PLoS ONE: TGF-β Regulerer DNA Methyltransferase Expression i prostatakræft, korrelerer med aggressive Capabilities, og forudser sygdom Gentagelse

abstrakt

Baggrund

DNA methyltransferase (DNMT) er en af ​​de vigtigste faktorer, der medierer methylering af kræftrelaterede gener, såsom TGF-β-receptorer (TβRs). Dette kan igen resultere i et tab af følsomhed over for fysiologiske niveauer af TGF-β i aggressiv prostatakræft (CaP). De specifikke mekanismer i DNMT rolle i CaP forblive ubestemt. I denne undersøgelse beskriver vi den mekanisme af TGF-β-medieret DNMT i CaP og dens samarbejde med kliniske resultater efter radikal prostatektomi.

Metode /vigtigste resultater

vi og brugte menneskelige CaP cellelinjer med varierende grader af invasiv evne til at beskrive, hvordan TGF-β medierer ekspression af DNMT i CaP, og dens virkninger på methylering status TGF-β-receptorer og den invasive evne CaP in vitro og in vivo. Desuden har vi bestemt sammenhængen mellem DNMT udtryk og klinisk resultat efter radikal prostatektomi. Vi fandt, at mere aggressive CaP-celler havde signifikant højere TGF-p-niveauer, forøget ekspression af DNMT, men reduceret TβRs sammenlignet med benigne prostataceller og mindre aggressive prostatacancerceller. Blokade af TGF-β-signalering eller ERK-aktivering (p-ERK) var forbundet med et dramatisk fald i ekspressionen af ​​DNMT, hvilket resulterer i en sammenfaldende stigning i ekspressionen af ​​TβRs. Blokade af enten TGF-β-signalering eller DNMT faldet drastisk de invasive kapaciteter af CaP. Inhibering af TGF-β i en TRAMP-C2 CaP model i C57BL /6-mus under anvendelse 1D11 var forbundet med nedregulering af DNMTs og p-ERK og forringelse i tumorvækst. Endelig uafhængig af Gleason klasse, blev forøget DNMT1 udtryk i forbindelse med biokemisk recidiv efter kirurgisk behandling for prostatakræft.

Konklusioner og betydning

Vores resultater viser, at CaP afledt TGF-β kan fremkalde udtrykket af DNMTs i CaP, som er forbundet med methylering af dets receptorer og den aggressive potentiale CaP. Desuden DNMTs er en uafhængig prædiktor for tilbagefald efter prostatektomi, og kan have kliniske konsekvenser for CaP prognosticering og terapi

Henvisning:. Zhang Q, Chen L, Helfand BT, Jang TL, Sharma V, Kozlowski J et al. (2011) TGF-β Regulerer DNA Methyltransferase Expression i prostatakræft, korrelerer med aggressive Capabilities, og Forudsiger Disease Gentagelse. PLoS ONE 6 (9): e25168. doi: 10,1371 /journal.pone.0025168

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Juni 20, 2011; Accepteret: August 26, 2011; Udgivet den 30. september, 2011

Copyright: © 2011 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af Grant Number 2 P50CA090386-06A2 fra National Cancer Institute, NIH, samt tilskud fra National Cancer Institute (U01 CA152738), American Cancer Society, Illinois (# 08-22), Department of Defense (W81XWH -09-1-0311), Portes center /Institute of Medicine i Chicago (QZ), American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG 93-037-12), et tilskud fra Genzyme Corporation, en bevilling fra Northshore University sundhedssystem , og en gave fra Mr. Fred L. Turner. Gennem ansættelse af SL, JH og BT, Genzyme Corporation rolle inkluderet: tilvejebringelse reagenser, tilbyder forslag af eksperimentel design og hjælpe med udarbejdelsen af ​​manuskriptet. De andre finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. SL, JH og BT er medarbejdere i Genzyme. Der er ingen patenter eller produkter under udvikling til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

