PLoS ONE: Virkningen af ​​HIF1α på Per2 døgnrytme i nyrekræft cellelinier

Abstrakt

Hos pattedyr, døgnrytmen centrale generator består af samspil mellem ur gener, herunder

Per1 /2/3 fotos,

Cry1 /2

,

Bmal1

, og

Ur

. Døgnrytme forstyrrelser kan medføre øget risiko for kræft hos mennesker, og dereguleringen af ​​ur gener har været impliceret i mange cancertyper. Blandt disse gener,

Per2

er rapporteret at have tumor suppressor egenskaber, men lidt er kendt om sammenhængen mellem

Per2

og HIF, som er det vigtigste mål for renalcellecarcinom (RCC) terapi . I denne undersøgelse den rytmiske ekspression af

Per2

genet kunne ikke påvises i renale cancercellelinjer med undtagelse af Caki-2-celler. I Caki-2 celler, HIF1α øgede amplituden af ​​

Per2

svingning ved direkte binding til HIF-bindingssted placeret på

Per2

promotor. Disse resultater indikerer, at HIF1α kan forstærke amplituden af ​​

Per2

døgnrytme

Henvisning:. Okabe T, Kumagai M, Nakajima Y, Shirotake S, Kodaira K, Oyama M, et al. (2014) Virkningen af ​​HIF1α på

Per2

døgnrytme i Renal kræftceller. PLoS ONE 9 (10): e109693. doi: 10,1371 /journal.pone.0109693

Redaktør: Shin Yamazaki, University of Texas Southwestern Medical Center, USA

Modtaget: 9. januar 2014 Accepteret: 12. september 2014 Udgivet 21. oktober, 2014

Copyright: © 2014 Okabe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Renalcellecarcinom (RCC) er den mest almindelige malignitet af den voksne nyre, som tegner sig for ca. 2% af cancere verdensplan [1]. En somatisk mutation af Von Hippel-Lindau (

VHL

) gen er den hyppigste genetiske forandringer observeret i RCC [2], og de seneste bestræbelser har målrettet VHL-hypoxi inducerbare faktor (HIF) -medieret hypoxia- induceret gen vej for RCC terapi [3]. HIFs er heterodimere transkriptionsfaktorer med to strukturelt beslægtede underenheder: en oxygen-sensitive HIFα underenhed og en konstitutivt udtrykt HIFß eller aryl hydrocarbon receptor nuklear translokatoren (Arnt) underenhed [4]. I normoxi er HIFα molekyler udsat for en regulerende proces, der involverer enzymatisk hydroxylering af bevarede prolyl og asparaginylrester, fører til en hurtig VHL protein-medieret ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning [5]. Hypoxi eller mutationer i

VHL

gen inaktivere denne vej. Øget HIFα aktivitet opregulerer gener involveret i mange aspekter af cancer progression, herunder metabolisk tilpasning, apoptotisk modstand, og angiogenese [3]. I RCC, kan intens tumorvaskulære net tilskrives uhensigtsmæssig akkumulering af HIFα fører til angiogen geninduktion. Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) er en af ​​de mest potente pro-angiogene faktorer, hvis ekspression er transaktiveret af HIF1α /ARNT gennem binding til hypoxi-responselementet (HRE) i

VEGF

promotor [6] [7]. Forøget ekspression af VEGF er også forbundet med malign progression og et dårligt behandlingsresultat [8]. Derfor undertrykke HIF-medieret gen vej kan være en vigtig terapeutisk strategi til behandling af RCC [3].

Mange fysiologiske, biokemiske og adfærdsmæssige processer er under døgnrytmen regulering, som er genereret af en intern tid -føring mekanisme benævnt biologiske ur i næsten alle organismer fra bakterier til pattedyr [9], [10]. Døgnrytmen styres af genetisk bestemte netværk af transskription-translation returkredsene involverer ur gener, herunder

Per1 /2/3 fotos,

Cry 1/2

,

Bmal1

, og

Ur

[11]. Et fælles tema underliggende circadian rytme er, at svingninger i ur gentranskripter er konsekvensen af ​​intracellulære transkriptionelle-translationel feedback-sløjfer. For eksempel, i pattedyr, den transkriptionsfaktorer CLOCK og BMAL1 heterodimerisere og aktivere ekspression af tre

Per

gener og to

Cry

gener ved binding til E-box elementer i deres promotorer. De proteinprodukter af disse gener multimerize og translokere til kernen, hvor Per og råb proteiner undertrykker den transkriptionelle aktivitet CLOCK-BMAL1 dimer [12], [13].

