PLoS ONE: N-myc Downstream Reguleret Gene 1 (NDRG1) Fremmer Metastase for Human scirrhous mavekræft Cells via Epithelial Mesenchymale Transition

Abstrakte

Vores seneste undersøgelse viste, at højere ekspression af N-myc nedreguleret gen 1 (NDRG1) er tæt korreleret med dårlig prognose i gastrisk kræftpatienter. I denne undersøgelse, vi spurgte, om NDRG1 har afgørende roller i ondartet progression, herunder metastaser af gastriske kræftceller. Ved genekspression microarray analyse ekspression af NDRG1 viste større stigning blandt i alt 3691 opreguleret gener i et meget metastatisk gastrisk cancercellelinie (58As1) end deres parentale lav metastatisk modstykke (HSC-58). De meget metastatiske cellelinier viste nedsat ekspression af E-cadherin, sammen med forbedret udtryk for vimentin og Snail. Denne nedsatte ekspression af E-cadherin blev restaureret af Snail knockdown i stærkt metastatiske cellelinier. Vi næste etableret en stabil NDRG1 knockdown cellelinier (AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54) fra yderst metastatiske cellelinie, og begge disse cellelinjer viste forøget ekspression af E-cadherin og nedsat ekspression af vimentin og snegl. Og også blev E-cadherin-promotor-drevet luciferaseaktivitet fundet at forøges med NDRG1 knockdown i den meget metastatisk cellelinie. NDRG1 knockdown i mavekræft celle viste undertrykt invasion af kræftceller i surround væv, undertrykt metastaser til bughinden og nedsat ascites ophobning i mus med væsentligt forbedrede overlevelse. Dette er den første undersøgelse for at vise, at NDRG1 spiller sin centrale rolle i den maligne progression af mavekræft gennem epitelial mesenkymale overgang

Henvisning:. Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M et al. (2012) N-myc Downstream Reguleret Gene 1 (NDRG1) Fremmer Metastase for Human scirrhous mavekræft Cells via Epithelial Mesenchymale Transition. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: 8. december 2011; Accepteret: 22 Juni 2012; Udgivet: 23 Jul 2012

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling-i-støtte til kræftforskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (til Dr. Ono), og af Term Omfattende 3. Kontrol Research for Cancer fra Ministeriet for Sundhed, Labor, og dyrevelfærd Japan (Dr. Kuwano). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme i Japan og andre asiatiske lande. Patienten prognose for scirrhous gastrisk karcinom er især fattige. Scirrhous gastrisk karcinom er ofte ledsaget af peritoneale formidling og metastase til lymfeknuder og lever, som er alvorlige problemer, der skal kontrolleres. Genekspressionsprofil afslørede genamplifikationer af K-SAM og c-Met i 30-40% af scirrhous gastriske cancere, og at overekspressionen af ​​forskellige vækstfaktorer, såsom transformerende vækstfaktor-β (TGF-β), blodpladeafledt vækst faktor (PDGF), insulin-lignende vækstfaktor (IGF) og fibroblastvækstfaktor-2 (FGF-2) [1]. Seneste mikromatrice analyse viste specifik opregulering af flere gener, herunder

SPARC

,

RGEIII

,

S100A10

, og collagen type I [2] – [4].

Dyremodeller, der afspejler de særlige kendetegn ved kræft peritonitis og metastase til peritoneum er vigtige for forståelsen af ​​udviklingen af ​​malign progression ved gastrisk cancer. Yanagihara

et al.

[5] først etableret HSC-58 cellelinie fra human scirrhous mavekræft, og derefter etableret to underlinjer, 58As1 og 58As9, med et stort potentiale for peritoneal formidling og lymfeknude metastaser ved gentagen ortotopisk inokulering af HSC-58 celler i den gastriske væg af athymiske mus [6], [7]. Disse underlinjer ofte forårsager ophobning af ascites efter ortotopisk implantation og viser øget ekspression af gener, der koder proteaser og proteiner involveret i celleadhæsion, cellemotilitet, proliferation og angiogenese [6]. De vokser også selektivt i det gastriske submucosa, og invadere dybere lag for at nå serøse planet af maven [7]. Men det er uklart, hvorfor de har opnået et så stort potentiale for metastase under udvælgelsen.