TGF-β er en pleiotropisk vækstfaktor, som har været impliceret i flere, og ofte diametralt modsatte funktioner, herunder celleproliferation, celle- vækststandsning, differentiering og apoptose [1], [2]. Et oplagt spørgsmål, som disse forskellige funktioner er, hvordan TGF-β medierer disse tilsyneladende modstridende roller i både kræft og benigne celler. I kræftceller, TGF-beta fungerer som en vækstfremmer og aids i metastaser, mens det i normale celler det synes at hæmme cellevækst og inducere apoptose [3]. Karakteristik af aggressiv prostatakræft (CaP) omfatter et gradvist tab af følsomhed over for TGF-β og over-ekspression af TGF-β, som synes at starte en ond cirkel for tumorudvikling. Selv om det er velkendt, at en reduktion eller tab af ekspression af TGF-β-receptorer (TβRs) gør kræftceller at undslippe vækstinhiberende virkning af TGF-β og opnå en vækstfordel, den cellulære mekanisme (r) bag disse begivenheder i humane CaP-celler forbliver udefineret. Vi har tidligere demonstreret, at tabet af TβRs ekspression ved promotor-methylering er forbundet med ufølsomhed over for TGF-β-medieret vækstinhibering [4].

DNA methylering udføres ved DNA-methyltransferaser (DNMTs). Der er mindst tre funktionelle DNMTs der er blevet identificeret i eukaryote systemer. DNMT1 er blevet impliceret primært i vedligeholdelse af mønstre for methylering, som forekommer under cellulær replikation, og det fortrinsvis methylerer hemi-methylerede DNA [5]. Det har været den mest omfattende undersøgt vedligeholdelse methyltransferase og er rigeligt i tumorceller og væv. Til sammenligning har DNMT2 ikke at have væsentlig methylering aktivitet og DNMT3L sandsynligvis være begrænset til DNA-methylering under kimcellelinje udvikling [5]. Endelig DNMT3A og DNMT3B er kendt for at være de novo methylators af CpG sites [6], som har højere methyltransferaseaktivitet for umethyleret DNA end DNMT1 og kan bidrage til at de novo methylering under embryogenese [7], [8]. Selvom DNMT er rapporteret at være forbundet med nogle aggressive kræftformer som hepatocellulære carcinomer, mavekræft, ikke-småcellet lungekræft, lymfom og prostatakræft [9], [10], [11], [12], [13], dens rolle forbliver kontroversiel og den overordnede regulering, koordinering og aktivitet DNMTs er uklart med forskellige kræftformer. Endvidere mekanismen for DNMTs i cancerceller og dets associering med invasive maligne kapaciteter og kliniske resultater efter behandling ikke er blevet beskrevet,.

Vi rapporteret for nylig, at den epigenetiske regulering af TGF-β-induceret ekspression af Foxp3 kan være medieret gennem inaktivering af ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK), som kan nedregulere DNMTs i benigne celler [14]. Som anført ovenfor, CAP celler og væv er ufølsomme over for TGF-β-medieret vækstinhibering og har promotor- mønstre for methylering, som nedsætter ekspressionen af ​​TβRs (TβRI og TβRII) [4], [15], [16]. Taget sammen indikerer disse resultater, at ufølsomhed over for TGF-β i nogle CaP-celler er i det mindste delvis skyldes, at promotoren methylering af TβRs. Disse opdagelser har ført os til at udforske de følgende to hypoteser i denne undersøgelse: 1) Der kan være krydstale mellem tumor afledt TGF-β og DNMTs som er relateret til methylering i cancer; 2) DNMTs kan være tæt forbundet med prostatakræft progression og resultater efter radikal prostatektomi. Så vidt vi ved, dette emne er endnu ikke rapporteret.

Formålet med vores undersøgelse var adskillige gange. Først søgte vi at undersøge de tilsvarende ændringer i DNMT og TβRs udtryk og ERK aktivering efter behandling CaP celler med varierende grader af invasive kapacitet og godartede prostata epitelceller med TGF-β. Dernæst undersøgte vi effekten af ​​et neutraliserende TGF-β-antistof på ekspressionen af ​​DNMTs og tumorvækst in vivo under anvendelse af en xenograft model. Endelig har vi fastslået, om aktivering af DNMTs var forbundet med biokemisk recidiv efter radikal prostatektomi.

