PLoS ONE: Forbedret miljøfremmede Metabolisme og nedsat følsomhed over for kræft i Gluten-Følsomme Makakker på Indførelse af en glutenfri kost

Abstrakt

Baggrund

En ikke-menneskelig primat (NHP) model af gluten følsomhed blev ansat til at studere gen forstyrrelser forbundet med kosten gluten ændringer i små tarm væv fra gluten-følsomme rhesus makakaber (

Macaca mulatta

).

Metode

Stadier af remission og tilbagefald blev udført i gluten-følsomme dyr ved administration af glutenfri (GFD) og gluten-holdige (GD) kost, som tidligere beskrevet. Pin-head mellemstore biopsier, opnået ikke-invasivt ved pædiatrisk endoskop fra duodenum mens det på GFD eller GD, blev anvendt til fremstilling af total RNA og gen profilering, ved hjælp af kommercielle rhesusmakakabe Microarray (Agilent Technologies), målretning ekspression af over 20.000 gener .

vigtigste resultater

sammenlignet med normale raske kontrolpersoner viste gluten-følsomme makakaber differential gen udtryk fremkaldt af GD. Mens observerede gen forstyrrelser blev klassificeret i en af ​​12 overlappende kategorier – kræft, metabolisme, funktion fordøjelseskanalen, immunrespons, cellevækst, signal transduktion, autoimmunitet afgiftning af miljøfremmede stoffer, apoptose, actin-collagen deposition, neuronale og ukendt funktion – denne undersøgelse fokuseret på kræft-relateret gen netværk såsom cytochrom P450 familie (afgiftning funktion) og actin-collagen-matrixmetalloproteinaser (MMP) gener.

konklusioner /betydning

Et tab af afgiftning funktion parallel med nødvendigheden af ​​at metabolisere kræftfremkaldende stoffer blev afsløret i gluten-følsomme dyr, mens på GD. En stigning i cancer-fremmende faktorer og en samtidig reduktion i cancer-forebyggelse faktorer forbundet med ændret ekspression af actin-collagen-MMP-genet netværk blev noteret. Desuden viste gluten-følsomme makakaber reduceret antal differentielt udtrykte gener, herunder cancer-associerede dem efter tilbagetrækning af kosten gluten. Tilsammen indikerer disse resultater potentielt udvidet nytte af gluten-følsomme rhesus makakaber i kræftforskning

Henvisning:. Sestak K, Conroy L, Aye PP, Mehra S, Doxiadis GG, Kaushal D (2011) Forbedret miljøfremmede Metabolisme og reduceret følsomhed over for kræft i Gluten-Følsomme Makakker upon Indførelse af en glutenfri kost. PLoS ONE 6 (4): e18648. doi: 10,1371 /journal.pone.0018648

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: 8. oktober, 2010; Accepteret: 11. marts 2011; Udgivet: 12 April, 2011

Copyright: © 2011 Sestak et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver R01DK076653 og 3R01DK076653 til KS og tilskud bunden drift af TNPRC RR000164. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glutenfølsomhed er en af ​​de fremtrædende træk ved cøliaki (CD), som er en autoimmun sygdom karakteriseret ved beskadiget foring af tyndtarmen som følge af reaktioner udløst af kosten gluten, et protein kompleks findes i hvede, rug, og byg [2]. En række histopatologiske manifestationer blev beskrevet i cøliakipatienter, og også i makakaber med gluten-sensitiv enteropati – en nyligt etableret ikke-human primat model af glutenfølsomhed [1], [3], [4], [5]. Hos mennesker Marsh [6], [7] divideret CD-associerede læsioner, baseret på sværhedsgraden, i fem kategorier. I makakaber blev læsioner beskrevet at være mellem mild intraepitel og lamina propria lymfocytose op til næsten fuldstændig udfladning og fusion af de små intestinale villi, med kronisk inflammation af den tilsvarende lamina propria [1], [5]. Glutensensitiv makak-modellen blev for nylig anvendt til at demonstrere de funktionelle ændringer i tarmpermeabilitet i den fase, epitelial forfald forårsaget af kosten gluten. Det blev konstateret, at på tidspunktet for serviceområder, en gluten-afledt peptid, såsom alfa-2-gliadin 33-mer er stand til at trænge under tarmepitelet i lamina propria, i overensstemmelse med resultater beskrevet i celiacs [3], [4], [5], [8]. Forstyrret mønster af intestinale tætte forbindelser og deposition af autoantistoffer rettet mod det enzym, der spiller en afgørende rolle i gluten fordøjelse dvs væv tranglutaminase 2 (TG2) i duodenum af makakaber med gluten enteropati, men ikke hos raske kontroller blev også bemærket [5].