Blandt disse ur gener,

Per2

er ansvarlig for at perioden med svingning [14]. Desuden

Per2

har tumor-suppressor egenskaber og er ofte muteret eller nedreguleret i humane brystcancer [15], [16]. I nyrekræft, ændret udtryk for

Per2

gen er efter sigende er involveret i sygdommens opståen og udvikling, men den molekylære mekanisme ansvarlig fortsat uklart [17].

I denne undersøgelse vi målte niveauer af

Per2

promotor-aktivitet og mRNA i otte nyrekræft cellelinjer efter dexamethason behandling.

Per2

promotor-aktivitet og mRNA-niveau svinget over en ca. 24-h cyklus i Caki-2 celler, der indeholder BMAL1, CLOCK, og HIF1α proteiner. Vi fandt også, HIF1α øgede amplituden af ​​svingningen ved direkte binding til HRE element placeret på

Per2

promotor. Disse resultater viser, at HIF1α kan påvirke amplituden af ​​

Per2

døgnrytme i nyrekræft cellelinjer.

Materialer og metoder

Celler og cellekulturer, kemikalier og enzymer

Etablerede humane RCC-cellelinjer (A704, ACHN, 786-O, A498, 769-P, og Caki-2) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). RCC4 + vektor alene og RCC4 + VHL blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Disse renale cellelinjer blev opretholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-medium (Kojin Bio, Tokyo, Japan) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 24 U /ml penicillin og 25 ug /ml streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) i en standard befugtet inkubator ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2. Vi brugte også muse fibroblast NIH3T3- og menneskelige osteosarkom U2OS celle modeller af den autonome døgnrytmen ur [18], [19]. Disse cellelinier blev også opnået fra ATCC, og blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% FBS, penicillin (24 U /ml) og streptomycin (25 ug /ml). Chrysin blev indkøbt fra Sigma, og dens renhed overskred 96%. En stamopløsning af chrysin blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO). Chrysin blev opløst i DMSO ved tre forskellige koncentrationer (1, 10 og 100 mM) og tilsat hver 2 pi til 2 ml dyrkningsmedium (slutkoncentration; 1, 10, 100 uM). Cellerne blev behandlet med kulturmedier indeholdende 1, 10, 100 uM chrysin eller samme koncentration af DMSO som kontrol i 2 timer.

Plasmidkonstruktion

For at konstruere reporter vektorer, der bærer det m

Per2

promotoren, m

Per2

promotorfragment (-279 til +112 bp, hvor +1 angiver det formodede transkriptionsstartstedet) blev polymerasekædereaktion (PCR) -amplified fra C57BL /6J mus genom og klonet ind i Nhel /Xhol-stedet i pGL3 Basic (Promega, Madison, WI, USA). Firefly luciferase (Fluc) blev erstattet med den

Nco

I og

Xba

Jeg fragment af pSV40-dFLuc, hvilket resulterer i m

Per2

-dFLuc. Den HRE-mutant m

Per2

promoter reporter blev genereret med invers PCR ved hjælp af en KOD-Plus-Mutagenese Kit (Toyobo, Osaka, Japan).

Real-time rapportering af døgnrytmen-regulerede gen ekspression under anvendelse luciferase bioluminescens

Alle celler blev podet (5 x 10

4 per skål) i en 35 mm skål 2 dage før transfektion, og reporterplasmidet blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Den passende mængde af reporterplasmid for hver cellelinje blev bestemt ifølge forskelle i transfektionseffektivitet mellem cellelinierne. En dag efter transfektion blev celler behandlet med 100 nM dexamethason (Nakalai Tesque, Kyoto, Japan) i 2 timer, og mediet blev udskiftet med medium i fravær af phenolrødt suppleret med 10% FBS og 100 pM D-luciferin (Toyobo ). Bioluminescens blev målt ved 37 ° C under en CO 5%