Materialer og metoder

(En detaljeret forklaring præsenteres i metode S1)

cellelinier

muse CaP cellelinje TRAMP-C2-celler blev opnået fra Dr. N. Greenberg [12]. Den godartede humane prostata epitelcellelinje, RWPE-1, blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC). BPH-1-celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Simon Hayward. Fire varianter af den humane CaP PC-3-cellelinjer (PC-3, PC-3M-Pro4, PC-3M og PC-3M-LN4) blev med varierende grader af invasive kapacitet venligst tilvejebragt af Dr. Fidler og Dr. Pettaway [ ,,,0],17], [18], [19], [20]. Grunden vi valgte PC-3-varianter var fordi disse varianter stammer fra den samme cellelinie, men varierer i deres aggressive kapaciteter. Resultaterne af signalering regulering var mere sammenlignelig i modsætning til anvendelse af de forskellige typer af Cap-cellelinier. Til nogle eksperimenter blev celler gøres ufølsom over for TGF-β (som en negativ kontrol) ved at indføre en TβRIIDN som tidligere beskrevet [21], [22]. I nogle eksperimenter blev celler behandlet med eller uden TGF-β1 eller MEK-inhibitor U0126 (Promega). Endelig nogle forsøg indebar brug af anti-TGF-β (1, -2, -3) neutralisering mAb (klon 1D11; en gave fra Genzyme Corporation) som tidligere beskrevet [23], [24]. (Fremgangsmåde S1).

TGF-β1 ELISA

RWPE-1, BPH-1 og alle PC3 varianter og den tilsvarende TβRIIDN inficerede cellelinjer blev dyrket i frisk serumfrit medium i 24 timer . TGF-β1 ELISA blev udført under anvendelse af human TGF-β1 Immunoassay Kit (R Amersham Biosciences) i yderligere 5 timer. Thymidininkorporering blev udtrykt som den del af tællinger findes i celler af ubehandlede kontroller (Metode S1).

Western blot-analyse

Western blot analyser blev udført for at sammenligne TβRs, DNMTs og ERK udtryk efter forskellige behandlinger over tid (metode S1).

methylering-Specific PCR (MSP) og sekventering

MSP for status methylering af TβRs blev udført i overensstemmelse med vores tidligere rapport [4]. De methylerede steder i cytosin positioner med /uden behandling af 5-Aza eller TGF-β blev identificeret.

Immunofluorescens og Co-farvning

Immunofluorescens undersøgelser blev udført på alle PC-3 cellelinje derivater som tidligere beskrevet [22], [25]. For co-lokalisering af DNMTs og phosphoryleret ERK (p-ERK) blev cellerne analyseret ved hjælp af kerne (DAPI) -DNMTs (TR) -p-ERK (FITC) tredobbelt farvning (Metode S1).

Kvantitative RT-PCR

Humane godartet prostata epitelceller RWPE-1 og BPH-1, og CaP PC-3 serier) blev dyrket i frisk medium i 24 timer, derefter udsat i 24 timer til enten: 1) ekstern rekombinant TGF-β1 (10 ng /ml), 2) anti-TGF-β neutraliserende monoklonalt Ab (1D11; 5 ug /ml), eller 3) MEK-inhibitor U0126 (5 uM). Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af et RNeasy kit (Qiagen). Primere til human for DNMTs [26] og TβRs [4] blev opført i Metode S1.

Cell invasion assay

Cell invasion assay (Matrigel invasion assay) blev udført i en 24-brønds Transwell kammer (8 um porestørrelse; CytoSelect, Cell Biolabs). Celler blev udpladet ved en tæthed på 0,5 x 10

6 til 1,0 x 10

6 /ml i serum-frit medium. TGF-β1 og /eller Erk inhibitor UO126, 5-aza blev tilsat direkte til cellesuspensionen, og 24 timer senere blev suspensionen aspireret, og invaderede celler blev talt under et lysmikroskop under stor forstørrelse objektiv (× 100; Olympus) og målt ved A560 nm i en plade-læser efter behandling med udvinding løsning.

Animal Studies

undersøgelsen blev indledt med den subkutane (sc) injektion af mus prostatakræft TRAMP-C2-celler transficeret med HSV1-tk-GFP-luciferase (SFG-nTGL) reportergenekspression vektor [27], [28] i den højre flanke området omkring 30 C57BL /6-mus som beskrevet tidligere [25]. Dyrene blev randomiseret til en af ​​tre grupper efter intraperitoneale injektioner med det specifikke anti-TGF-β neutraliserende antistof 1D11 eller kontrol antistof 13C4 som beskrevet før [23], [24]. Alle musene blev aflivet efter 15 injektioner af antistoffer og gruppe 3 blev aflivet på samme tidsinterval. (Fremgangsmåde S1). Denne undersøgelse modtaget godkendelse fra de institutionelle gennemgang bestyrelse Northwestern University (Evanston, IL). Northwestern University ACUC Godkendelse protokol nummer 2007-0565. “(Letter S1).