på trods af omfattende undersøgelse af kliniske, immunologiske og histopatologiske egenskaber af CD, relativt lidt om effekten af ​​gluten følsomhed på andre sygdomme og deres potentielle forhold. Manglende viden fremgår, når de forsøger at studere de faktorer, der udløser overgang ene fase af sygdommen til en anden. Underliggende genetisk disposition, der først begyndte at blive belyst i gluten-følsomme makakaber er et andet vigtigt element i denne komplekse sygdom. På grund af et stigende antal kliniske rapporter, der tyder association mellem CD og tarm T-celle lymfomer, adenokarcinomer, diabetes type 1, autisme eller Downs syndrom [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],14], [15], [16], er det vigtigt at fastslå, om der kan også demonstreres observationer fra ovennævnte undersøgelser på det molekylære niveau. En sådan forskning bør give romanen fører til eksisterende behandlinger af ikke kun CD, men også førnævnte sygdomme. For at undersøge det udvalgte gen netværk i gluten-sensitiv primat vært, blev et kvantitativt microarray genteknologi og rhesus makak-modellen anvendes. Det blev antaget, at forstyrrelser i cancerassocierede gen net vil ses i gluten-sensitive dyr på tidspunktet for tilbagefald versus fase af remission. Minimal eller ingen forstyrrelser fremkaldt af kosten gluten ændringer var forventet i normal sund kontrol og i gluten-følsomme dyr på fase af remission.The primære mål var at vise, at gluten-følsomme primater reagerer på kosten gluten ændringer med op /ned-regulering af udvalgte gener og at sådanne perturbationer kan knyttes til en forøget risiko for andre sygdomme, såsom cancer. Sekundært mål var at bestemme, om tilbagetrækning af kosten gluten er tilstrækkelig til at vende disse ændringer.

Resultater

Øget plasma AGA og TG2 antistoffer i gluten-følsomme makakaber

Tilbagetrækning af kosten gluten løser i gluten-følsomme makakaber kliniske, histopatologiske samt immunologiske manifestationer af sygdommen, herunder nedgangen i AGA og TG2 antistoffer i plasma [1], [3]. I humane patienter, er kombineret tilstedeværelse af AGA og TG2 antistoffer anses for at være en meget nøjagtig forudsigelse af CD [2]. I denne undersøgelse blev overgang fra GFD til GD ledsaget af signifikant (p 0,05) forøgelse af både AGA og TG2 antistoffer i gluten-sensitiv makakaber (Figur 1). I overensstemmelse med disse og tidligere rapporter, er GFD periode med baseline niveauer af AGA og TG2 antistoffer angivet her som den fase af immunologiske remission, mens GD periode med betydelig stigning i AGA og TG2 antistoffer, er angivet som den fase af immunologiske tilbagefald. I normale raske kontrolpersoner makakaber, AGA og TG2 antistoffer forblev på baseline niveau uanset kosten gluten indtag.