I vores nuværende studie, brugte vi disse meget metastatiske cellelinier til at undersøge, hvordan menneskets gastriske cancerceller kunne erhverve metastatisk potentiale. Vi først sammenlignet genekspressionsprofiler mellem stærkt metastatiske og lave metastatiske parentale cellelinjer ved microarray analyse. Vi fokuserede på et gen navngivet N-myc nedstrøms reguleret gen 1 (NDRG1), fordi det viste sig at være markant opreguleret i de stærkt metastatiske gastriske cancercellelinjer sammenlignet med deres counterpart celler. Det blev også tidligere rapporteret, at NDRG1 ekspression var en prsedikativ markør for malign progression og dårlig prognose i gastriske patienter [8]. I overensstemmelse med dette studie observerede vi, at høj NDRG1 ekspression blev signifikant korreleret med tumor angiogenese og malign progression sammen med dårlig prognose i gastrisk cancer [9]. Vi rapporterede også, at NDRG1 knockdown inducerer nedsat produktion af potente angiogene faktorer og tumor angiogenese ved lungecancerceller, og også, at NDRG1 er en prædiktiv markør for tumorangiogenese og dårlig prognose hos patienter uden-småcellet lungecancer [10]. NDRG1, en af ​​de fire NDRG familien gener, viser således forskellige funktioner [11], og NDRG1 funktioner enten som metastaser suppressor eller som onkogen og ondartet promotor, afhængigt af tumortyper [11], [12]. Endvidere er ekspression af NDRG1 gen kontrolleres nøje ved N-myc og beslægtede Myc familie proteiner [13] og overekspression af c-Myc induceret epithelial mesenkymale overgang (EMT) i mammaepitelceller [14]. Den vigtige rolle EMT er ofte nævnt i dens tætte forbindelse med udvikling og tumor progression herunder kræft metastaser [15], [16]. Men i disse undersøgelser blev den regulerende rolle NDRG1 ikke undersøgt. I vores nuværende studie undersøgte vi metastatiske potentiale gastriske kræftceller ved sin korrelation med EMT-baserede rolle NDRG1.

Resultater

Sammenligning af cellevækst, Cell Morfologi, tumorvækst, Formidling og genekspression profiler mellem højt metastatisk mavekræft cellelinjer og deres lav metastatisk Modpost

i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [6], [7], de meget metastatiske cancer cellelinjer 58As1 og 58As9 viste højere vækstrater end deres forældres modstykke, HSC-58, med en fordobling tidspunkter af 23-26 timer sammenlignet med 30 timer for parentale celler (figur 1A). 58As1 celler blev let fritliggende og viste suspension-typen cellevækst med runde morfologi, mens HSC-58 og 58As9 celler blev bundet og viste lagdelte cellevækst med en fibroblastisk morfologi (figur 1B). Både 58As1 og 58As9 celler viste meget højere tumor vækstrater i en subkutan xenograft model i forhold til forældrenes HSC-58-celler (Figur 1C). Tidligere undersøgelser viste, at ortotopisk transplantation af 58As1 celler induceret meget højere peritoneal formidling og ascites ophobning end HSC-58 celler [6], [7]. Vi bekræftede yderligere den peritoneale udbredelse af cellerne ved at implantere dem i bughulen af ​​mus. Mus der fik implanteret 58As1 celler viste forekomsten af ​​et gennemsnit på 8 ± 3 synlige knuder i mesenteriet af hver mus og akkumulering af ascites (lige fra 0,7-2,5 ml /mus) (figur 1D, E). Derimod mus implanteret med forældrenes HSC-58 celler viste dannelsen af ​​få om nogen små knuder, og uden synlig akkumulation af ascites.