Konstruktion af Tissue Microarrays (TMA’er) og Klinisk Outcome Assement

Den eksisterende klinisk tilfælde oplysninger og krænges væv etableret inden for vores prostata SPORE program database på Northwestern University blev brugt. Alle tilmeldte emner forudsat skriftligt informeret samtykke fra Northwestern Memorial Hospital og undersøgelsen blev godkendt af Northwestern University Institutional Review Board (IRB tal er fra 1480 til 002, Letter S2). I alt 243 radikal prostatektomi prøver var tilgængelige med tilhørende kliniske oplysninger. En serie af prostata TMAs blev konstrueret med formalinfikserede, paraffinindlejrede radikal prostatektomi prøver som tidligere beskrevet [4], (fremgangsmåde S1 og Metode S2).

Immunhistokemi

Alle antistoffer dannet mod DNMTs, phosphoryleret ERK (p-ERK), total ERK (t-ERK), phosphoryleret Smad2, TβRI og TβRII blev først afprøvet og optimeret på hel-vævssnit og test arrays som beskrevet tidligere [4], [17], [29 ], [30], (fremgangsmåde S1 og Metode S2).

Statistisk analyse.

SPSS 10.0.7 softwarepakke (SPSS, Inc.) blev anvendt til alle analyser. Kaplan-Meier overlevelse kurve blev analyseret ved log-rank test ved hjælp af Graphpad Prism 4,02 software (Graphpad Software) (Metode S1).

Resultater

1. DNMTs ekspression er forbundet med nedregulering af TβRs og mere invasive prostatakræft fænotyper

En ELISA-assay blev indledningsvis udføres for at bestemme, om der var forskelle i de endogene ekspressionsniveauer af TGF-β i forskellige CaP cellelinjer sammenlignet med benign prostata-cellelinjer. Vi fandt, at alle PC-3-cellelinjer udtrykte signifikant højere niveauer af TGF-β (× 2 til 6 gange) i forhold til BPH-1 og RWPE-1 (p 0,05). Desuden fandt vi, at mere invasive celler (PC-3M og PC-3M-LN4) udskilles næsten 2 gange højere baseline niveauer af TGF-β1 sammenlignet med de mindre invasive cellelinier (PC-3 og PC-3M-Pro4) ( fig. 1A).

A. ELISA-assay demonstrerer, at PC-3-cellelinjer udtrykker signifikant (p 0,05) højere (× 2-6 gange) niveauer af TGF-β sammenlignet med benign prostata-cellelinier, BPH-1 og RWPE-1. Endvidere PC-3M og PC-3M-LN4, secernerede næsten 2 gange højere baseline niveauer af TGF-β1 i forhold til PC-3 og PC-3M-Pro4 celler, henholdsvis, som er mindre invasiv. B. En thymidininkorporering analyse angiver, at væksten af ​​RWPE-1 og BPH-1-celler inhiberes betydeligt ved udsættelse for TGF-β1. Til sammenligning er væksten af ​​PC-3 og PC-3M-Pro4 celler kun lidt hæmmet, og PC-3M-LN4 og PC-3M celler viser ingen signifikant respons på TGF-β1 eksponering. C. I alle cancercellelinier (her viser vi PC-3 som et eksempel), inhibering af TGF-β ved anvendelse af TβRIIDN konstruere medfører betydeligt højere naive TβRII ekspression og D. højere TGF-β-sekretion. Lignende resultater er fundet i resultaterne i de mere invasive cellelinjer. Til sammenligning var der ingen forskel i ekspressionen af ​​TβRII i BPH-1 eller RWPE-1, når de blev smittet med TßRIIDN (tabel S1).