2 atmosfære og integreret i 1 min med intervaller på 10 min under anvendelse af en skål-typen luminometer, AB-2550 Kronos Dio (ATTO, Tokyo, Japan) [20], [21]. Bioluminescens aktivitet blev udtrykt som relative lysenheder (RLU’er). Hvert eksperiment blev gentaget mindst fire gange. Cellerne blev dyrket i luminometeret i mindst 4 dage, mens instrumentet tælles deres bioluminescens. De opnåede rå data (10 min bins) blev glattet med en 10-punkts glidende gennemsnit metode og detrended ved at fratrække en 12-h glidende gennemsnit af de udglattede data [21].

Analyse af døgnrytmen hjælp bioluminescens

for at teste betydningen af ​​døgnrytmen rytme og beregne døgnrytmen parametre (dvs. periode, amplitude, og acrophase), vi udførte edb dataanalyse i Cosinor software downloadet fra døgnrytmen Laboratory (Walterboro, SC, USA) software hjemmeside (https://www.circadian.org/software.html) [22], [23]. Døgnrytmen parametre blev beregnet ved hjælp af data fra 1-5 dage efter dexamethason behandling.

Automatiseret billedoptagelse og analyse

NIH3T3 celler blev podet (5 × 10

4 per brønd) den 6.- brønds plader 1 dag før transfektion, og ekspressionsplasmidet blev transficeret under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. En dag efter transfektion blev celler behandlet med 100 nM dexamethason (Nakalai Tesque) i 2 timer, og mediet blev udskiftet med medium i fravær af phenolrødt suppleret med 10% FBS. Celler blev farvet med 0,1 ug /ml Hoechst 33342 (Invitrogen) i 1 time og analyseret under anvendelse ArrayScan XTI (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

Kvantificering af mRNA ved real-time RT-PCR

Alle celler blev høstet ved 4-timers intervaller mellem seks plader på hvert tidspunkt begynder 24 timer efter behandling med dexamethason. Totalt RNA fra disse celler blev ekstraheret ved anvendelse ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan) og revers transkriberet.

Per2

GAPDH

transkripter blev kvantificeret under anvendelse af en ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR blev udført ved anvendelse af One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio, Kyoto, Japan) med de følgende termisk cykling parametre: 94 ° C i 5 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 94 ° C i 20 s og 62 ° C i 1 min.

GAPDH

afskrift blev brugt til at normalisere udtryk for hver udskrift. Circadian rytme signifikans blev analyseret ved anvendelse af Cosinor software (døgnrytme Laboratory) [22], [23]. Primere for hvert gen blev designet baseret på den tilgængelige information fra National Center for Biotechnology Information (NCBI). PCR primersekvenser var som følger:

Per2

(GenBank accessionsnr, NM_022817, amplicon, 85 bp.): Sense primer 5′-CACACACAGAAGGAGGAGCA-3 ‘og antisense-primer 5’- AGTAATGGCAGTGGGACTGG-3 ‘

GAPDH

(GenBank nej, M33197, amplikon, 185 bp.):. sense primer 5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′ og antisense-primeren 5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 ‘.

Luciferaseassayreagens

transficerede NIH3T3 celler blev anvendt til luciferaseassays. En dag før transfektion blev celler podet (5 x 10

4 per brønd) på 24 brønds-plader indeholdende DMEM suppleret med 10% FBS, penicillin (24 U /ml) og streptomycin (25 ug /ml). Celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). For hver prøve blev transficeret DNA tilsat til hver brønd. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne vasket i phosphatpufret saltvand (PBS) og sprængt med 100 pi passiv lysepuffer (Promega). Luciferaseaktivitet blev bestemt ved anvendelse af en dobbelt-Luciferase Reporter Assay System (Promega) og en Ascent FS II luminometer (Thermo Scientific).