(A) Sammenligning af celleproliferation satser

in vitro

. Celler blev podet på dag 0 (5 x 10

4 celler /skål) og proliferation blev målt i RPMI 1640 indeholdende 10% FBS. Fordobling tider var 34, 27 og 23 timer for HSC-58 (sort), 58As1 (grå) og 58As9 celler (hvid), hhv. (B) Morfologi af gastrisk kræft cellelinje

in vitro

. HSC-58 og 58As9 cellevækst var synlig som vedhæftede lag med fibroblastisk morfologi. 58As1 celler viste suspension-typen cellevækst med runde morfologi. (C) Tumorvækst af gastriske cancercellelinier på dag 14 og 28. HSC-58 (sort), 58As1 (lysegrå), og 58As9 (mørkegrå) blev subkutant implanteret med 1 x 10

7-celler på dag 0 . 58As1 eller 58As9 celler viste signifikant (*

s

0,01) højere tumor vækstrater end HSC-58 celler. (D, E) Peritoneal formidling og ascites dannelse

in vivo

. Typiske tal viser høj og lav peritoneal udbredelse og ascites ophobning på dag 55 efter podning af 1 × 10

6 celler i bughulen. Hver mus viste ascites akkumulering af 0,7-2,5 ml og 5-12 knuder på mesenteriet følgende 58As1 inokulering, men dette var ikke tydelig med HSC-58-celler. N.D., ikke påvises. (F) Microarray analyse på ekspression af gener, der er op- eller ned- reguleret i højt metastatisk cellelinie, 58Asl, sammenlignet med HSC-58. Relative udtryk satser præsenteres på gener, der tilhører tre biologiske funktioner.

Vi næste sammenlignet genekspression profiler mellem 58As1 celler og deres forældres modstykke, HSC-58, ved hjælp af DNA-microarray analyse. Af de 41.000 RNA-transkripter og varianter, vi identificeret 3691 differentielt udtrykte gener, der blev opreguleres til 2-fold og 3536 gener, der blev nedreguleret til 0,5 gange eller mindre i 58As1 celler sammenlignet med HSC-58-celler. Figur 1F præsenterede gener, der blev udtrykkes forskelligt i 58As1 celler sammenlignet med HSC-58 celler, begrænset til dem, der hører til NDRG familie og gener relateret til metastase, herunder matrixmetalloproteinaser (MMP’er) /cathepsiner, vedhæftning og epitelial-mesenchymale-overgang ( EMT). Af de fire gener i NDRG familien [17], blev ekspressionen af ​​NDRG1 og NDRG4 opreguleres i meget metastatiske cellelinie (58As1) sammenlignet med den parentale cellelinje (HSC-58). Udtrykket af EMT-relaterede gener i 58As1 celler var især påvirket af købet af en høj metastatisk potentiale. Udtrykket af epithel-specifikke gener, herunder E-cadherin (

CDH1

), P-cadherin (

CDH3

) og β-catenin (

CTNNB1

), blev nedreguleret . Derimod kun MMP1 (

MMP1

) udtryk blev markant opreguleret; udtryk for cathepsin L (

CTSL1

) blev øget, men af ​​cathepsin B (

CTSB

) var ikke. Udtrykket af mesenchym-specifikke gener, vimentin (

VIM

) og Snail (

SNAI1

), en central transskription faktor til undertrykkelse af E-cadherin udtryk, blev opreguleret.

Udvidet NDRG1 genekspression i Stærkt metastatisk gastrisk cancercellelinier

Vi yderligere i forhold proteinet ekspression af flere gener i HSC-58, 58As1 og 58As9 celler (figur 2A). Ekspressionen af ​​NDRG1 blev markant forøget, og af vimentin, snail, p-ERK1 /2, p-Akt, og p-GSK-3β blev også øget i både 58As1 og 58As9 celler sammenlignet med HSC-58-celler. Der var tilsyneladende ingen ekspression af Wnt3a og Wnt5a i disse cellelinier (data ikke vist). Derimod observerede vi nedsat ekspression af E-cadherin og β-catenin i 58As1 og 58As9 celler sammenlignet med HSC-58-celler (figur 2A). Phosphorylering af β-catenin Ser33 /37 og Ser552 viste sig at være langt mindre i 58As1 og 58As9 end HSC58. Overensstemmelse med proteinet ekspressionsniveauer, mRNA ekspressionsniveauer af NDRG1, vimentin, Sneglen og MMP-1 var højere i begge stærkt metastatiske cellelinier end deres parentale modstykke (figur 2B). Der var meget mindre mRNA-ekspression af E-cadherin og β-catenin i både 58As1 og 58As9 end HSC-58.