Plasma antistofresponser at gliadin og TG2 blev målt i fire gluten-sensitiv (FH45, FB97, DJ68 og DE87) og fire normale raske kontrolpersoner (HK31, HT24, HD60 og IA24) rhesus makakaber på tidspunktet for eftergivelse og /eller tilbagefald. Graf viser fold-stigninger på antistoffer over baseline efter indføring af kosten gluten. Signifikant (p 0,05). Stigninger er angivet (*)

Differential genekspression i duodenum af gluten-følsomme makakaber

I sammenligning med normale raske kontrolpersoner viste gluten-følsomme makakaber et øget antal differentielt udtrykte gener i den fase, tilbagefald, mens på GD (figur 2). Selv om alle tre testede gluten-følsomme dyr viste et lavere antal differentielt udtrykte gener i den fase af remission, FH45 makak var den eneste, der normaliserede sit genekspression under GFD behandling til en baseline niveau – sammenlignes med en sund kontrol HK31 (figur 2). Dette var ikke helt uventet, eftersom nødvendige tid til at udføre remission kan være meget forskellige mellem forskellige individer, som det er påvirket af mange fysiologiske og genetiske faktorer [17], [18].

En kommerciel rhesus-specifik gen Grupperingen blev anvendt til at måle differentiel genekspression i otte duodenum prøver fra fire udvalgte studier makakaber: normale raske kontrolpersoner (HK31), andFH45, FB97 og DJ68 gluten følsomme makakaber ved de faser af remission og /eller tilbagefald. Absolutte antal forstyrrede gener ud af ~20,000 testet pr hver prøve er vist.

Kategorier af differentielt udtrykte gener

Alle gener med differentiel niveau af ekspression blev yderligere inddelt i 12 overlappende kategorier : 1- cancer, 2- metabolisme, 3- fordøjelseskanalen funktion, 4- immunrespons, 5- cellevækst, 6- signaltransduktion, 7- autoimmunitet, allergi, 8- afgiftning af xenobiotika, 9- apoptose, 10- ikke kendt funktion, 11- actin-collagen-MMP-gen netværk, og 12- neuronal funktion. Tre kategorier underlagt nærmere undersøgelse inkluderet: kræft, afgiftning af miljøfremmede stoffer og actin-collagen-MMP gen netværk. Disse kategorier blev udvalgt på grundlag af deres direkte eller indirekte involvering i kræft progression eller undertrykkelse (figur 3 og 4). Da kræft (kategori 1) gener var repræsenteret ved to forskellige underkategorier dvs. kræft-fremme og kræft-undertrykke og begge disse underkategorier indeholdt op- og ned-regulerede gener, kategori 1 endte med mindre distinkt mønster af differentieret udtryk end kategori 8 eller 11 (figur 4 og 5). Kategori 8 og 11 viste forudsigeligt mønster af differentieret udtryk i alle tre gluten-følsomme makakaber: Mens gener er ansvarlige for afgiftning af miljøfremmede stoffer var overvejende nedreguleret under tilbagefald (figur 3 og 4D, E, F), gener af actin-collagen-MMP netværk blev opreguleret (figur 3 og 4A, B, C).

Valgte tre kategorier af forstyrrede gener i duodenum af FH45 gluten-sensitiv makak (normaliseret mod normal, sund kontrol makak HK31), mens på gluten kost . Forskellige farvenuancer svarer til fire kategorier af perturberede gener. Lignende mønstre af gen-forstyrrelse blev også identificeret i FB97 og DJ68 gluten-følsomme makakaber (ikke vist)

1 -. Kræft, 2 – metabolisme, 3 – fordøjelseskanalen funktion, 4 – immunrespons, 5 – cellevækst, 6 – signaltransduktion, 7 – autoimmunitet, allergi, 8 – afgiftning af miljøfremmede stoffer, 9 – apoptose, 10 – ikke kendt funktion, 11 – actin-collagen-MMP-netværk, og 12 – neuronal funktion. Relative fordelinger af opreguleret gen kategorier er vist i panel A (FH45), B (FB97) og C (DJ68) mens nedregulerede gener er vist i panelerne D (FH45), E (FB97) og F (DJ68).

