PLoS ONE: typespecifikke cellelinje Modeller til typespecifikke Kræft i æggestokkene Research

Abstrakt

Baggrund

ovariecarcinomer består af mindst fem forskellige sygdomme: high-grade serøs, lav- kvalitet serøs, klar celle, endometrioide, og mucinøs. Biomarkør og molekylær karakterisering kan repræsentere en mere biologisk relevant grundlag for gruppering og behandling af denne familie af tumorer, snarere end oprindelsesstedet. Molekylære egenskaber er blevet den nye standard for klinisk patologi, men udvikling af skræddersyede typespecifikke behandlinger hæmmes af en fejl i grundforskning at anerkende, at modelsystemer anvendes til at studere disse sygdomme skal også stratificeret. Uafhængige modelsystemer gøre tilbud værdi for studiet af biokemiske processer, men specifik cellulær kontekst skal anvendes til at vurdere relevante terapeutiske strategier.

Metoder

Vi har fokuseret på identifikation af klare celle karcinom cellelinje modeller. Et panel på 32 “ovariecancer” cellelinier er blevet klassificeret i histotypes anvendelse af en kombination af mutation profiler, IHC mutation-surrogater og en valideret immunhistokemisk model. Alle cellelinjer var identitet kontrolleres ved hjælp af STR-analyse.

Resultater

Mange beskrevne æggestokkene klare cellelinjer har karakteristiske mutationer (herunder

ARID1A

PIK3CA

) og en samlet molekylær /immuno-profil er typisk for primære tumorer. Mutationer i

TP53

var til stede i størstedelen af ​​high-grade serøse cellelinier. Avanceret genomisk analyse af bona-fide klar celle karcinom cellelinjer understøtter også kopi nummer ændrer sig i typiske biomarkører såsom ved

MET

og

HNF1B

og en mangel på enhver tilbagevendende udtryk re-arrangementer.

konklusioner: Som med primære tumorer i æggestokkene, mutation status cancer gener som

ARID1A

TP53

og en generel immuno-profil tjene godt for oprettelse histotype af æggestokkene kræftcelle Vi beskriver specifikke biomarkører og molekylære funktioner til at re-klassificere generiske “ovariecancer” cellelinjer i typespecifikke kategorier. Vores data understøtter brugen af ​​prototype klar cellelinjer, såsom TOV21G og JHOC-5, og spørgsmål brugen af ​​SKOV3 og A2780 som modeller af high-grade serøs karcinom

Henvisning:. Anglesio MS, Wiegand KC, Melnyk N, Chow C, Salamanca C, Prentice LM et al. (2013) typespecifikke cellelinje modeller for Type-Specific æggestokkene Cancer Research. PLoS ONE 8 (9): e72162. doi: 10,1371 /journal.pone.0072162

Redaktør: Goli Samimi, Kinghorn Cancer Center, Garvan Institute of Medical Research, Australien

Modtaget: 19. april, 2013; Accepteret: 7 juli 2013; Udgivet: 4. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Anglesio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støtte til dette projekt blev givet til æggestokkene Cancer Research Team of BC (OVCARE; https://www.ovcare.ca) gennem BC Cancer Foundation, The VGH og UBC Hospitaler Foundation og den canadiske Institutes for Health Research (CIHR) Emerging Team Grant : Personlig siRNA-Based nanomedicin (FRN: 111.627). Funders havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

kræft i æggestokkene er et bredt sæt af sygdomme, og blandt de mest klinisk signifikante, epiteliale ovariecancer (EOC), findes mindst fem forskellige enheder [1] – [9]. På en bred plan, udtrykkene type I og type II EOCs påføres ofte, hvor high-grade serøse carcinomer (HGSCs) er type II og alle andre histologier er af type I cancere [8]. Ganske vist også i type I, eksisterer særskilte enheder, nemlig lav kvalitet serøst karcinom (LGSC), endometrioide carcinom (ENOCa), clear cell carcinoma (CCC) og mucinøs carcinoma (MUC). Der er signifikante data tyder på, at et flertal af HGSC stammer fra æggelederen epitel [1], [10] – [13], mens lav kvalitet serøse tumorer generelt stadig menes at opstå fra æggestokkene overfladeepitelet – selvom dette forhold er at være spørgsmålstegn [7], [14]. ENOCa og CCC tumorer forekommer i en baggrund af endometriose og kunne udgøre et spektrum af fordrevne, maligne endometrium [15] -. Endelig mucinøse tumorer er yderst sjældne, og deres sande oprindelse er vanskeligt at fastslå med undergrupper af særskilte histologi. Deres lighed med andre mucinøse epitelial maligniteter, især gastrisk kræft, har føjet til forvirringen af ​​deres oprindelse [3], [21] – [23]