(A) Western blot-analyse af totale cellelysater viser protein ekspressionsniveauer af NDRG1, vækstfaktorreceptor , EMT-relaterede proteiner, Wnt /β-catenin-relaterede proteiner og andre faktorer i HSC-58, 58As1 og 58As9 celler. (B) Sammenligning af mRNA ekspressionsniveauer af NDRG1, E-cadherin, vimentin, snail, MMP-1 og β-catenin i HSC-58, 58As1 og 58As9 celler ved QRT-PCR-analyse. (C) Immuncytokemisk analyse af E-cadherin og β-catenin i HSC-58 og 58As9, under anvendelse af specifikke antistoffer mod E-cadherin, β-catenin og DAP1. Forstørrelse × 200. (D) Western-blot-analyse viser ekspression af β-catenin og sneglen i nucleus og cytosol fraktion. CREB, en nuklear markør, og α-tubulin, en cytosol markør. (E, F) Sammenligning af luciferaseaktivitet drevet af E-cadhrin promotoren og β-catenin (TopFlash) drevet promotor mellem HSC-58 og dens stærkt metastatiske cellelinier. Den relative promotor-aktivitet præsenteres når normaliseret ved aktiviteten i HSC-58. * P. 0,01

Immuncytokemisk analyse afslørede, at lokaliseringen af ​​E-cadherin både i cytoplasmaet og membranen, og β-catenin blev hovedsageligt lokaliseret i cytoplasma i både HSC-58 og 58As9 celler (Figur 2C) . Immuncytokemisk analyse for 58As1 kunne ikke udføres som 58As1 vokser i suspension. Endvidere ekspression af β-catenin var relativt lavere i både cytoplasmaet og kernen, men af ​​sneglen viste sig at være meget højere i kernen af ​​58As1 og 58As9 end HSC-58 (figur 2D). Vi undersøgte også E-cadherin promotoraktivitet (figur 2E) og β-catenin induceret reporter-aktivitet ved TopFlash reporter assay (figur 2F) og fandt, at der var signifikant fald i luciferaseaktiviteten drevet af E-cadherin promotoren og også ved β-catenin i både 58As1 og 58As9 sammenlignet med HSC-58, i overensstemmelse med mRNA-niveauer af begge gener.

NDRG1 Knockdown inducerer opregulering af E-cadherin og nedregulering af vimentin og Snail i Meget metastatiske celler

Vi undersøgte dernæst, om NDRG1 knockdown særligt berørt ekspressionen af ​​EMT-beslægtede gener i det stærkt metastatisk cellelinie, 58As1. Vi etableret to stabile NDRG1 knockdown celle kloner, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 ved transfektion NDRG1 shRNA ind 58As1 celler. Både AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler viste lignende vækstrater til hinanden og deres forældres modstykke AS1 /Mock3, med en fordobling tider af 25-27 timer i kultur (figur 3A). Begge NDRG1 tavshed cellelinier viste stram vedhæftning af celler til dyrkningsskålen og fibroblastisk morfologi, hvorimod AS1 /Mock3 celler viste en suspension-typen cellevækst med runde cellemorfologi (figur 3B). Vi undersøgte dernæst virkningen af ​​NDRG1 lyddæmpning på tumorigene aktivitet af 58As1 celler under anvendelse af en forankringsuafhængig vækst assay. Begge NDRG1 tavshed cellelinier viste signifikant reduktion af deres forankringsuafhængig vækst, som angivet ved koloni nummer i blød agar (

*

s

0,01). (Figur 3C)

( A) Celleproliferation i RPMI 1640 indeholdende 10% FBS blev fulgt efter podning 5 × 10