Vi bekræftede, at forskellige prostata cellelinjer opfører forskelligt i respons på exogen TGF-β1 eksponering. For eksempel fandt vi, at RWPE-1 og BPH-1-celler var mest følsomt over for exogen TGF-β1 som deres vækst blev inhiberet af 64,1% og 61,9%, henholdsvis efter 24 timers behandling med TGF-β1. Til sammenligning blev PC-3 og PC-3M-Pro4 celler kun inhiberes med 13,7% og 12,3%, henholdsvis. Endelig vækstraten for PC-3M-LN4 og PC-3M var upåvirket af TGF-β1 eksponering (fig. 1B). Interessant i Cap cellelinjer, hæmning af TGF-β-signalering, der anvender den dominante negative type II TGF-β-receptor (TßRIIDN) opføre, var associeret med signifikant højere endogen TβRII ekspression (under anvendelse af antistoffer rettet mod det intracellulære domæne, fordi TβRIIDN kun omfatter ekstracellulære og transmembrane domæner, men ikke intracellulært domæne) (fig. 1C) og højere TGF-β-sekretion (fig. 1D). Til sammenligning var der ingen forskel i ekspressionen af ​​TGF-β i BPH-1 eller RWPE-1, når de blev inficeret med den retrovirale TβRIIDN konstruere (tabel S1).

I modsætning til ekspressionen af ​​TGF β, både TβRI og TβRII udtryk blev reduceret betydeligt i de mere invasive cellelinjer, PC-3M-LN04 og PC-3M, sammenlignet med PC-3 og PC-3M-Pro4-celler (fig. 2A). Blokade af TGF-β signalering med TβRIIDN vektoren forårsagede en cirka to til ti gange stigning i ekspressionen af ​​både TβRI og TβRII i alle CaP cellelinjer (fig. 2B). Tilsammen tyder det forhøjede niveauer af TGF-β er forbundet med inhibering af TβRs ekspression. Blokade af intracellulær TGF-β-signalering førte til opregulering af sekretionen af ​​TGF-β i cancerceller.

A. Western blot-analyser viser, at i modsætning til ekspressionen af ​​TGF-β, både TβRI og TβRII ekspression (som beskrevet i figur 1 B) reduceres betydeligt i de mere invasive cellelinjer sammenlignet med mindre invasive cellelinier. B. Blokade af TGF-β signalering med TβRIIDN forårsager betydelige stigning i udtrykket TβRIs i alle cellelinjer. C. I modsætning til ekspressionen af ​​TβRs, overekspression af DNMTs er forbundet med mere invasive cellelinjer sammenlignet med mindre invasive cellelinier. D. Blokering af TGF-β signalering med TβRIIDN forårsagede en ≥3 gange fald i ekspressionen af ​​DNMTs. Den tilsvarende værdi (relative forhold af TβRs /GAPDH eller DNMTs /GAPDH) vises i højre diagrammer. (Fig. 2A og 2B var fra samme Western Blot billede, og fig. 2C og 2D var fra den anden enkelt Western blot billede).

Siden promotor methylering af TβRs er forbundet med nedsat ekspression [ ,,,0],4], sammenlignede vi ekspressionsniveauerne af DNMTs i de forskellige CaP cellelinier. Generelt viste de mere invasive PC-3M-LN4 og PC-3M-celler en forøget ekspression af DNMTs, når der sammenlignes med mindre invasiv PC-3 og PC-3M-Pro4 (fig. 2C). Blokade af TGF-β signalering med TβRIIDN vektoren forårsagede en ≥3 gange fald i ekspressionen af ​​DNMTs i alle CaP cellelinjer (fig. 2D), og der var en tilsvarende stigning i ekspression af både TβRI og TβRII (fig. 2B). Den tilsvarende værdi (relative forhold TβRs /GAPDH eller DNMTs /GAPDH) er vist i højre paneler. Dette fund blev også støttet af yderligere bekræftende undersøgelser. Immunoblotanalyser viste, at efter behandling med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-Aza), ekspressionen af ​​TβRI og TβRII i PC-3 steg dramatisk. I modsætning hertil ekspression af både TβRI og TβRII faldt betydeligt med behandling af TGF-β og denne ændring kunne genvindes, når 5-aza tilsættes (fig S1A). Tilsvarende realtids-PCR bekræftede, at ekspression af både TβRI og TβRII blev forøget 2 til 2,5 folder efter behandling af 5-aza i PC-3-celler. Behandling med TGF-β undertrykte udtrykkene for TβRI og TβRII 46% og 29% (figur S1B). Vi identificerede også status methylering af TβRI og TβRII initiativtagere, ved hjælp af de samme metoder, MSP tilgang og sekventering [4]. Ved hjælp af denne teknik, fandt vi de samme methylerede steder som vores tidligere undersøgelse [4] i at cytosin positionerne -251, -231, -244, -348, -356 og -365 i promotoren for TβRI, og 27, 32 og -140 til initiativtageren af ​​TβRII blev methylerede (figur S1c). PC-3-celler har også en del af TβRI og TβRII promotorer, der er umethylerede. Interessant behandling med TGF-β øget status for methylering, men behandling med 5-aza konverteret alle methylerede sider for at umethyleret. Den thymidininkorporering analysen viste, at udbredelsen af ​​PC-3-celler blev kun beskedent hæmmet beskedent med exogent TGF-β. Til sammenligning 5-Aza behandling resulterede i signifikant inhibering af celleproliferation, uanset om exogent TGF-β blev tilsat til kulturen eller ej. Der var ingen signifikant forskel observeres mellem behandling med både 5-Aza og TGF-β eller med 5-aza alene (P 0,05) (Figur S1D)