Western blotting

Alle celler blev synkroniseret med 100 nM dexamethason behandling for 2 timer. Derefter blev mediet erstattet med frisk medium. Efter 24 timers inkubation blev disse celler lyseret i Cell Lytisk-MT (Sigma). Cellelysaterne blev centrifugeret ved 15.000 rpm ved 4 ° C i 10 min. Supernatanterne blev opbevaret som helcelleekstrakter ved -80 ° C indtil anvendelse. Til Western blotting, blev 20- ug protein opløst på 7,5% natriumdodecylsulfat polyacrylamid (SDS-PAA) geler og overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranerne blev blokeret med Tris-bufret saltvand (TBS) -Tween indeholdende 5% fedtfri tørmælk. blev påvist Proteiner hjælp antistoffer mod HIF1α (fortynding 1: 500; BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), PER2 (fortynding 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien, USA), CRY1 (fortynding, 1:2000; Santa Cruz Biotechnology), CLOCK (fortynding 1:1000, Thermo Scientific), GAPDH (fortynding 1:10000, Sigma), og BMAL1 (fortynding 1:100, mus monoklonalt antistof, der genereres i vores laboratorium). Vi udførte fire replikere Western blots; en repræsentativ blot vises

chip assay

blev udført chip eksperimenter ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit ifølge producentens anvisninger (Magna-chip, Millipore, Bedford, MA, USA).. I korte træk blev Caki-2-celler udpladet i skåle 100-mm diameter (5 × 10

4 celler pr skål); efter 24 timer blev cellerne inkuberet med formaldehyd (slutkoncentration, 1%) i 10 minutter ved 37 ° C til tværbinding proteiner til DNA. Uomsat formaldehyd blev standset med 1 ml 10 × glycin. Pladen blev vasket to gange med iskold PBS, og pillerne blev høstet i 1 ml PBS med proteasehæmmer cocktail og poolet sammen i et 1,5-ml rør. Den tværbundne chromatin blev klippet ved lydbehandling 20 gange i 1 min hver gang med 1 min på afkøling på is mellem impulser under anvendelse af en Branson 2510 Ultrasonic Cleaner (Branson, Danbury, CT, USA). Immunpræcipitering (IP) blev udført med 5 ug af enten anti-HIF1α (fortynding 1: 500; Novus Biologicals Inc., Littleton, CO, USA) eller anti-IgG-antistof (Millipore) som en negativ kontrol. Vaske og eluering af IP-DNA blev udført ifølge Magna-chip protokol (Millipore). Ti procent (10%) af den oprindelige klippet kromatin DNA blev ligeledes revers tværbundet og oprenset, og det udvundne DNA blev anvendt som input kontrol. PCR blev udført med specifikke primere flankerer HRE-lignende sekvens inden promotorregionen af ​​det humane

Per2

genet (-476 til -284 bp, sense: 5′- ACGCCGGAAGTGGATGAGAC 3 ‘og antisense: 5’- CGACTCCGTCTCATCTGCATACAT 3 ‘) med de følgende termisk cykling parametre: 94 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 94 ° C i 20 s, annealing ved 59 ° C i 30 s og forlængelse ved 72 ° C i 30 s.

Statistisk analyse

Hvert forsøg blev gentaget mindst fire gange. Data er udtrykt som middelværdi ± standardfejl. For at vurdere betydningen af ​​forskelle, Students

t

-test blev udført. Vi anvendte en envejs variansanalyse (ANOVA) for sammenligninger mellem lægemiddelkoncentrationsenhederne grupper, efterfulgt af anvendelse af Tukey post hoc test. For alle analyser, blev signifikansniveauet sat til

P

0,05. Den Cosinor software (døgnrytme Laboratory) [22], [23] blev anvendt til at analysere døgnrytmen rytme.

Resultater

Circadian udtryk for

Per2

gen i nyrekræft cellelinjer

for at udforske den transkriptionelle svingning

Per2

, alle cellelinjer blev transficeret med en luciferasereportergen drevet af

Per2

promotor, og en real-time overvågning assay blev udført under anvendelse af Kronos Dio (AB-2550; ATTO). En luciferase-bundet promotor i Caki-2-celler viste døgnrytmer efter 2 timer dexamethason behandling (fig. 1A, tabel 1), men rytme blev ikke påvist i andre cellelinjer (fig. S1). Hvert eksperiment blev gentaget fire gange, og disse resultater var konsistente. 24 timer efter dexamethason behandling,

Per2

mRNA niveauer havde en døgnrytme i Caki-2-celler (fig. 1B, tabel 1). Disse resultater viste, at døgnrytmen rytme af

Per2

gen var ikke påvises i nyrekræft cellelinjer, eksklusive Caki-2 celler.