Dietary gluten tilbagetrækning virkninger relative fordeling af forstyrret gen kategorier i gluten-følsomme makakaber. I tre udvalgte kategorier [1 (kræft), 8 (afgiftning af miljøfremmede stoffer), og 11 (actin-collagen-MMP-netværk)], omfattede disse ændringer faldt antallet af “kræft-fremme” begivenheder såsom nedregulering af kategori 8 gener og opregulering af kategori 11 gener. Data genereret med FB97 og DJ68 makakaber i den fase af remission og tilbagefald vises. FH45 makak havde kun få gen-forstyrrelser i den fase, remission, mens på glutenfri diæt, er således relative gen tæller ikke vist for dette dyr.

Konsekvenserne af kosten gluten tilbagetrækning på differential genekspression

Selv om der var ligheder i genekspression af tre gluten-sensitiv makakaber under tilbagefald trin (figur 4), var der også forskelle i remission fase (figur 5). Den mest sandsynlige forklaring på forskellene er, at FB97 og DJ68 makakaber ‘differential gen udtryk på trods at alle tre gluten-følsomme dyr var i immunologiske remission på tidspunktet for biopsi procedure, ikke var endnu ved baseline, på trods af at have tilbragt 10 uger på GFD. Dette var mere tydelig i tilfælde af DJ68 end i FB97, mens fuldstændig baseline og ingen perturbationer blev set i FH45 makak under remission fase, mens på GFD (figur 2). Forudsigeligt, indførelse af kosten gluten resulterede i øget forstyrrede gener i tre testede gluten-følsomme dyr med DJ68 er de højeste (figur 2 og 5).

cytochrom P450 familien gen netværk er nedreguleret i gluten-følsomme makakaber ved indføring af kosten gluten

Ud fra observationer med cøliaki patienter, som viser signifikant nedregulering af CYP3A4-genet, et medlem af P450 familien, samt en øget forekomst af adenocarcinom og lymfom af tyndtarmen, det blev forudsagt, at gluten-sensitiv makakaber ville vise nedregulering af P450 familien gener, mens på GD. De forventedes at have relativt normal ekspression af disse gener, mens på GFD. Differentiel ekspression af P450-gen netværk i alle tre gluten-sensitive makakaber efterfulgt ovenfor forudsigelse. P450-genet netværk af FH45 dyr er vist for at illustrere (figur 6): Seks ud af syv forstyrrede gener i P450 nettet blev nedreguleret i den fase af tilbagefald i modsætning til kun to i den fase af remission. Den omstændighed, at en (CYP4B1) genet var opreguleret i FH45 i den fase tilbagefald illustrerer det komplekse forhold mellem faktorer forbundet med gluten følsomhed. Da CYP4B1 metabolizes kræftfremkaldende stoffer, dens funktion er især vigtigt i tilstedeværelsen af ​​flere kræft-fremme faktorer.

Indførelse af kosten gluten (tilbagefald etape) nedregulerer flere af generne i P450 netværk, mens kosten gluten tilbagetrækning (remission etape) normaliserer sit udtryk i retning af baseline-niveau: Expression i FH45 gluten-følsomme makak viser 5 ud af 6 urolig gener bliver mere nedreguleret under tilbagefald tidspunkt end under remission fase. Rød betyder opregulering af et gen, mens grønne betegner nedregulering, med standard ekspressionsniveau bestemt af HK31 normale raske kontrolpersoner makak. Intensiteten af ​​farve repræsenterer størrelsen af ​​ændring i ekspression. De fuldt optrukne linjer betyder, at genets proteinprodukt direkte påvirker målet gen s protein niveauer, mens stiplede linjer betyder, at genets proteinprodukt indirekte ændrer målet gen s protein niveauer gennem inddragelse af en mellemliggende gen.

actin-collagen-MMP-genet netværk er differentielt udtrykt i gluten-sensitive makakaber efter indføring af kosten gluten