2.. DNMTs udtryk formidles gennem et phosphoryleret-ERK afhængige vej

Vores tidligere undersøgelser viser, at ERK kan påvirke DNMT udtryk i godartede celler [14]. Vi søgte derfor at afgøre, om niveauet af aktiverede ERK (phosphoryleret ERK; p-ERK) er relateret til TGF-β-induceret ekspression af DNMTs. For at teste denne hypotese, vi først bestemmes niveauet af p-ERK i benign prostata celler og sammenlignet det med de niveauer i forskellige CaP cellelinjer. BPH-1 og RPWE-1 celler udtrykte signifikant højere baseline niveauer af p-ERK end PC-3-celler (Fig. 3A). Interessant tidsforløbet for p-ERK ekspression efter eksponering for TGF-β var forskellig mellem benigne og maligne cellelinjer. Specifikt var der en tidsafhængig positiv korrelation mellem behandling med TGF-β1 og ekspressionen af ​​p-ERK i alle PC-3-cellelinjer. Faktisk er denne hurtige stigning i p-ERK udtryk (4 gange) begyndte inden for 5 minutter efter TGF-β1 behandling. Niveauerne af p-ERK fortsatte med at stige i løbet af al efterfølgende tidspunkter op til 30 minutter efter TGF-β1 tilføjelse. Derimod blev ekspressionen af ​​p-ERK hurtigt inhiberet ( 5 minutter) efter TGF-β1 tilsætning til medierne af godartede celler, på en måde, der var uafhængig af den samlede ERK-proteinekspression (fig 3A.). Immunofluorescens undersøgelser blev efterfølgende anvendt til at afgøre, om p-ERK og DNMTs var co-lokaliseret til de samme cellulære regioner. Til dette formål, faste konfokale mikroskopiske analyser af formaldehyd immunfarvet PC-3-celler i fravær eller nærvær af TGF-β1, demonstrerede co-loczalization mellem p-ERK og DNMTs signaler. Kun cellerne med p-ERK immunofluorescens udstillet DNMT udtryk. I modsætning hertil, når PC-3-celler blev gjort ufølsomt for TGF-β1 ved transfektion med TβRIIDN blev niveauerne af både p-ERK og DNMTs reduceret dramatisk som bestemt ved immunofluorsence farvning (fig. 3B). For bedre at kvantificere dette forhold mellem TGF-β1, p-ERK og DNMTs, vi næste brugte real time PCR. Disse resultater viste, at eksponering for TGF-β1 i 24 timer signifikant forøgede ekspression af alle tre DNMTs (~16.7% -14%) i alle PC-3 cell linjer undersøgt. Behandling med et antistof specifikt for TGF-β1 (1D11; 5 mg /ml) eller den specifikke ERK inhibitor, UO126, medførte signifikant nedregulering af DNMTs mRNA-ekspression (~33.9% -52,3%, og ~41.5% -57,6% henholdsvis fig. 3C). Disse resultater antyder, at TGF-β-medieret ekspression af DNMTs er forbundet med en stigning i p-ERK i cancerceller. Specifikt vises tumorafledte TGF-β til at være ansvarlig for denne ERK-aktivering, som blokade af den oprindelige secernerede TGF-β resulterede i en stor ændring i ekspressionen af ​​DNMTs (fig. 3C). Disse resultater antyder også, at tumor afledt TGF-β-medieret ERK-aktivering er mindst en af ​​de vigtigste mediatorer for TGF-β inducerede ekspression af DNMTs der fører til TβRs nedregulering ved promotor-methylering i CaP [4], [14]. Efter behandling med TGF-β, var der en betydelig stigning i de invasive kapaciteter af Cap celler. Invasion af Cap celler blev hæmmet ved enten TGF-β-hæmmer 1D11, eller p-Erk inhibitor U0126 eller DNMT inhibor 5-Aza. Inhiberingen af ​​invasion af U0126 kunne ikke vendes ved TGF-β1 behandling. Vigtigt er det, DNMTs inhibitor 5-Aza kan dramatisk hæmmede hætten celler invasion, endnu mere end blokade af TGF-β eller p-ERK (fig. 3D). Denne observation tydede på, at p-ERK var nedstrøms faktor af TGF-β, og synergistisk medierer TGF-β regulerede DNMTs som var tæt forbundet med den invasive evne Cap celler.