4 celler /skål på dag 0. fordoblingstider var ens for AS1 /Mock3 (sort), AS1 /Sic50 (grå) og AS1 /Sic54 (hvid) celler (26-30 timer). (B) Cell morfologi AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54. Typisk cellemorfologi i kultur viser AS1 /Mock3 suspension-typen cellevækst og fastgjort lag-typen cellevækst af både NDRG1 knockdowned cellelinier. (C) Repræsentative billeder af kolonier af AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 når inkuberet i 14 dage i blød agar (venstre panel). Kvantitativ analyse af kolonidannelse aktivitet ved tre cellelinier, når 5 retter for hver linje blev scoret (højre panel). Signifikante forskelle (*

s

0,01). I koloni tal mellem 58As1 og dets NDRG1 knockdown cellelinjer

Så vi sammenlignet genekspressionsprofilerne mellem AS1 /Mock3 og AS1 /Sic50 celler under anvendelse DNA microarray analyse (figur 4A). NDRG1 knockdown resulterede i forøget ekspression af E-cadherin (

CDH1

) og P-cadherin (

CDH3

), men faldt udtryk for vimentin (

VIM

) og Snail (

SNAI1

). Dernæst udføres western blot og QRT-RCR analyser i flere molekyler, som blev moduleret af NDRG1 knockdown i microarray analyse (figur 4B, C). Disse to cellelinjer udviste meget lavere ekspression af både NDRG1 mRNA og protein sammenlignet med de AS1 /Mock3 celler. Øget ekspression af E-cadherin blev konsekvent overholdes i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler i forhold til AS1 /Mock3 celler ved Western blot analyse. I AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler, både Western blot og QRT-PCR-analyser bekræftede nedsat ekspression af vimentin og Snail uden at påvirke ekspression af p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β og GSK-3β (figur 4B, C).

(A) microarray analyse for virkningen af ​​NDRG1 knockdown på ekspression af gener, der er op- eller ned- reguleret i ASL /Sic50 versus AS1 /Mock3. Relative udtryk satser præsenteres på gener, der tilhører tre biologiske funktioner. (B) Sammenligning af protein ekspressionsniveauer af NDRG1, EMT-relaterede proteiner, β-catenin, Akt, p-Akt, ERK1 /2, p-ERK1 /2, GSK-3p, p-GSK-3p og EGFR ved western blot analyse med total cellelysat. (C) mRNA ekspression af NDRG1, E-cadherin, vimentin, snail, MMP-1 og β-catenin blev bestemt ved QRT-PCR-analyse. (D) Sammenligning af luciferaseaktivitet drevet af β-catenin (TopFlash) mellem AS1 /Mock3 og dets NDRG1 knockdowned cellelinier. Relativ luminescens fold præsenteres når normaliseret ved værdien i AS1 /Mock3. Hver søjle er gennemsnit af tredobbelte forsøg ± SD.

På den anden side er NDRG1 velkendt at undertrykke metastase og celleproliferation med prostata- og colon cancerceller. Nyere undersøgelser har vist, at NDRG1 modulerer Wnt-β-catenin signalvejen med forøget ekspression af E-cadherin i human prostata- og tyktarmskræft celle [18], [19]. Men NDRG1 knockdown i 58As1 celler ikke påvirke β-catenin-ekspression både protein og mRNA-niveau (figur 4B, C). Og også β-catenin drevet promotoraktivitet ved TopFlash reporter assay viste ingen forskel i promotoraktivitet mellem AS1 /Mock og NDRG1 tavshed cellelinier. Derfor blev β-catenin udtryk ikke påvirket af NDRG1 knockdown. NDRG1 knockdown således konsekvent øget ekspression af E-cadherin og nedsat ekspression af Sneglen og vimentin i den meget metastatisk cellelinie. Men der var ingen synlig ændring i ekspression af β-catenin ved NDRG1 knockdown.

Udvidet E-cadherin Promotor Aktivitet af NDRG1 Knockdown gennem Snail i mavekræft Celler