Dette netværk regulerer ekspressionen af ​​actin og collagen, der er vigtige for sårhelingsprocessen og arvævsdannelse den. En opregulering af disse gener var forventet som en mulig udligningsmekanisme at reparere vævsskader forårsaget af kronisk inflammatorisk proces og /eller autoimmun reaktion i tyndtarmen. Selvom FH45 og DJ68 gluten-sensitive dyr viste flere af disse gener bliver opreguleret på stadiet for tilbagefald (ikke vist), forskellen med den fase af remission var ikke så fremtrædende som i tilfælde af FB97 næsten hvor hele netværket blev rystet i den fase tilbagefald (figur 7). Mens actin og collagen differential genekspression var i overensstemmelse med forventet opregulering og /eller arvævsdannelse, de to centrale matrix metalloproteinaser MMP3 og MMP9 blev nedreguleret, modsiger ovenstående “arvævsdannelse” hypotese.

indførelse af kosten gluten (tilbagefald etape) opregulerer fleste af actin og collagen gener mens MMP3 og MMP9 er nedreguleret. Data genereret med FB97 gluten-følsomme makak i den fase af remission og tilbagefald vises. Rød betyder opregulering af et gen, mens grønne betegner nedregulering, med standard ekspressionsniveau bestemt af HK31 normale raske kontrolpersoner makak. Intensiteten af ​​farve repræsenterer størrelsen af ​​ændring i ekspression. De fuldt optrukne linjer betyder, at genets proteinprodukt direkte påvirker målgenet er protein niveauer, hvor som stiplede linier betyder, at genets proteinprodukt indirekte ændrer målet gen s protein niveauer gennem inddragelse af en mellemliggende gen.

Adskillige sygdomsassocierede gen grupper udtrykkes forskelligt i gluten-sensitive makakaber

Ud over 12 kategorier af forstyrrede generne identificeret i denne undersøgelse i gluten-sensitive makakaber (Figur 4), var det af interesse at identificere gener der ville forbinde denne tilstand med andre sygdomme end kræft, som i stigende grad rapporteret i kliniske undersøgelser med celiacs [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . Alle tre testede gluten-sensitive makakaber viste differentiel ekspression af flere gener, der kunne være forbundet med ikke kun CD men også med autisme, fødevareallergi, Downs Syndrom, Alzheimer Disease, rheumatoid arthritis, Parkinsons sygdom og muskeldystrofi (figur 8). Selvom betydningen af ​​disse resultater skal undersøges yderligere, det giver potentielt roman retning for fremtidig forskning om udviklingen af ​​ikke-menneskelige primater modeller for disse sygdomme.

Valgte kategorier (a. Cøliaki, b. Generelle gluten følsomhed eller inflammation og c. andre sygdomme) af opreguleret gener i duodenum af DJ68 og FB97 gluten-følsomme makakaber (normaliseret mod normal, sund kontrol makak HK31), mens på gluten-holdige kost. Forskellige farvenuancer svarer til forskellige kategorier af perturberede gener.

aTGM2 = vævstransglutaminase 2 fungerer som cøliaki autoantigen;

bIL17B = IL-17 cytokin rapporteret til at blive produceret i cøliakiramte, men ikke i andre gluten-følsomme patienter;

cMICB = NKG2D ligand foreslog at mægle omdannelsen af ​​TCR-afhængige CD8 + CTL’erne til TCR-uafhængig (NK-lignende) effektor IELs i cøliaki patienter;

dIFNg = interferon gamma er produceret af T-celler og fremmer gluten peptid flux hen tarmepitelet;

eITGAE dvs. CD103-antigen blev foreslået at mægle cøliaki-specifikke autoimmune respons i tyndtarmen.

Mamu II

sammensætningen af ​​gluten-følsomme makakaber

Selv om alle fire gluten-følsomme makakaber tildelt til denne undersøgelse havde antistoffer under tilbagefald etape mod ikke blot gliadin men også TG2 (autoantigen), deres

Mamu II Hotel (

DQA1

,

DQB1

og

DRB

) allel sammensætning viste sig at være ikke ensartet (tabel 1). Dette muligvis indikerer, at gluten følsomhed er i rhesus makakaber enten a) i forbindelse med mere end en

MHC II

allel på grund af en højere diversitet og et bredere repertoire af

Mamu II

end

HLA II

[19], [20] eller b) gluten-følsomhed er i makakaber ikke er genetisk forbundne med

Mamu II

. Yderligere undersøgelser er i øjeblikket i gang med et større antal gluten-følsomme makakaber at belyse dette spørgsmål.