A. De godartede BPH-1 og RPWE-1 celler udtrykker signifikant højere baseline niveauer af p-ERK end PC-3 celler. Der er en tidsafhængig positiv korrelation mellem behandling med TGF-β1 og ekspressionen af ​​p-ERK i PC-3-celler. Niveauerne af p-ERK fortsætte med at stige i løbet af al efterfølgende tidspunkter op til 30 minutter efter TGF-β1 tilføjelse. I modsætning hertil ekspressionen af ​​p-ERK er hurtigt ( 5 minutter) inhiberet efter TGF-β1 eksponering i benigne celler på en måde, der er uafhængig af den samlede ERK proteinekspression. B. Immunofluorescens afslører, at kun celler (dette er PC3 for eksempel), der udtrykker p-ERK udviser DNMT ekspression. I modsætning hertil, når PC-3-celler gøres ufølsom over for TGF-SS1 af TβRIIDN, niveauer af både p-ERK og DNMT reduceres betydeligt (forstørrelse: 10 × 20). C. Vi udførte real time PCR for bedre kvantificering af forholdet mellem TGF-β1, p-ERK og DNMTs. Udsættelse for TGF-β1 forøgede signifikant ekspression af alle tre DNMTs i PC-3-celler. Behandling med 1D11 eller MEK-inhibitor, er UO126 forbundet med nedregulering af alle DNMT mRNA-ekspression. D. (Her viste vi mest aggressive PC-3M som en prøve). Der var en signifikant stigning i cellemotilitet gennem en Matrigel-coated polycarbonatmembran under behandlingen af ​​TGF-β1 (10 ng /ml). Invasionen af ​​alle CaP-celler kunne inhiberes ved at blokere TGF-β signal ved 1D11 eller under anvendelse af en p-ERK inhibitor UO126 eller DNMT inhibitor 5-Aza separat. Hæmningen af ​​invasion af UO126 kan ikke fortrydes med TGF-β behandling. Øverst til højre panel: Tilsvarende antal invasive celler. Nederst til højre panel: absorbansværdier. Dette resultat indikerer p-ERK medieret TGF-β-induceret DNMT potenserer den invasive evne prostatacancercellelinjer. (Forstørrelse, 10 × 10).

3. In vivo validering af virkningerne af TGF-β på ERK aktivering, DNMT udtryk, og prostatakræft vækst

For at validere, om TGF-β er ansvarlig for aktivering af ERK og opregulering af DNMTs der kan være involveret i tumor progression in vivo, vi gennemførte forsøg med en mus xenograft CaP model, som er involveret injektion Cap tumorceller (TRAMP-C2 celler stabilt transficeret med en HSV1-tk-GFP-luciferase reporter, 5 × 10

6 /hver mus). Tumorvækst blev fulgt under anvendelse luciferase billeddannelse. Vi anvendte tre grupper mus for bedre at forstå virkningerne af TGF-β på ERK-aktivering og DNMT ekspression: Gruppe 1: mus (n = 10) modtog regelmæssige injektioner af TGF-β neutraliserende antistof, 1D11. Gruppe 2: mus (n = 10) modtog isotypekontrolantistof, 13C4, ved de samme regelmæssige intervaller som gruppe 1. Gruppe 3: modtog ingen behandling efter xenograft injektion som en kontrol. Vi fandt, at tumorvækst blev markant inhiberet med anti-TGF-β 1D11-antistof, behandling (gruppe 1) sammenlignet med de to andre grupper (fig. 4A, 4B). Faktisk ved afslutningen af ​​behandlingsperioden på 45 dage, en af ​​de ti mus (10%) i denne gruppe var fri for tumor. I de resterende 9 mus, den gennemsnitlige tumorvægt og volumen var 5,3 g og 6,85 cm