Klinisk svar og epidemiologiske forskelle ses også mellem histotypes.. High-grade serøse kræftformer viser de bedste indledende responsrater til den nuværende standard kemoterapi regime af platin og taxaner [24], [25]. Familiær

BRCA1 /BRCA2

mutationer også synes stort set begrænset til denne histologi [26] – [28]. Omvendt har de mindre histotypes tendens til at forekomme hos yngre patientgrupper og oftere til stede ved lavere stadie [29] – [31]. En liste over nogle af de mere særlige kendetegn mellem histotypes typer er givet i tabel 1.

Uanset oprindelse eller histologiske ligheder og forskelle, biomarkør og genomiske studier med succes er blevet anvendt til at skelne hver histotype og kan repræsentere en langt mere biologisk relevant grundlag for klassificering og efterfølgende behandling af EOCs. Selvom dette koncept er godt accepteret, og få trækkraft på at blive en ny klinisk standard, tvetydige cellelinje modeller foreviget gennem molekylær biologi bænk forskning hæmmer udviklingen af ​​skræddersyede typespecifikke behandlingsformer. Dem, der bruger bænk eksperiment modelsystemer må erkende, at, ligesom primære kræftformer, de anvendte modeller til at studere disse sygdomme skal også stratificeret. Selvom biokemiske undersøgelser kan generere nyttige oplysninger fra hjælp af en række uafhængige modelsystemer, sygdomsspecifikke undersøgelser har brug for at anvende cellulære kontekst. Langt størstedelen af ​​forskningen anvender funktionelle undersøgelser af “ovariecancer” cellelinier ikke på korrekt fastslå baggrunden af ​​deres modelsystemer. Resulterende konklusioner kan være vanskelige at fortolke og værdien af ​​potentielle terapeutiske mål kan være tvivlsomt, er den sande betydning for en bestemt sygdom.

cellelinie studier af ovariecancer er blevet alvorligt hæmmet på grund af manglen på ordentlig annotation af “æggestokkene” carcinoma cellelinier. Når i kultur, celler ikke længere har let identificerbare morfologiske træk at støtte i histologisk klassifikation. Derudover har menneskelige fejl, fejlmærkning og generiske træk ved “epitel-lignende” cellelinjer førte også til at blande ups af cellelinier og forurening, som har resulteret i un-fortolkelige data [32], [33]. I den post-genom æra, er biomarkører og genomiske funktioner til ovariecancer undertyper meget veletableret. Screening teknikker til at analysere biomarkører og verificere genomiske funktioner er også bredt tilgængelige. Her præsenterer vi et panel af biomarkører og molekylære funktioner på tværs 32 almindeligt anvendte og in-house afledte ovariecarcinom cellelinjer. Vores første mål var at etablere en bona-fide liste over CCC-cellelinjer for vores egen forskningsprogram, men vi foreslår oprettelse type specificitet for disse cellelinjer bør blev den nye standard i at planlægge og gennemføre eksperimenter omkring enhver undersøgelse af epitelial ovariecancer.

Metoder

Cell kultur

Cellerne blev opretholdt i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2. Se tabel S1 for en liste over cellelinjer, dyrkningsbetingelser og bidrager labs og repositories. Nogle cellelinjer blev afledt internt (mærket med “VOA #”) gennem løbende

in vitro

kultur af primær patient materiale opnået ved OVCARE Tumor bank. Alle patienter med væv deponeret i OVCARE tumor banken forudsat skriftligt samtykke til eksperimentelle undersøgelser, herunder sekventering, IHC karakterisering, og afledning af langsigtede cellelinjer fra vævsprøver. Den OVCARE tumor bank undersøgelse blev godkendt under University of British Columbia og British Columbia Cancer Agency Research Ethics Board H05-60119 protokol.