(A) Alle nyrekræft cellelinjer blev transficeret med Per2 promoter reporter (2 ug) og bioluminescens blev derefter målt under anvendelse af et tidstro overvågning assay. Real-time overvågning af luciferaseaktivitet af

Per2

promotor viste, at aktiviteten svingede over en ca. 24-h cyklus. Luciferaseaktiviteterne af fire gentagne prøver er vist. Disse kulturer viste signifikante døgnrytmen (tabel 1). (B) mRNA-niveauer af

Per2

blev bestemt ved real-time PCR for seks plader på hvert tidspunkt. Totalt RNA blev ekstraheret hver 4 timer, begyndende 24 timer efter behandling med dexamethason for en 24-h-cyklus, og

Per2

transkripter blev kvantificeret. Fejllinjer angiver standardafvigelser af de gennemsnitlige værdier (

n

= 6). Dataene fra et enkelt 24 timer efter dexamethason behandling blev analyseret ved anvendelse af Cosinor software til rytme (tabel 1). (C) Strukturen af ​​

Per2

promotor og en analyse af de potentielle transkriptionsfaktor-bindende motiver i denne region. Den 2.994 bp region indeholder en E-box-lignende sekvens (CACGTT) og en HRE-lignende sekvens (ATGTG), svarende til konsensus HRE-sekvensen (ACGTG) placeret opstrøms for transkriptionsstartsitet (TSS). (D) Sekvenssammenligninger: øvre linje, muse sekvens; nederste linie, human sekvens. Nukleotidsekvensen af ​​potentielle transkriptionsfaktor-bindende motiver for E-box-lignende sekvens og HRE-lignende sekvens er 100% konserveret mellem mus og menneske.

Analyse af

Per2

promotor omegn

en tidligere undersøgelse viste, at en E-box-lignende sekvens (CACGTT) og dens downstream region er afgørende for transkriptionel svingning

Per2

, en afgørende komponent i molekylære ure [24]. Vi fokuserede på denne E-box-lignende område og HRE. Transkriptionsfaktoren-bindende motiver placeret på

Per2

promotor i mus og mennesker blev analyseret ved hjælp Matlnspector software (Genomatix, München, Tyskland). Sekvensanalyse af den

Per2

promotorregion afslørede høj homologi mellem mus og mennesker. Sekvensanalyse afslørede også en E-box-lignende sekvens (CACGTT) og en HRE-lignende sekvens (ATGTG), svarende til konsensus HRE-sekvensen (ACGTG) [25] placeret opstrøms for transkriptionsstartsitet (TSS) (Fig. 1C ). Disse sekvenser var 100% konserveret mellem mus og mennesker (fig. 1d). En real-time overvågning assay (fig. 1A), at promoter region, vi klonet er tilstrækkelig til at producere døgnrytmen transkriptionel svingning i humane cellelinjer.

Angivelse af ur gener i nyrekræft cellelinjer

for at undersøge forskellen mellem Caki-2 og andre cellelinjer, undersøgte vi ekspressionen af ​​BMAL1, CLOCK, PER2, og CRY1 proteiner. Caki-2, 786-O, og A498 celler udtrykte BMAL1 protein. Alle nyrekræft cellelinjer udtrykte CLOCK og CRY1 protein, men gav ikke udtryk PER2 protein (fig. 2A). Fuld længde blots af PER2 og BMAL1, foruden en positiv kontrol, er vist i figur S2, S3.

Alle cellelinier blev lyseret og høstet 24 timer efter synkronisering af 2-h dexamethason behandling. Vi udførte fire replikere Western blots; en repræsentativ blot er vist. (A) Western blots af nyrekræft hel-celle ekstrakter (20 pg) med BMAL1, CLOCK, PER2, CRY1 og GAPDH antistoffer er vist. Fuld længde blots af PER2 og BMAL1, foruden en positiv kontrol, er vist i figur S2, 3. (B) Western blots af nyrekræft helcelleekstrakterne (20 ug) med HIF1α og GAPDH antistoffer er vist.