Af forskellige transkriptionsfaktorer, der undertrykker udtryk for E-cadherin herunder Snail, Slug, Twist, TCF4 og SIP1 [20], udtryk for Snail blev specifikt moduleret af NDRG1 i gastriske kræftceller. Vi undersøgte, om ekspression af E-cadherin og /eller vimentin kunne reguleres af Snail i HSC-58-celler. Forbigående behandling med Snail siRNA resulterede i forøget ekspression af E-cadherin, men ikke den for vimentin og NDRG1, i tidsafhængig måde (figur 5A). Der var kun en lille om nogen stigning i β-catenin ekspression ved Snail knockdown. Endvidere blev E-cadherin-promotor-drevet luciferaseaktivitet signifikant undertrykt ved transfektion af Snail komplementært DNA i to testede cancercellelinier (figur 5B). Vi næste sammenlignet E-cadherin promotoraktivitet mellem AS1 /Mock3 og dets NDRG1 tavshed cellelinier. Som det ses i figur 5C, der var signifikant (*

p

0,05). Enhancement af E-cadherin promotor aktivitet ved NDRG1 knockdown

(A) Sammenligning af protein ekspressionsniveauer af E- cadherin, β-catenin, NDRG1 og vimentin når transient behandlet med sneglen siRNA i 0, 48 og 96 timer ved western blot-analyse i HSC-58 celle. (B) E-cadherin-promotor-drevet luciferaseaktivitet i fravær eller nærvær af Snail ekspression i HSC-58 og BxPC-3-celler. E-cadherin-luc, blev transficeret med eller uden pcDNA3-sneglen, og luciferaseaktiviteten blev målt. Hver søjle er gennemsnittet af tredobbelte forsøg (*

s

0,05). (C) Sammenligning af E-cadherin promotor-drevet luciferaseaktivitet (E-cadherin-luc) i AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54. Hver søjle er gennemsnittet af tredobbelte forsøg (*

s

0,05). (D) Virkningen af ​​CT99021 på protein ekspression af NDRG1 og forskellige EMT-relaterede molekyler ved Western blot-analyse. 58Asl celler blev behandlet med angivne doser af lægemidlet i 24 timer. (E) Virkningen af ​​β-catenin knockdown af dets siRNA’er på ekspression af E-cadherin. HSC-58 celler blev transficeret med siRNA’er i 24 timer, og de samlede cellelysater blev analyseret ved Western blot-analyse.

GSK-3β er et nøgleenzym for aktivering af EMT pathway [20], [21 ], og også for phosphorylering af NDRG1 [22], [23]. Ekspression af p-GSK-3β blev forøget i det stærkt metastatisk cellelinie, 58As1 (se figur 2A). Vi undersøgte, om GSK-3β var involveret i NDRG1 inducerede ændret ekspression af E-cadherin og vimentin. Behandling med en inhibitor (CT99021) af GSK-3β resulterede i nedsat ekspression af p-NDRG1 og p-GSK-3β, og også øget ekspression af E-cadherin og β-catenin i 58As1 celler (figur 5D). Som vist i figur 5E, gjorde β-catenin knockdown ikke påvirke ekspressionen af ​​E-cadherin, vimentin og Snail.

NDRG1 Knockdown inducerer Mesenchymale epithelial Transition og undertrykker Metastase til bughinden af ​​højt metastatisk mavekræft Cells

Sammenligning tumor vækstrater på AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler i en xenograft model afslørede langsommere tumor vækst i både AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 af NDRG1 knockdown (figur 6A, B). NDRG1 knockdown undertrykte lokal invasion af AS1 /Mock3 tumorceller i det omgivende stroma og tilstødende fedtvæv og /eller muskelvæv, og indkapslet tumorvækst (figur 6C). Høj ekspression af E-cadherin blev observeret i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 tumorer, mens der blev observeret høj ekspression af vimentin i cancerceller i AS1 /Mock3 tumorer (Figur 6D). Derimod var der næsten ingen ændring i ekspression af β-catenin i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 tumorer sammenlignet med AS1 /Mock3 tumor.

(A) Tumorvækst blev fulgt efter subkutan inokulation af 5 × 10

6 AS1 /Mock3 (♦), AS1 /Sic50 (▪) og AS1 /Sic54 celler (▴). Inlet viser ingen synlig NDRG1 ekspression i enten AS1 /Sic50 eller AS1 /Sic54 tumorer. (B) Tumor volumen for AS1 /Sic50 (

s

= 0,87) og AS1 /Sic54 celler var lidt mindre end for AS1 /Mock3 (day28). Hver søjle er et gennemsnit af fire dyr (± SD) (*

s

0,05). (C) repræsentant H 0,01) faldt, til omkring 10% af den, der induceres af AS1 /Mock3 celler (Figur 7C). Desuden var der en signifikant (*

s

0,01) stigning i overlevelsesraten for mus inokuleret med AS1 /Sic50 celler (51 ± 16 dage) sammenlignet med 35 ± 14 dage for mus podet med AS1 /Mock3 celler, hvilket indikerer, at NDRG1 knockdown forlænger overlevelsen (figur 7D).