Alle cellelinjer blev udsat for identitet test hjælp STR genotype (AmpFlSTR Identifiler, Applied Biosystems) ved College of American patolog s (CAP) akkrediteret Center for Translationel og Anvendt Genomics (CTAG) ifølge producentens direktiver. Kun linjer med profiler matcher offentlig repository optegnelser, rapporterede STR [32], og /eller originale patient tumorer (i tilfælde af in-house afledte cellelinjer) blev bibeholdt til yderligere undersøgelse.

Immunohistokemi og Lommeregner af subtype Forudsigelse (COSP)

cellelinjer blev skrabet fra dyrkningsplader, vasket 2 × med PBS og pelleteret. Cellepellets blev resuspenderet i ~500 pi 10% Neutral pufret formalin (NBF) og fik lov til at fastsætte natten over. Cellerne blev pelleteret igen og resuspenderet i en Histo-gel (Thermo-Fisher) stik før indlejring i paraffin. A tissue microarray (TMA) blev konstrueret som tidligere beskrevet [4] under 3 × 2 mm kerner fra cellelinien stikpropper. Immunhistokemi (IHC) blev udført på 4 um snit på en Ventana Discovery XT-systemet som tidligere beskrevet [2], [34], se tabel S2 for nærmere oplysninger om anvendte antistoffer. Histotype forudsigelse blev gjort ved hjælp af lommeregneren af ​​subtype Forudsigelse (COSP) [2] i tumor bank mode. Tumor bank tilstand blev valgt på grund af karakteren af ​​de faste cellelinier og det kontrollerede fiksering periode svarende til tumoren bank proces hvor denne prædiktor blev trænet. Scoring kriterier for IHC blev gjort visuelt og fulgte de nøjagtige retningslinjer foreslået i den oprindelige COSP papir [2]. IHC for fejlparringsreparation (MMR) proteiner (tabel S5) blev udført som beskrevet i [35], et fuldstændigt fravær af farvning for en given MMR-protein resulterede i en score på 0 (negativ), og formodes at resultere i MMR-mangel.

mRNA-transkripter

RNA blev ekstraheret fra cellelinier hjælp Qiazol-miRNeasy (Qiagen) protokol og fra primære tumorer, 12 tilfældigt udvalgt fra hvert histotype, ved hjælp af miRNeasy FFPE (Qiagen). Alle RNA transcript niveauer blev målt ved hjælp af NanoString NCounter systemet [36] og data normaliseret med nSolver software v1.1 (NanoString Inc.) ved hjælp af endogene kontrol gener (

ACTB, SDHA, RPL19, POLR1B, PGK1

) som per producenter direktiver. I tilfælde af

TFF3

mRNA-niveauer vi overvejet nogen prøve med påviselige udskrifter at være positiv og erstattet en score på “1” i stedet for TFF3 IHC, når du bruger COSP. detektionsgrænsen (DT) til mRNA blev anset for at være den maksimale tælling fra spike-in negative kontrolprøver prober (på tværs af alle cellelinie prøver) plus 2 standardafvigelser. Statistiske tests blev beregnet ved hjælp af GraphPad Prism v6.0c software

Mutation Test og Genomisk analyser

Genomisk DNA blev ekstraheret ved hjælp af standardmetoder (Gentra Puregene kit, Qiagen).. Regioner, der omfatter mutationer af kendte signifikans (Cancer hotspots) var Sanger sekventeret under anvendelse af M13-mærkede primere. Sekventering af

ARID1A

blev gjort gennem en kombination af brugerdefineret hybrid-opsamling og transkriptom sekventering på en Illumina GAII næste generation sequencing (NGS) som beskrevet tidligere [16], [37]. Associated rå data er deponeret i NCBI Sequence Læs Arkiv under BioProjects PRJNA209481, PRJNA209482, og PRJNA209484. Alle bemærkede varianter blev enten verificeret af Sanger sekventering eller anses valideres, hvis registreret i Cancer Cell Linje Encyclopedia (CCLE) [38] og /eller COSMIC database [39]. Udtrykt re-ordninger blev forudsagt fra transkriptom sekventering data for CCC cellelinjer TOV21G, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, og RMG-2 ved hjælp afdramatisere [40] (Tabel S3).