Angivelse af HIFα protein under normoxiske forhold i renal cancer cellelinjer

Siden HIF1α protein kan generelt overudtrykt i RCC, vi også undersøgt ekspression af HIF1α protein. I Caki-2 og RCC4 + vektor alene, blev HIF1α protein overudtrykkes (fig. 2B). I betragtning af de resultater, som

Per2

døgnrytme blev vist kun i Caki-2-celler, som indeholdt BMAL1, CLOCK, og HIF1α protein, er det muligt, at HIF1α er relateret til

Per2

døgnrytmen rytme i nyrekræft cellelinjer.

virkningen af ​​HIF1α på

Per2

transkriptionsaktivitet

for at undersøge virkningen af ​​HIF1α på

Per2

transkriptionel aktivitet, NIH3T3 og U2OS celler blev transficeret med en luciferasereportergen drevet af

Per2

promotor og cotransficeret med

Hif1α

Arnt

ekspressionsvektor. Co-transfektion med HIF1α /Arnt øgede amplituden af ​​svingning og havde ingen indflydelse på perioden eller acrophase af oscillation i disse cellelinjer (fig. 3A-D, tabel 2). De samme resultater blev observeret i Caki-2-celler (fig. 3E, F, tabel 2).

(A) NIH3T3-celler blev co-transficeret med

Per2

promoter reporter (400 ng ) og de angivne ekspressionsplasmider (300 ng) til HIF1α /ARNT eller tom vektor pcDNA3 (600 ng) som en kontrol. Bioluminescens blev derefter målt under anvendelse af en overvågning i realtid assay. Kontrol, transficeret med tomme pcDNA3 (ikke-klonede-vektor kontrol); + HIF1α /Arnt, transfekteret med ekspressionsplasmiderne. Luciferaseaktiviteter af fire gentagne prøver er vist. (B) Detrended bioluminescens er vist. Periode blev amplitude, og acrophase af oscillationerne målt på dag 2 til 5 under anvendelse af Cosinor software (døgnrytme Laboratory). Amplitude signifikant forøget (middelværdi ± SEM,

n

= 4) sammenlignet med kontrolgruppen (

s

0,01, Students

t-

test). Se Tabel 2. (C) U2OS celler blev cotransficeret med

Per2

promoter reporter (400 ng), og de angivne ekspressionsplasmider (300 ng) til HIF1α /Arnt eller tomme pcDNA3 (600 ng) som en kontrol. Bioluminescens blev derefter målt under anvendelse af en overvågning i realtid assay. Kontrol, transficeret med tomme pcDNA3 (ikke-klonede-vektor kontrol); + HIF1α /Arnt, transfekteret med ekspressionsplasmiderne. Luciferaseaktiviteter af fire gentagne prøver er vist. (D) Detrended bioluminescens er vist. Periode blev amplitude, og acrophase af oscillationerne målt på dag 2 til 5 under anvendelse af Cosinor software (døgnrytme Laboratory). Amplitude signifikant forøget (middelværdi ± SEM,

n

= 4) sammenlignet med kontrolgruppen (

s

0,01, Students

t-

test). Se Tabel 2. (E) Caki-2-celler blev cotransficeret med

Per2

promoter reporter (2 ug), og de angivne ekspressionsplasmider (1,5 gg) for HIF1α /Arnt eller tomme pcDNA3 (3 ug ) som en kontrol. Den bioluminescens blev derefter målt under anvendelse af en overvågning i realtid assay. Kontrol, transficeret med tomme pcDNA3 (ikke-klonede-vektor kontrol); + HIF1α /Arnt, transfekteret med ekspressionsplasmiderne. Luciferaseaktiviteterne af fire gentagne prøver er vist. (F) Detrended bioluminescens er vist. Periode, amplitude og acrophase af oscillationerne blev målt fra dag 2 til 5 under anvendelse af Cosinor software (døgnrytme Laboratory). Amplitude signifikant forøget (middelværdi ± SEM,

n

= 4) sammenlignet med kontrolgruppen (

s

0,01, Students

t

-test). Se tabel 2.