Diskussion

En gluten-følsomme rhesus makak-model blev brugt til at studere forskellen genekspressioner induceret af GD. Desuden blev den potentielle sammenhæng mellem glutenfølsomhed og kræft undersøgt. Selv om der er stigende antal kliniske rapporter tyder sådant forhold i cøliaki patienter, undersøgelser, der fokuserer på molekylære mekanismer der forbinder disse betingelser er fraværende. Som beskrevet i tidligere rapporter, at administration af GFD eller GD gluten-følsomme rhesus makakaber er forbundet med fravær eller tilstedeværelse af serie af den kliniske, histopatologiske, metaboliske og immunologiske symptomer, samlet benævnt stadier af remission eller tilbagefald henholdsvis [1] [3], [4], [5]. I overensstemmelse med vores seneste undersøgelse, gluten-følsomme og kontrol makakaber blev udvalgt fra den større kohorte af 500 kandidat dyr baseret på tilstedeværelsen af ​​plasma AGA og TG2 antistoffer [5]. Da kombinerede tilstedeværelse af AGA og TG2 antistoffer anses i humane patienter som yderst pålidelig prædiktor for CD [2], [21], er det vigtigt at understrege, at alle fire gluten-sensitive makakaber i dette studie havde både AGA og TG2 antistoffer. I modsætning til vores tidligere arbejde [1], [5], histopatologiske tegn blev ikke brugt som prædiktorer for gluten følsomhed, da slimhinden skaden ikke var genstand for denne undersøgelse.

Da der er en voksende tyder forening mellem CD, tarm kræft og andre sygdomme, tog vi fordel af rhesus makak model af gluten følsomhed at belyse A), hvis der kan påvises en sådan sammenhæng på genekspression niveau, og B), hvis ændringer i kosten gluten indtag indflydelse valgt genekspression. Mod dette formål har vi primært brugt et rhesus-specifik microarray kunne måle ekspressionen af ​​over 20.000 gener i en vævsprøve. Differentielt forstyrrede gener blev klassificeret i 12 overlappende kategorier, herunder tre hovedkategorier af interesse: kræft, afgiftning funktion, og actin-collagen-MMP gener. Hertil kommer, differentielt udtrykte gener, som tidligere blev rapporteret at være forbundet med forskellige andre sygdomme blev også identificeret (figur 8).

intestinale cytochrom P450 gener, såsom CYP3A4 deltage i metabolisme af xenobiotika at reducere deres skadelige virkninger. Imidlertid er ekspressionen af ​​CYP3A4 i cøliakipatienter, reduceres betydeligt sammenlignet med raske voksne [22], [23]. Desuden viser cd patienter øget forekomst af intestinal T-celle lymfom og adenocarcinom [17], [18]. Derfor kan de reducerede niveauer af cytochrom P450 øge biotilgængeligheden af ​​miljøfremmede stoffer i celiacs, hvilket øger forekomsten af ​​xenobiotiske-induceret cancer progression. For at afgøre, om ovennævnte hypotese kan overvejes i studier med gluten-følsomme rhesus makakaber, blev ekspressionen af ​​cytochrom P450-gener sammen med andre “cancer-associerede” gener målt i duodenum biopsier opnået ved faser af remission og tilbagefald. Det blev forudsagt, at mangel på cytochrom P450 genekspression vendes ved tilbagetrækning af kosten gluten – ved at placere gluten-følsomme makakaber på GFD. Resultaterne af denne undersøgelse viser klart, at nedregulering af cytochrom P450-gen net forekommer i gluten-sensitive makakaber mens på GD. Det blev også observeret, at en sådan nedregulering lindres ved GFD behandling selvom fuldstændig tilbageførsel til et niveau sammenligneligt med normal sund person blev gennemført kun i én ud af tre gluten-følsomme makakaber testet af microarrays. Det er sandsynligt fra genererede resultater, hvis gluten-følsomme makakaber ville blive holdt på GFD i en længere periode, resterende to dyr ville fortsætte vende cytochrom P450 nedregulering. Cytochrom P450-gen netværk nedregulering blev parallel med samlet opregulering af actin-collagen-MMP-gen-netværk. I overensstemmelse med vores resultater, blev det rapporteret, at opregulering af actin og collagen med samtidig nedregulering af MMP3 og MMP9 opstår som foranstaltning til at forhindre kræft dannelse i eksperimentelt behandlede mus [24]. Da dette blev observeret i FB97 makak under tilbagefald, er det sandsynligt, at gen-forstyrrelser i actin-collagen-MMP netværk er tegn på en beskyttende medfødte respons mod cancer invasion i det mindste nogle af de gluten-sensitive primater (figur 3 og 7).