Kopier nummer Analyse

DNA-kopi nummer blev udledt fra Affymetrix SNP 6,0 genom-dækkende mikroarrays. Arrays blev kørt som pr producenter direktiver og kopi nummer forholdet genereret fra en uparret reference. Påvisning af kopi nummer ændret regioner blev udført ved hjælp af en segmentering algoritme. Alle analyser og visualisering blev henrettet med Partek Genomics Suite 6.6, rå data er tilgængelig fra NCBI GEO [tiltrædelse GSE48351].

Resultater

Histotype ved COSP i æggestokkene kræftcellelinjer

kræft i æggestokkene cellelinjer dyrket i kultur ikke udviser de histologiske fænotyper, der er nyttige for klassificering i de store typer sygdom. Vores gruppe har beskrevet en lang række immunhistokemiske biomarkører, der viser specifikke profiler på tværs af disse histotypes [4], [41] – [43]. Et centralt panel af 9 IHC markører kombineret med en prædiktiv algoritme, den Lommeregner til æggestokkene Undertype Prediction (COSP), kan bruges til pålideligt at skelne mellem typer [2]. Vi har tidligere demonstreret en høj grad af overensstemmelse mellem vores prædiktive immun-klassificeringen og konsensus ekspert gynecopathological gennemgang [2],. Indledningsvis vi anvendte dette panel (Fig 1A-B), og den COSP prædiktiv algoritme, til 32 ovariekræft cellelinjer af tvetydig histotype at fastslå, om cellelinier opbevares repræsentative egenskaber er tilstrækkelige til at klassificere cellelinier til deres sande sygdomstilstande oprindelser og muliggøre typen -specifikke ovariecancer model udvikling. Den TFF3 IHC markør, som normalt stærkt forbundet med mucinøs type og set ved moderat frekvens i ENOCa og LGSC [2], var negativ på tværs af alle prøver (Tabel S4), hvilket tyder på dette udskilte faktor, hvis udtryk overhovedet, kan udvises hurtigt fra cellerne og vaskes væk i medierne. Følgelig kan TFF3 IHC ikke være en pålidelig biomarkør måling til brug med dyrkede celler. Men forekomsten af ​​

TFF3

mRNA i delprøver syntes ligner den rapporteret af IHC [2], [44], med konsekvent højere udtryk i mucinøse karcinomer (p 0,01;. Figur 1C). Vi har derfor erstattet påviselig

TFF3

mRNA for IHC og scorede enhver cellelinje med påviselig mRNA som “1” i vores COSP algoritme (fig. 1D og tabel 2).

(A-B) repræsentativ IHC fra en typisk høj kvalitet serøs ovariecarcinom cellelinie, Kuramochi, og en klar cellecarcinom cellelinie, TOV21G. Ud over den 9-markør COSP panel, er IHC for ARID1A (BAF250a) også vist som en mutation surrogat. (C)

TFF3

mRNA-ekspression fra 60 ovariecancer prøver (12 af hver histotype). Som tidligere bemærket høj ekspression er mest udbredt i MUC efterfulgt af ENOCa og LGSC [2], [4]. Expression i vores pilot kohorte tyder de højeste niveauer af TFF3 i MUC, hvilket var betydeligt højere end alle andre grupper (Tukey justerede p 0,01); ingen andre parvise sammenligninger havde p 0,05. (D)

TFF3

mRNA detekteret i æggestokkene cancercellelinier blev anvendt i stedet for en IHC score som det udskilte TFF3 blev betragtet som en dårlig biomarkør for celledyrkningsbetingelser. Enhver cellelinie med målbar

TFF3

mRNA over afsløring tærsklen NanoString (se metoder) blev betragtet som positive (score på 1 til brug i COSP algoritme).