(A) Makroskopiske billeder viser forstørret bughulen og metastatiske knuder ved AS1 /Mock3 og AS1 /Sic50. Pilespidser viser knuder. (B) Antal metastatiske knuder i mesenteriet var 51 ± 16 (AS1 /Mock3) og 35 ± 14 (AS1 /Sic50) (

s

= 0,21), men AS1 /Mock3 knude størrelse var 3- 4 gange større end AS1 /Sic50. Sammenligning (C) af omfanget af ascites mellem AS1 /Mock3 (3,9 ± 1,0 ml) og AS1 /Sic50 celler (0,5 ± 0,6 ml) efter ortotopisk implantation (n = 7) (*

s

0,01 ). (D) Overlevelse kurver viser, at overlevelsesraten i AS1 /Sic50 tumor-bærende mus markant var (*

s

0,01) længere end for AS1 /Mock3 tumor-bærende mus (n = 6). (E) Vores hypotetisk model, hvor NDRG1 overekspression fremmer metastaser herunder peritoneal formidling via ændring af EMT ved scirrhous gastriske kræftceller, eventuelt gennem ændring af Snail udtryk.

Diskussion

Vi har tidligere rapporterede, at NDRG1 er tæt korreleret med tumorangiogenese og ringe overlevelse i patienter med gastrisk cancer, hvilket antyder, at NDRG1 er en prædiktiv biomarkør for malign progression af gastrisk cancer [9]. Fra vores nuværende undersøgelse, vi observerede de følgende egenskaber ligger til grund for erhvervelsen af ​​en høj metastatisk potentiale i mavekræft: microarray, western blot og RT-PCR-analyser sammen afsløret opregulering af NDRG1 i de meget metastatiske cellelinier, 58As1 og 58As9, sammenlignet med deres lav metastatisk forældrenes modstykke, HSC-58; højere ekspression af vimentin, sneglen, og MMP-1, og lavere ekspression af E-cadherin og β-catenin var tydelige i de meget metastatiske cellelinier sammenlignet med deres parentale modpart; af generne nedreguleret i det stærkt metastatisk cellelinie, NDRG1 knockdown resulterede i opregulering af E-cadherin, og nedregulering af vimentin og snail, men næsten ingen virkning på ekspression af β-catenin; E-cadherin promotoraktivitet blev signifikant forøget af NDRG1 knockdown; NDRG1 knockdown også undertrykt peritoneal formidling og akkumulering af ascites, og invasion af meget metastatiske celler i omgivende normalt væv.

I den foreliggende undersøgelse, NDRG1 knockdown resulterede i suppression af metastase af højt metastatisk gastrisk cancerceller (fig 6 , 7), hvilket antyder, at NDRG1 kan være en metastase promotor-gen i stedet for en metastase suppressor gen i gastrisk cancer. Vores nuværende undersøgelse støtter kraftigt tanken om, at hvorvidt NDRG1 fremmer eller undertrykker den maligne progression af human cancer afhænger tumortyper og /eller differentiering status [11], [12]. Men det er uklart, hvorfor NDRG1 fungerer som tumorsuppressor eller promotor afhængigt tumortyper eller histologiske typer. Vores tidligere undersøgelse viste, at NDRG1 undertrykker tumorvækst og angiogenese i bugspytkirtlen kræft gennem NDRG1 drevet dæmpning af NF-KB-signalvejen [24], [25]. Nylig undersøgelse har rapporteret, at ekspressionen af ​​metastaser suppressor gen,

KAI1

gen, der er involveret i NDRG1 medieret metastase undertrykkelse af prostatakræft gennem ATF3-NF-KB-vejen [26]. Yderligere undersøgelse er nødvendig for at forstå, hvilke reguleringsmekanisme er særligt ansvar for NDRG1 drevet fremme af malign progression ved gastriske kræftceller.