på trods af de forudsigelige mønstre af differential genekspression i førnævnte kategori 8 (afgiftning) og 11 (actin-collagen-MMP) gener, kategori 1 (kræft) ikke følger en sådan mønster, på grund af høj kompleksitet gen interaktioner i denne kategori, med flere kræft-fremme og -suppressing gener bliver samtidig påvirket af kosten gluten ændringer. Taget sammen med kategori 8 og 11 genekspression resultater Men vores resultater viser, at tilbagefald etape af gluten følsomhed i rhesus makakaber er befordrende for tumorigenese, og det kan delvis vendes ved tilbagetrækning af kosten gluten.

Mange spørgsmål er stadig . Nogle af disse er på grund af vores ufuldstændige viden om rhesus makakaber klasse II alleler er forbundet med gluten følsomhed på en måde analog med menneskelige cøliaki patienter dvs.

DQ2 /8

alleler [2], [18], [25] , [26]. Vores nuværende model kan kun benævnt “gluten følsomhed” model, holde sig for øje, at der er mindst to kategorier af gluten følsomhed i primater: første er

Mamu II

-afhængig (CD-lignende), mens anden er

Mamu II

-uafhængig (fødevareallergi-lignende). Vores resultater involverer genetisk analyse af 50 + makakaber med og uden glutenfølsomhed indikere, at en

Mamu II

associeret prædisposition for denne tilstand eksisterer i rhesusaber [Sestak et al., Ikke publiceret]. Relativt høj variation i differential gen fordeling i denne undersøgelse kan således forklares ved forskellige

Mamu II

baggrunde i udvalgte gluten-følsomme dyr (tabel 1). For at forbedre den rhesus model af gluten følsomhed og for at gøre det mere relevant som en CD-model, udvælgelse af gluten-sensitive makakaber skal udføres i fremtiden også i forbindelse med

MamuII

pre-screening . Vores resultater indikerer, at CD, fødevareallergi og andre sygdomstilstand-associerede gener herunder kræftrelaterede dem der er differentielt udtrykt i gluten-sensitive makakaber. Endelig resultater rapporteret her viser, at ovennævnte gen perturbationer lindres og endda ophævet ved kosten gluten tilbagetrækning. Disse resultater kan bruges som en platform for fremtidige undersøgelser sigter mod belysning af forholdet mellem CD og kræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Godkendelse for alle veterinære procedurer i denne undersøgelse var blevet opnået fra Tulane University Animal Care og brug Udvalg (protokol # 3508), Animal Welfare Assurance A-4499-01. Dyr i dette projekt var under fuld pleje af dyrlæger fra Tulane National Primate Research Center i overensstemmelse med de standarder, der indgår i vejledningen til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH) 78-23 (revideret 1996). Alle veterinære procedurer blev udført kun med sederede dyr. Dyrevelfærd og skridt blev taget til forbedre lidelser i overensstemmelse med anbefalingerne i Weatherall rapporten.