Mange tidligere beskrevne CCC linjer viste funktioner karakteristiske for deres forventede oprindelse. Ud over den COSP 9-markørpanel, tilføjede vi IHC for ARID1A (BAF250a). I betragtning af den stærke negative sammenslutning af mutation status og påviselig protein udtryk [16] vi overvejet dette assay som surrogat mutation test nyttige i udskille endometriose associeret æggestokkræft fra andre undertyper, især high-grade serøs, som

ARID1A

mutationer synes at være overordentlig sjældne i denne subtype [16], [45]

Mutationsanalyse Profiler:. specifikke molekylære funktioner Clear celle

Vi næste testede cellelinjer for mutationer i fælles æggestokkene kræft forbundet gener (tabel 2 og tabel S5). Som nogle af de cellelinjer, vi testede, er også en del af en større Cancer cellelinje Encyclopedia (CCLE) repository datasæt [38], vi tværs valideret vores mutation test med denne database samt COSMIC database [39]. Vi fokuserede på områder af kendt betydning i almindelige kræftform gener, herunder hotspots i

BRAF, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, ERBB2, EGFR, CTNNB1, PIK3CA, PPP2R1A

DICER1

. Alle kodende exoner af

TP53

blev efterprøvet i samtlige cellelinjer.

ARID1A

mutationer blev testet ved hjælp af en brugerdefineret NGS gen hybrid capture strategi [37] i RMG-1, RMG-2, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, TOV21G, og ES-2; for alle andre cellelinjer vi brugte

ARID1A

data fra COSMIC og CCLE foruden IHC som

ARID1A

mutation-test surrogat (tabel 2).

Som med vores IHC data fleste CCC linjer opretholdt en profil i overensstemmelse med CCC histotype herunder mutationer i

PIK3CA

ARID1A

. Yderligere, tab af ARID1A ekspression, demonstreret ved IHC, viste god overensstemmelse med tilstedeværelsen af ​​kendte trunkering mutationer, som bemærket for primære tumorprøver [16]. Som forventet IHC for p53 korrelerede godt med antallet af mutationer. For cellelinjer med en optaget mutation (på tidspunktet for indgivelsen) i enten CCLE eller COSMIC alle registrerede mutationer matchede repository optegnelser, bortset fra en homozygot /hemizygote 127 bp sletning af

TP53

påvist i MCAS. Vi formoder, at den 127-bp sletning i MCAS (i ​​slutningen af ​​exon 4;. Figur S1) kan være blevet overset i CCLE exon sekventering strategi i vores erfaring falske negativer er fremherskende i NGS datasæt. Samlet set tilføjelsen af ​​mutation data var særlig hjælpsom i at støtte første klassifikation fra COSP (tabel 2).

Vi tog til efterretning, at et antal cellelinjer ofte anvendes som high-grade serøse modeller eller generisk som “ovariecancer “havde begge

ARID1A

mutationer og immuno-profiler i overensstemmelse med det endometrioide type, den tredje mest almindelige type tegner sig for mindre end 10% af ovariecarcinomer [3], [4]. Sammen med immuno-klassifikationen tilstedeværelsen af ​​en

ARID1A

mutation forudsat overbevisende dokumentation for en ikke-HGSC oprindelse. Forekomsten af ​​

TP53

ARID1A

mutation var nær gensidigt udelukkende med undtagelse af IGROV1 og 2008. IGROV1 bærer to frame skift mutationer i

ARID1A

(p.M274fs /p.G1847fs) og en mutation af ukendt betydning i

TP53

(p.Y126C (het)), selvom p53-ekspression ved IHC forekom normale. 2008 cellelinie havde målbart ARID1A, hvilket tyder på tab af funktion, og også gennemført to

TP53

mutationer (c.572_574 delCTC (het) /c.673-1 G T (het, splejsningssted)) og svarende p53 IHC overekspression. Disse atypiske kombinationer af mutation kunne plausibelt forklares ved en tilbøjelighed til at akkumulere mutationer i cellelinier med DNA mismatch reparation (MMR) mangler, som er blevet rapporteret for IGROV1, SKOV3 og A2780 [46], [47]. Vi valideret MMR-vejen proteinekspression med IHC for MLH-1, PMS-2, MSH-2, og MSH-6 (tabel S5) og observeret tab af to eller flere MMR-proteiner i IGROV1, SKOV3, A2780 TOV21G, COLO-704 og COLO-720E; ingen MMR proteinmangel blev bemærket i 2008 cellelinje.

Kopier Antal profiler af klare cellelinjer

Som vores primære formål var at beskrive CCC cellelinjer vi genereret kopi nummer profiler af bona-fide CCC cellelinjer hjælp Affymetrix SNP6.0 microarrays. I overensstemmelse med tidligere rapporter ved hjælp primær tumor prøver viste CCC linjer en moderat grad af kopi nummer abnormiteter, hvilket tyder på et genom, der har undergået en vis grad af genomisk instabilitet.