3 hhv. Til sammenligning blev tumorer findes i alle mus i gruppe 2 og 3. Den gennemsnitlige vægt og volumen af ​​tumorer i de 10 dyr behandlet med kontrol antistof (gruppe 2) eller ingen behandling (gruppe 3) var signifikant større (fig. 4C) . Der var ingen metastaser i alle grupperne, som vurderet af bioluminescens billeddannelse. Immunohistokemiske analyser af de primære tumorer afslørede, at ekspressionen af ​​p-ERK og DNMTs hos dyr i gruppe 1 var signifikant lavere end de to andre grupper (fig. 4D).

A. IVIS 100 imaging system blev anvendt til at overvåge tumorvækst i realtid. Vi fandt, at tumorvækst inhiberes dramatisk med behandling af 1D11 sammenlignet med gruppe 2 (13C4 behandling) og 3 (Ingen behandling kontrol). B. 1D11 behandling inhiberer tumorvækst på en tidsafhængig måde. C, Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden på 45 dage blev musene aflivet, og tumorerne blev isoleret. Den gennemsnitlige tumor vægt og volumen var 5,3 g og 6,85 cm

3, henholdsvis i 1D11 behandlingsgruppe. Til sammenligning var den gennemsnitlige vægt og volumen af ​​tumorer i de 10 dyr behandlet med kontrol 13C4 var signifikant større ved 15,8 g og 12,85 cm

3 hhv. De tilsvarende værdier i mus, der har modtaget behandling var 31,4 g og 23.39 cm

3, henholdsvis (

P

0,01 blandt tre grupper). D. immunhistokemisk analyse af de primære tumorer viste, at ekspressionen af ​​p-ERK, DNMTs i dyr med 1D11 behandling er betydeligt lavere end de to andre grupper.

4. DNMTs korrelerer med kliniske karakteristika

For at vurdere sammenhængen mellem TGF-β og induktion af DNMTs i Cap prøver, vi sammenlignet ekspressionsniveauerne af TGF-β1, ERK, p-ERK, TβRI, TβRII, p- Smad2, og DNMTs i arkiverede væv microarray prøver taget på tidspunktet for radikal prostatektomi og korreleret dem med tilsvarende patienternes kliniske og patologiske egenskaber (tabel S2 Hver markør blev tildelt en værdi på 0 (. 20% celle immunfarvning), 1 ( 20-49% celle immunfarvning), 2 (50-74% celle immunfarvning) og 3 (75-100% celle immunfarvning), afhængigt af procentdelen af ​​kræftceller viser positiv immunfarvning. den positive og negative kontrol farvning blev vist i “Figur S2 “. Vi fandt, at et højt niveau af ekspression af TGF-β1, p-ERK og DNMTs kombineret med et lavt niveau af ekspression af TβRI, TβRII, og p-Smad2 var forbundet med skadelige patologiske funktioner, såsom højere Gleason lønklasse ( fig. 5A, fig. 5B, tabel S3). Disse resultater svarer til vores fund i PC-3M-LN4 og PC-3M celler, TGF-beta inducerede DNMTs er forbundet med klinisk mere aggressive fænotyper.

A . Immunohistokemisk analyse af serielle TMA sektioner fra en patient med Gleason score på 8, afslørede højere ekspression af TGF-β, p-ERK, DNMTs, men lavere ekspression af TβRI og TβRII og p-Smad2 sammenlignet med serielle snit taget fra en patient med en lavere Gleason lønklasse af 6. Disse resultater er repræsentative for den fremherskende farvningsmønster set i alle patientprøver /tissue arrays (forstørrelse: 10 × 20). Det tilsvarende frekvens (eller procentdel) af farvning og intensiteten af ​​farvning kunne findes på BB Høje niveauer af TGF-β1-ekspression (Score = 3) blev identificeret i 42,3%, 8,9% og 7,0%, p-Erk ekspression i 36,4%, 6,7% og 13,5%, DNMT1 udtryk i 27,9%, 1,8% og 1,3%, DNMT3A udtryk i 40,6%, 11,9% og 6,7%, og DNMT3B udtryk i 58,7%, 18,3% og 22,8% af høj (≥8), mellemliggende