafhængige forsøg, n = 3. Data repræsenterer gennemsnit ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlede A549-celler

(AB) Invasion assay af H1650 og H1975-celler behandlet med 5 pM (+) -. Usnic acid (A), og kvantitativ analyse af invaderet celletal i hver cellelinje (B). Repræsentative billeder vises fra tre uafhængige forsøg, n = 3. Data repræsenterer gennemsnit ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlede A549-celler

(+) -. Usnic syre reducerer β-catenin-medieret TOPFLASH aktivitet og KITENIN-medieret AP-1-aktivitet

for at undersøge underliggende mekanismer for den inhibitoriske aktivitet af (+) – usnic syre, udførte vi TOPFLASH og AP-1 reporter assays for at vurdere, om (+) – usnic syre kan modulere β-catenin-medieret og /eller KITENIN-medieret signalering aktivitet. Som vist i figur 4A, (+) – usnic acid signifikant nedsat TOPFLASH aktivitet med 18% ved 1 uM og 37% ved 10 uM. Som for AP-1-aktivitet, blev der observeret fald dosisafhængige fra 0,5 uM, og faldet var betydelig, så meget som 50% ved 10 uM. Endvidere (+) – usnic syre også signifikant reduceret EGF-aktiverede KITENIN-medieret AP-1-aktivitet med 32% ved 1 uM og 41% ved 10 uM (fig 4B). For at kontrollere, om niveauet for nedstrøms target gener af β-catenin /LEF og c-jun /AP-1 er påvirket af (+) – usnic syrebehandling, blev udført kvantitativ real-time PCR-analyse. Som vist i figur 5, blev relative ekspressionsniveauer af CD44, cyclin D1, og c-myc signifikant nedsat ved (+) – usnic syrebehandling i lungecancerceller i forskellig udstrækning (fig 5A-5D). Disse resultater antyder, at (+) – usnic syre viser inhibitorisk aktivitet over cellemotilitet gennem modulering af β-catenin-medieret og KITENIN-medieret signalering aktivitet i lungecancerceller

(A) β-Catenin-medieret. transkriptionsaktivitet TOPFLASH promotoren blev reduceret med (+) – usnic syrebehandling. HEK 293T-celler blev transficeret med β-catenin og TOPFLASH reporterplasmid. Efter 12 timer transfektion blev celler behandlet med (+) – usnic syre i 48 timer. (B) KITENIN transkriptionel aktivitet af AP1-promotoren blev reduceret med (+) – usnic syrebehandling. De HEK 293T-celler blev transficeret med KITENIN og AP-1 reporterplasmid. Efter 12 timer transfektion blev celler behandlet med (+) – usnic syre i 48 timer med eller uden EGF. Eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige kulturer, n = 3. Data repræsenterer middelværdi ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlede HEK 293T-celler.

(AD) Kvantitativ analyse af mRNA-niveauet af CD44, c-myc, og cyclin D1 i A549 (A), H1650 (B), H1975 (C), og H460 (D) celler behandlet med 5 pM (+) – usnic syre. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi), n = 3. * p 0,05; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlede gruppe i hver cellelinje

(+) -. Usnic syre formindsker GTP-Rac1 og -RhoA niveau

aktiviteter Rac1 og Cdc42 er involveret i mesenchymale form for migration [21, 22]. For at bestemme om (+) – usnic syre kan påvirke aktiviteterne i disse proteiner i A549-celler, blev GST pull-down assays udført under anvendelse af GST-PBD (p21-bindende domæne). Som vist i figur 6, (+) – usnic syrebehandling faldt betydeligt niveauet af GTP-Rac1 med 22% i forhold til vehikelbehandlede celler (Fig 6A). Imidlertid blev ingen signifikant ændring i niveauet af GTP-Cdc42 observeret af (+) – usnic syrebehandling (Fig 6B). RhoA fremmer junktionel dannelse, apikale konstriktion, og reducerer vedhæftning og cellespredning [23, 24]. For at bestemme om (+) – usnic syre kan påvirke aktiviteten af ​​RhoA i A549-celler, blev GST pull-down assays udført under anvendelse af GST-RBD (Rho-bindende domæne). Som vist i figur 6C, (+) – usnic syrebehandling faldt betydeligt niveauet af GTP-RhoA med 40% i forhold til vehikelbehandlede celler. Tilsammen disse resultater tyder på, at (+) -. Usnic syre hæmmer celle motilitet gennem regulering af Rho GTPaser