Et begrænset antal litteratur rapporter har fremhævet gener med mutationer, overekspression og /eller forstærkning blandt primær CCC, nogle med et forhold til overlevelse eller fremskreden sygdom [4], [16], [45], [48] – [59]. Som vi observeret i Mutationsprofiler, vores bona fide CCC cellelinie panel var repræsentativ for klar-celleassocierede kopital ændringer (figur 2, tabel 3). De fleste viste beskedne kopi nummer gevinster for

HNF1B

(5/7) og

MET (4/7)

, herunder en med højt niveau forstærkning (JHOC-5), svarende til tidligere rapporter for CCC tumorer [53], [56], [57]. Selvom 3/7 CCC linjer viste kopi nummer gevinst på

ERBB2

, i alle tilfælde amplikonet segmentet også omfattet den nærliggende CCC biomarkør

HNF1B

, og ingen var positive for HER2 protein-ekspression ved IHC ( ikke vist). Kopiantal tab omkring

TP53

blev kun observeret i en enkelt CCC cellelinie (OVMANA; heterozygote tab) og, som nævnt ovenfor, alle CCC linjer syntes at have en normal-lignende ekspressionsmønster for p53 (IHC score 1 ).

Et stort udvalg af kopital ændringer ses herunder typiske CHR8 gevinster og CHR17 gevinster omkring CCC biomarkør

HNF1B

gen, se også tabel 3.

Transkriptomet profil af klare cellelinjer

Som med andre ovariecarcinom typer, tilbagevendende translokationer blandt CCC er ikke blevet beskrevet, men kun et minimalt antal undersøgelser er blevet gennemført [16]. Vores transkriptom sekventering data om RMG-1, RMG-2, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, TOV21G, og ES-2 foreslås tilbagevendende udtrykt omlejringer er mindst sjældne og blev ikke påvist blandt disse cellelinjer. Et mindre antal af udtrykte intra- og inter-kromosomale omlejringer var påviselige (tabel S4), selv om alle var unikke for hver respektive cellelinje; nogle var synlige ved multi-farvede fisk (Figur 3). Både udtrykte og ikke-udtrykte translokationer resulterer i gen gevinst /tab af funktion eller promotor udveksling kan tjene til at påvirke pathway aktivering, og den samlede udtryk, profiler af CCC. En systematisk analyse blev betragtet uden for rammerne af denne undersøgelse, og der er i øjeblikket ikke findes en tilsvarende videnbase afledt fra primære CCC tumorer til sammenligning.

En række translokationer og omlejringer kan ses i hver repræsentant klon. Komplekset karyotype af hver dominerende klon angivet nedenfor de tilsvarende 24-FISH resultater. Ikke alle afledte kromosomer blev identificerbar resulterer i et stort antal flertydige translokationer og fragmenter (betegnet med spørgsmålstegn i karyotype notationer). (B) Circos plot af RNAseq data og uskadeliggøre analyse skildrer udtrykt genomiske rearrangementer i JHOC-9 cellelinje. Translokationer set i 24 farver FISH profil er også synlige som udtrykt udskrifter herunder t (8; 19) observeret i både 2N og 4N dominerende kloner. Ingen tilbagevendende translokationer blev set på tværs af vores serie (se også tabel S3).

Diskussion og konklusioner

Som vores indledende mål var identifikation af bonafide CCC cellelinjer, vi er glade for at rapportere at flertallet af rapporterede CCC linjer var repræsentative for de primære tumorer »molecular og patologisk fænotype. Vores immuno-klassifikation ordning, COSP, forudsagde de fleste at være CCC og vores egne mutation data, samt at der fra COSMIC og CCLE, foreslog tab af funktion

ARID1A

mutationer var fremherskende i disse cellelinjer. Selvom tre CCC linjer ikke havde identificerbare

ARID1A

mutationer, kun JHOC-5-celler syntes at have både vildtype- sekvens og påviselig proteinekspression. Antallet af ARID1A “normale” CCC linjer er lavere end man kunne forvente i betragtning af hyppigheden af ​​

ARID1A

mutationer (og negativ IHC) observeret i den primære CCC [16], [45], og kan indikere nogle fortrinsret udvalg for

ARID1A

null CCC linjer til at tilpasse sig

in vitro

kultur. Men i betragtning af lille prøvestørrelse kan det godt være en tilfældighed, og synes ikke at være væsentlig. Andre fundne mutationer (

PIK3CA

,

PTEN

,

KRAS

,

PPP2R1A

) er alle i overensstemmelse med varierende frekvenser i CCC.