Dyr og kostvaner

Fire gluten-sensitiv (FH45, DJ68, DE87 og FB97) og fire normal , sund kontrol (HK31, HT24, HD60 og IA24) rhesus makakaber (

Macaca mulatta

) af indiske underarter, 2-9 år, simian retrovirus-fri, af begge køn blev anvendt i denne undersøgelse. Da forekomsten af ​​glutenfølsomhed i makakaber svarer til den af ​​mennesker blev gluten-sensitive dyr valgt fra større gruppe på 500 kandidater, som beskrevet detaljeret andetsteds [5]. Gluten-følsomme makakaber blev skelnes fra normale, sunde dem ved tilstedeværelsen af ​​både anti-gliadin (AGA) og anti-vævstransglutaminase 2 (TG2) serum antistoffer. Alle gluten-sensitive dyr blev holdt i mindst 10 uger på glutenfri diæt (GFD), efterfulgt af 10 ugers regelmæssig, gluten-holdige chow (GD) (PMI Nutrition Intl., St. Louis, MO), for at opnå den etape af remission og tilbagefald. Overgangen af ​​GFD til GD var præget af signifikant (p 0,05) stigning af AGA og anti-TG2 serum antistoffer over baseline (figur 1). I tilfælde af normale raske kontroldyr, antistofniveauer var altid baseline uanset kosten gluten indtag.

tyndtarmen og prøve perifert blodtapning

To ml perifert blod blev opsamlet på tidspunktet for remission og /eller tilbagefald fra alle dyr som beskrevet [5]. Desuden blev prøve af distale duodenum (fem pin-head mellemstore biopsier) indsamlet på tidspunktet for remission og tilbagefald fra tre gluten-sensitive dyr med højeste niveau af antistof stigning (figur 1) ved pædiatrisk endoskop som beskrevet [5]. I tilfælde af raske kontrol dyr (HK31) blev endoskopi procedure også udført to gange sideløbende med procedurerne gjort i gluten-følsomme dyr på trods at ingen tilbagefald fase præget af betydelig antistof stigning var til stede i HK31 i forbindelse med indførelsen af ​​kosten gluten (figur 1 ). Alle indsamlede biopsiprøver blev straks anbragt i fem ml RNA-senere-opløsning (Qiagen, Valencia, CA) for at bevare RNA. Blod blev behandlet for at ekstrahere plasma, som blev opbevaret ved -20 ° C og testet ved indirekte ELISA for tilstedeværelsen af ​​anti-gliadin og anti-TG2 antistoffer [1].

RNA-isolering, cDNA-syntese

Total RNA blev ekstraheret fra tarmbiopsier bruger Qiagen’sRNeasy plus mikro kit, efter anvisninger producenten. En pin-head-størrelse biopsi ud af fem opsamlet var tilstrækkelig til at isolere den nødvendige mængde RNA ved anvendelse af RNeasy kit.NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE) blev anvendt til måling RNA koncentration og renhed. Totalt RNA blev anvendt til at udføre cDNA-syntese og cyaninfarvestof mærkning som tidligere beskrevet [27], under anvendelse af Agilent Low RNA Input Linear Amplification-Labeling Kit (LRILAK). Det mærkede cDNA blev anvendt til at udføre hybridisering natten til Agilents rhesus makak hele genomet microarray, ifølge producentens anvisninger [28].

Microarray procedure og genekspression

Et kommercielt tilgængeligt oligonukleotid rhesus makak hele genom Microarray omfatter ~20,000 målgener (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) blev anvendt. Arrays blev trykt ved hjælp af 4 × 44 k format (Agilent Technologies). Objektglassene blev vasket i henhold til producentens anvisninger og derefter afbildes under anvendelse af GenePix Pro 6.1 software. Individuelle målinger blev registreret i mindst to kopier. Den resulterende.

gal

filer blev analyseret af SpotfireDecisionSite, microarray analyse modul (TIBCO-Spotfire, Boston MA) som tidligere beskrevet [28]. Efter fjernelse af upålidelige pletter, blev data normaliseret ved hjælp af et lokalt Vægtet Scatterplot Smoothing (LOWESS) algoritme og de resulterende forhold mellem ændring i gen-ekspression fanget på en logaritme til to skala [28]. Hvert sæt af differentielt udtrykte gener indeholdt både “opreguleret” og “nedreguleret” dem.