(AC) Niveauerne af GTP-bundne Rac1, Cdc42 og RhoA blev målt i A549 celler behandlet med 5 pM (+) – usnic syre. GTP-Rac1 og -Cdc42 blev målt under anvendelse GST-PBD, og ​​GTP-RhoA blev målt ved anvendelse GST-RBD. Der blev også vist de samlede RhoA, Rac1, og Cdc42. De relative aktiviteter af Rac1 (A), Cdc42 (B), og RhoA (C) blev bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM (standardafvigelse af middelværdien), n = 3. ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel sammenlignet med 0,01% DMSO-behandlede A549-celler

(+) -. Usnic syre viser additiv inhiberende aktivitet med cetuximab

Cetuximab (Erbitux, C225), monoklonalt antistof mod epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) anvendes som en af ​​anti-EGFR midler til behandling af metastatisk colon og lungekræft. For at undersøge, om (+) – usnic syre har terapeutisk relevans med cetuximab blev invasion assay udført med forskellige koncentrationer af cetuximab og /eller (+) – usnic syre. Som vist i figur 7, inhiberende aktivitet af cetuximab var ~ 30% ved 1 ug /ml og ~ 40% ved 10 ug /ml på A549-celler, og behandling af 5 uM (+) – usnic syre viste lignende inhiberende aktivitet med 10 ug /ml cetuximab (~ 40% inhibering) på disse celler. Interessant nok blev der observeret højere inhibitorisk aktivitet for celleinvasion når cellerne blev behandlet med 1 ug /ml cetuximab sammen med 5 pM (+) – usnic syre (figur 7). Disse resultater antyder, at (+) – usnic syre ikke kun kan inhibere lungekræft cellemotiliteten ved alene, men også kan forstærke den terapeutiske aktivitet af cetuximab. Som usnic syre faldt KITENIN-medieret AP-1-aktivitet (fig 4 og 5) og KITENIN /ErbB4-medieret nedstrøms signal af EGF spiller en af ​​den molekylære basis for giver resistens over for anti-EGFR agenser [25], og disse resultater antyder, at usnic syre kan have potentielle gavnlige aktivitet overvinde den begrænsede kliniske virkning af anti-EGFR terapi

(AB) invasion assay af A549-celler behandlet med 5 pM (+) -. usnic syre og /eller forskellige koncentrationer af cetuximab (A), og kvantitativ analyse af invaderede celletal i hver gruppe (B). Repræsentative billeder vises fra tre uafhængige forsøg, n = 3. Data repræsenterer gennemsnit ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel mellem angivet gruppe.

Diskussion

Kræft celle erhverver biologiske kapaciteter, herunder modstå celledød, opretholdelse proliferativ signalering, unddrage vækst undertrykkere, aktivering invasion og metastase, og så frem i udviklingen fra tidlig til sene stadier [26, 27], og målrette en af ​​disse Kundskaber kan grupperes som “anticancer«. I denne henseende vores observationer, at (+) – usnic syre hæmmer migration og invasion evne i lungecancerceller er hidtil ukendte i anticancer aktivitet af (+) – usnic syre. Desuden viste vores resultater, at (+) – usnic syre har specifikke virkningsmekanismer for deres anticancer aktivitet, og disse er ganske forskellige fra de tidligere litteratur viser cytotoksicitet, en af ​​mekanismen af ​​aktioner til anticancer aktivitet (+) – usnic syre i forskellige kræftceller.