EMT er en nyere højdepunkt, der kunne være tæt forbundet med kræft malign progression, herunder erhvervelse af højt metastatisk potentiale [15], [16]. I vores nuværende studie, NDRG1 knockdown forbedret ekspression af E-cadherin og undertrykt udtryk for vimentin både

in vitro

in vivo

. NDRG1 kan spille en central rolle i overgangen fra et polariseret epitelial fænotype til en yderst bevægelige mesenkymale fænotype. Delvis eller fuldstændig tab af E-cadherin er ofte observeret under progression mod malignitet i talrige tumorer, herunder gastrisk kræft [27], [28]. Oliveira et al. [29] rapporterede en tæt forbindelse mellem E-cadherin tab og høj metastatisk potentiale i mavekræft. Chan et al. [30] også rapporteret opløselig E-cadherin som biomarkør for forlænget overlevelse af gastrisk kræftpatienter. NDRG1 knockdown resulterede i relativt højere E-cadherinekspression i AS1 /Sic50 tumorer end i AS1 /Mock3 tumorer, hvilket tyder på, at NDRG1 specifikt kan styre EMT eventuelt gennem transskription faktor Snail af mavekræft celler (Figur 7E).

Wnt signalering har afgørende roller i den maligne progression og metastase ved lunge- og brystkræft celler [31], [32], og Wnt signalering inducerer også EMT som indebærer metastaserende progression af epitelial kræft [31], [33]. NDRG1 er kendt som en metastase suppressor gen i prostata og kolorektal cancer cell [11], [12]. Liu et al [18] har rapporteret, at NDRG1 undertrykker metastase gennem Wnt /β-catenin-signalvejen i prostatacancerceller. En relevant undersøgelse af Chen et al [19] har også vist, at NDRG1 modulerer TGF-β-induceret EMT gennem ændret ekspression af β-catenin og E-cadherin i kolorektal cancercelle. Vores nuværende undersøgelse viste nedsat ekspression af β-catenin i såvel højt metastatiske cellelinier sammenlignet med den parentale modstykke, HSC-58. Imidlertid analyser både Western blot og QRT-PCR viste ingen markant ændring i ekspressionsniveauerne af β-catenin og også β-catenin drevet promotoraktivitet mellem højt metastatiske 58As1 celler og dets to NDRG1 tavse cellelinier. Det synes mindre sandsynligt, at β-catenin spiller en central rolle i suppression af metastase af NDRG1 knockdown i stærkt metastatiske cancerceller.

På den anden side er GSK-3β også kendt for at spille en rolle i kontrollen af EMT [20], [21], og GSK-3β er et essentielt enzym for phosphoryleringen af ​​NDRG1, en fremragende substrat af GSK-3β [22], [23]. Ekspressionen af ​​p-GSK3p var relativt højere i de meget metastatiske cellelinier end deres parentale cellelinje (figur 2B). Behandling med en potent inhibitor af GSK-3β resulterede i en undertrykt ekspression p-NDRG1, ledsaget af opregulering af E-cadherin og β-catenin (fig 5D). Men der var næsten ingen forskel i ekspression af GSK-3β og p-GSK-3β af NDRG1 knockdown i de meget metastatiske celler (figur 4B), hvilket antyder, at GSK-3β ikke kan spille en vigtig rolle i induktionen af ​​EMT gennem NDRG1 i gastriske cancerceller.

sneglen er en repræsentativ transskriptionsfaktor, som regulerer ekspressionen af ​​E-cadherin [20]. Af forskellige regulatoriske faktorer, der transkriptionelt kontrol E-cadherin, blev ekspression af Snail specifikt moduleret af NDRG1 i gastriske cancercellelinier anvendt i denne undersøgelse. Snail knockdown induceret opregulering af E-cadherin (figur 5A), og eksogen tarnsfection af Snail cDNA undertrykte E-cadherin promotor-aktivitet (figur 5B).

I yderst metastatisk gastrisk kræft cellelinjer, blev ekspressionen af ​​Snail opreguleret som Kernerne blev farvet med DAPI.