HIF1α har ingen effekt på antallet af NIH3T3 celler

For at bestemme om HIF1α øge amplituden af ​​svingningerne i

Per2

promoter aktiviteter ved at øge antallet af celler, udførte vi celletal ved hjælp ArrayScan XTI (Thermo Scientific). Co-transfektion med HIF1α /ARNT havde nogen indflydelse på antallet af NIH3T3-celler (fig. 4). Dette indikerer, at HIF1α /ARNT øgede bioluminescens af

Per2

promotoraktiviteter ikke påvirker antallet af celler.

NIH3T3-celler blev co-transficeret med Per2 promoter reporter (400 ng) og angiven ekspressionsplasmider (300 ng) til HIF1α /Arnt eller tomme pcDNA3 (600 ng) som en kontrol. Plader blev læst på ArrayScan XTI (Thermo Scientific) til celletælling angivne tid efter dexamethason behandling. Antallet af levedygtige celler blev ikke påvirket af HIF1α /Arnt på alle tidspunkter (gennemsnit ± SEM,

n

= 6, Students

t

-test).

HIF1α binder direkte til HRE-lignende sekvens i

Per2

promotor

for at bestemme om HIF1α påvirket

Per2

transskription gennem HRE-lignende element, en formodet HIF1α- bindende sekvens, vi undersøgt virkningerne af HIF1α /Arnt om

Per2

udtryk ved hjælp af en luciferaseanalyse i NIH3T3 celler. HIF1α /Arnt steget

Per2

transkriptionel aktivitet, men havde ingen effekt på HRE-mutant

Per2

initiativtagere (fig. 5A, B). CoCl

2 behandling inducerer HIF1α ekspression ved binding til PAS domæne, hvilket resulterer i blokering af HIF1α-pVHL binding, hvilket HIF1α stabilitet [26], [27]. For at undersøge effekten af ​​CoCl

2-induceret HIF1α overekspression på

Per2

transkriptionel aktivitet blev celler behandlet med CoCl

2. CoC

2 opreguleret

Per2

transskription, men havde ingen effekt på HRE-mutant

Per2

promotor (fig. 5C). Disse resultater antyder, at HRE-lignende sekvens i

Per2

promotor vi klonet svarede på HIF1α overekspression. For at undersøge om HIF1α direkte binder til HRE-lignende sekvens i

Per2

promotor

in vivo

, en chip assay blev udført. Tværbundne Caki-2-celler blev immunfældet med kanin-anti-HIF1α antistof eller normalt kanin IgG. De resulterende immunopræcipitater blev analyseret ved PCR-assays under anvendelse af primere, der flankerer de HRE-lignende sekvenser (-476 til -284 bp) af

Per2

promotor. En mærkbar stigning i intensiteten af ​​det DNA-bånd blev observeret for kanin-anti-HIF1α antistof (fig. 5D, bane 3), men ikke for normalt kanin IgG (fig. 5D, bane 2). Disse resultater viste, at HIF1α kan øge

Per2

transkriptionsaktivitet ved direkte binding til HRE element og øge amplituden af ​​svingningerne i

Per2

promotoraktiviteter.

(A ) Skematisk fremstilling af muse

Per2

promotor. Det øverste område repræsenterer vildtype mus

Per2

promotor og det nederste område repræsenterer HRE-mutant

Per2

promotor. (B) HIF1α /Arnt potent induceret

Per2

promotor-aktivitet.

Per2

promotoren og HRE-mutant

Per2

promoter reporter (60 ng) blev cotransficeret med de angivne ekspressionsplasmider (+; 50 ng).

Per2

promoter aktiviteter blev signifikant forøget (middelværdi ± SEM,

n

= 4,

s

0,01, Students

t

test) i forhold til kontrollen (uden ekspressionsplasmidet), men HRE-mutant

Per2

promotoren blev ikke påvirket. (C) Fireogtyve timer efter behandling med CoCI2 (10, 30, 100 uM i 6 timer), luciferaseaktiviteten blev målt

.