Levertoksicitet af usnic syre kan begrænse deres potentielle medicinsk anvendelse i kræftmedicin [28]. Men de fleste af hepatotoksicitet i human blev observeret, når høj dosis af usnic syre blev oralt administreret som et kosttilskud med henblik på vægttab [29-31]. I kræftlægemidler, kan hepatotoksicitet undgås ved at justere dosis, formulering og /eller rute af medicin. For eksempel da Silva Santos et al. viste, at nano-indkapsling af usnic syre gøre det muligt at opretholde og forbedre antitumoraktivitet og betydeligt reducere hepatotoksicitet [32]. Endvidere er det blevet vist, at tilskud af antioxidant, dvs. vitamin E, sammen med usnic syre kunne i høj grad reducere usnic syre-induceret hepatotoksicitet i primære dyrkede muse- hepatocytter [33]. Det skal også bemærkes, at nogle af papirerne viser hepatotoksicitet blev udført på HepG2-celler, der stammer fra hepatocellulært carcinom væv på 15 år mandlige unge [34, 35]. I vores tidligere papir [9], vi demonstreret, at usnic syre eller anden måde har selektiv cytotoksicitet i kræftceller sammenlignet med normale celler. I alternativ synspunkter, alvorlig cytotoksicitet usnic syre på HepG2-celler afspejler selektiv og specifik anticancer aktivitet af usnic syre på leverkræft i testede koncentrationer.

I vores tidligere rapport, blev det vist, at cytotoksicitet usnic syre er specifik for cancerceller såsom HT29 (kolorektal cancer celler IC

50 = 95,2 ± 0,85 uM), AGS (mavekræft celle; IC

50 = 15,01 ± 0,52 uM), A549 (lungecancer celle; IC

50 = 65,3 ± 0,65 uM), og CWR22Rv-1 (prostata kræftceller, IC

50 = 24,1 ± 0,63 uM), mens ikke-kræftceller, såsom MDCK (Mardin-Darby hunde nyre, IC

50 = 133,04 ± 3,5 uM), RIE (rotte intestinal epitelceller, IC

50 = 126 ± 4,25 uM), NIH 3T3 (mus embryonale fibroblast, IC

50 = 164,2 ± 3,7 uM), og HaCaT ( menneskelige keratinocyt; IC

50 = 185,7 ± 4,8 uM) celler, blev ikke alvorligt beskadiget [9]. Eftersom den gennemsnitlige cirkulerende blodvolumen for mus er 72 ml /kg [36] og molekylvægten af ​​usnic syre er 344, LD

50 værdi usnic syre (muse-oral, 838 mg /kg) i MSDS ark usnic syre kan beregnes til 33,8 mM. Som inhiberende aktivitet af usnic syre ved inhibering lungecancer cellemotilitet observeres ved koncentration på 5 uM, vores resultater viste, at usnic syre vil blive brugt til anti-metastase middel med ringe toksicitet ved arbejdstemperaturer koncentrationer.

Usnic syre har en lav grad af vandopløselighed, hvilket er en hindring i lægemiddeludvikling, da det sandsynligvis vil resultere i dårlig biotilgængelighed. For at undgå dette problem, kan forskellige tilgange gøres til forbedring af opløselighed med sin egen forbindelse ved partikelstørrelse reduktion, krystal engineering, dannelse salt, fast dispersion, brug af tensid, kompleksdannelse, og så videre [37]. Udvælgelsen af ​​forstærkningen metode bør bestemmes for hvert lægemiddel i påkrævede doseringsform egenskaber. For usnic syre, seneste artikel rapporterede, at kaliumsalt af usnic syre (kalium usnate) har 100% opløselighed uden at miste sin biologiske aktivitet ved 10 mg /ml (ca. 26 uM) [38]. Sammen med de faktiske forhold, at (+) og (-) enantiomere former af usnic syre viste moderate til stærke biologiske aktiviteter [39, 40], yderligere undersøgelse er nødvendig for at vurdere den potentielle medicinske brug af usnic syre i anticancer terapi i forskellige kræftformer

Støtte Information

S1 fil. LC-MS analyse (figur A i S1 File) og optisk aktivitet analyse (figur B i S1 File) prøver anvendt i denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0146575.s001

(PDF)