TP53

mutationer er bemærkelsesværdigt fraværende i alle vores validerede CCC cellelinjer, som en de-facto afgørende kendetegn, og kun en enkelt CCC linje havde heterozygot kopi nummer tab dog stadig bevaret normal-lignende p53 IHC.

Både CCC og ENOCa synes at opstå i en baggrund af endometriose. Atypisk endometriose støder op til eller sammenhængende med, enten histotype er ikke usædvanligt, at enten CCC eller ENOCa [16], [60], [61]. Co-forekomst (undertiden sammenhængende) af både CCC og ENOCa histologier i et blandet celletype tumor er blevet rapporteret [62] (og Dr. Blake Gilks, personlig kommunikation). Mutations profiler herunder

ARID1A

PIK3CA

, er fælles for begge typer, generelt støtte en relateret oprindelse og lignende vej til transformation [16], [45], [48], [49] . Vi fandt, at begge ES2 og OVISE cellelinjer, sigende afledt fra CCC, stort set lignede de immuno-profiler af ENOCa. Omvendt 2008 cellelinie sigende afledt af serøs carcinom [63], selv om der ofte omtales som ENOCa [64], forekom mere CCC-lignende fra COSP alene. 2008 linje viste, mutant p53 farvning og har to bekræftede

TP53

mutationer, atypiske for ægte CCC. IHC var negativ for ARID1A, støtte en ikke-serøs oprindelse. Vi stillede en overdragelse af ENOCa basen i høj grad af

TP53

mutation dog bemærke, at denne cellelinie er ganske atypisk, da det kan bære tab af funktion ændringer for ARID1A, mutation af

TP53

, og er positiv for CCC biomarkør HNF1B. Velsagtens fejl i cellelinje histotype rapporter kan forklares blot ved historisk ringe reproducerbarhed i celletype opgave, selvom det ikke er uforudsigelig, at det biologiske forhold mellem CCC og ENOCa kunne påvirke disse fænotyper. I betragtning af den høje grad af overlapning mellem de mutationelle karakteristika CCC og ENOCa, vores panel var ikke i stand til yderligere at adskille eller præcisere denne tilsyneladende forvirring. SKOV3 er en anden enestående tilfælde, da det er immuno-fænotype mest ligner HGSC, men det caries en beskærer mutation for

ARID1A

, en mutation, der ikke er observeret i HGSC trods udbredt test [16], [45]. Tidligere undersøgelser med SKOV3 har peget på en klar celle-lignende histologi ved dyrkning som xenograft [64], og dette kan yderligere fremme en endometriosis-associeret æggestokkræft diagnose ligesom tilstedeværelsen af ​​en

PIK3CA

mutation. Endelig TOV112D cellelinien præsenterer også som en undtagelse med en moderat stærk forudsigelse af HGSC immuno-fænotype. På trods af dette fund foreslår vi denne linje repræsenterer

TP53

mutant ENOCa, baseret på tilstedeværelsen af ​​en ENOCa karakteristisk

CTNNB1

mutation, patologisk undersøgelse af den primære tumor materiale i laboratoriet oprindelse og udtryk profilering eksperimenter understøtter denne konklusion [65]. Vi foreslår, at disse atypiske CCC /ENOCa kan være nyttige i udforskning af nogle fælles endometriose-associeret æggestokkræft biologi dog bør foretages omhu for at sikre en korrekt fortolkning af resultaterne.