Per2

promoter aktiviteter blev signifikant forøget (middelværdi ± SEM,

n

= 4,

s

0,05, envejs ANOVA efterfulgt af Tukey post hoc test) koncentration -dependently sammenlignet med kontrollen, men HRE-mutant

Per2

promotoren blev ikke påvirket. (D) HIF1α specifikt interagerer med HRE-lignende sekvens i

Per2

promotor. Caki-2-celler blev tværbundet, lyseret, og immunpræcipiteret med anti-HIF1α antistof eller normalt kanin IgG (negativ kontrol). Det udfældede DNA blev underkastet PCR med primere specifikke for målområdet (-476 /-284). En alikvot af input DNA blev anvendt som en positiv kontrol. PCR-produkt blev observeret i anti-HIF1α chip (bane 3) og 10% Input DNA (bane 4). Væsentligt mindre blev detekteret i nogen antistof chip (bane 1) og normal kanin IgG chip (bane 2) baner.

Effekten af ​​hæmmende HIF1α på

Per2

døgnrytme

Chrysin er en naturlig flavonoid, som vides at inhibere HIF1α ekspression ved at reducere proteinsyntese og dermed formindsker HIFα stabilitet uden at påvirke cellernes levedygtighed [28]. For at undersøge effekten af ​​hæmmende HIF1α protein på

Per2

døgnrytme, cellerne blev forbehandlet med forskellige Chrysin koncentrationer. Ekspressionen af ​​HIF1α protein blev undertrykt signifikant efter en 2-timers inkubation med 100 uM chrysin i Caki-2-celler (fig. 6A, B). Amplituden af ​​døgnrytmen af ​​

Per2

promotoraktivitet faldt betydeligt efter en 2-timers inkubation med 100 uM chrysin i Caki-2-celler (fig. 6C, D, tabel 3). Baseret på disse resultater, kan HIF1α øge døgnrytmen af ​​

Per2 dele på initiativtageren niveau.

(A) Caki-2 celler blev dyrket til 60-70% sammenløb. Cellerne blev behandlet med DMSO som en kontrol eller forskellige chrysin koncentrationer (1, 10, 100 pM) i 2 timer. (B) HIF1α protein niveauer er målt i densitetsværdier optiske normaliseret til deres respektive GAPDH lastning kontrol, så gennemsnit ± SEM, og plottes (relativ udtryk) til semikvantitativt sammenligne protein niveauer (

n

= 4). HIF1α ekspression blev signifikant undertrykt af 100 nM chrysin sammenlignet med kontrollen inkuberet med DMSO (

s Restaurant 0,05, envejs ANOVA efterfulgt af Tukey post hoc test). (C) Caki-2-celler transficeret med

Per2

promoter reporter (2 ug). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne inkuberet med 100 pM chrysin eller DMSO i 2 timer. Bioluminescens blev derefter målt under anvendelse af en overvågning i realtid assay. Luciferaseaktiviteterne af fire gentagne prøver er vist. (D) Detrended bioluminescens er vist. Periode blev amplitude, og acrophase af oscillationerne målt på dag 2 til 5 under anvendelse af Cosinor software (døgnrytme Laboratory). Amplitude faldt betydeligt (gennemsnit ± SEM,

n

= 4) sammenlignet med kontrolgruppen (

s

0,05). Se tabel 3.

Diskussion

I denne undersøgelse rytmisk udtryk for

Per2

genet blev observeret i Caki-2 celler. Men

Per2

promoter aktiviteter og mRNA-niveauer havde ikke døgnrytmen i andre cellelinjer. kan der være forskelle mellem Caki-2 og andre nyrekræft cellelinjer. Fordi

Per2

gentranskription aktiveres af heterodimeriseres transkriptionsfaktor BMAL1 /CLOCK ved binding til E-box-lignende sekvens [24] undersøgte vi ekspressionen af ​​BMAL1 og CLOCK protein i disse cellelinier. Caki-2, 786-O, og A498 celler udtrykte BMAL1 og alle cellelinjer indeholdt CLOCK protein. Endvidere er alle nyrekræft cellelinjer udtrykte CRY1 protein, men gav ikke udtryk PER2 protein. I Caki-2-celler, vi undersøgte også udtryk for PER2 protein ved 4-timers intervaller begynder 24 timer efter behandling med dexamethason. Der blev imidlertid ikke PER2 protein påvist på alle tidspunkter (fig. S4).