Desværre vores COSP værktøj er i stand til at differentiere LGSC . Baseret på ekspert fornyet gennemgang af primært materiale, vi er opmærksomme på to cellelinjer afledt LGSC primære tumorer. Vi har derfor trygt favorisere denne klassificering for VOA1056_CL og VOA1312_CL trods forudsigelser af HGSC eller ENOCa opnået fra COSP. Den VOA1056_CL linje bærer en Ras-pathway mutation som man kunne forvente af en LGSC tumor, men dette er en nationale tilsynsmyndigheder Q61R aktiverende mutation. Aktivering nationale tilsynsmyndigheder mutationer blev for nylig beskrevet i LGSC på AACR årsmøde 2012 [66] men dette repræsenterer den første validerede rapport af en

NTM

mutant LGSC tumor og den første validerede LGSC afledt cellelinje bærer denne mutation. Den COSMIC database foreslår cellelinjer LK-1 (G12D, defineret som ovariecancer, som ikke er anført) og TYK-nu (G12D og Q61K, defineret som æggestokkene “serøs karcinom”) også bærer aktivere

NTM

mutationer men vi var ude af stand til at kilde disse cellelinjer til at bekræfte /afvise deres histologiske identitet. I de tilfælde af LGSC cellelinjer afledt in-house, mutationer af

TP53

blev ikke observeret i overensstemmelse med IHC baseret litteratur rapporter antyder dette er en stor molekylær diskriminator mellem HGSC og LGSC [67].

Endelig kun en enkelt cellelinje i vores samling blev rapporteret at være af mucinøs carcinoma oprindelse. Mutationen profil denne cellelinie er i overensstemmelse med denne diagnose, herunder en 127-bp

TP53

homozygot sletning, overekspression af IHC, og

KRAS

G12V mutation.

Cell line registreringer for epitelial ovariecancer er for nylig kommet i tvivl med en række forurenet og overflødige cellelinjer erkendte i en nylig undersøgelse [32]. Mest bemærkelsesværdigt 2008 (aka. Ov2008) blev rapporteret at være hyppigt forurenet med, eller et fejlagtigt version af, HPV-positive ME-180 cellelinje (ATCC HTB-33), den “sande” HPV-negative 2008 linje er defineret i rapport fra Korch et al. [32], er den, der anvendes i vores undersøgelse. Fastholdelse passende optegnelser, afprøvning og, vigtigst af alt, bør re-test identitet cellelinjer i hvert enkelt lab lagre være altoverskyggende selvom opnås cellelinjer direkte fra repositories. Her rapporterer vi kun på cellelinjer, der matchede oprindelse repository STR dna-profil eller STR profil af deres oprindelse primære tumorer (i tilfælde af in-house afledte linjer). Trods vores egen bedste indsats vores øvelse gjorde give opdagelsen af ​​3 cellelinier i vore egne aktier, som enten var forkert betegnede eller forurenet, herunder vores oprindelige status over 2008-cellelinje nævnt ovenfor. Alle forurenede linjer er siden blevet kasseret /udskiftet. Det skal bemærkes, at ingen af ​​vores analyser blev konstrueret eller testet til at skelne ovarie fra ikke-æggestokkene maligniteter, og selv om STR-analyse ville have fjernet enhver naturligvis mandlige kræftformer (gennem påvisning af Chr Y markører), en vis grad af nøjagtighed i repository rapporteret oprindelse af “æggestokkene” må antages. I tilfælde af de mere atypiske cellelinjer er det muligt disse kan være af ikke-ovarie oprindelse, f.eks endometrie carcinomer eller andre peritoneale kræft i ukendt primærtumor, vi i øjeblikket ikke vurdere denne idé. Endvidere kan vores analyse beskæmmes af dominerende udvidelse af sjældne tumor sub-kloner [68], erhvervelse af spontane mutationer under dyrkning, og MMR-mangel (uanset om erhvervet eller til stede i stammer primær tumor). MMR mangler er blevet rapporteret at være fremherskende i endometriose-associeret ovariecancere (CCC og ENOCa) [69] – [72] og den potentielle erhvervelse af mutationer som følge af MMR-mangel kan påvirke nogle af de mere flertydige biomarkør fænotyper inden for denne gruppe samt observeret atypiske mutation mønstre. Vi bemærkede MMR mangler i de ikke-serøse linjer TOV21G, SKOV3, A2780, og IGROV1 samt HGSC cellelinjer COLO-704 og COLO-720E (tabel S5). MMR-protein mangler blev ikke observeret i vores interne afledt LGSC cellelinjer (eller deres tilsvarende primære tumorer) eller i mucinøs carcinom linje MCAS.

I spektret af ovariecarcinomer seneste resultater støtter kraftigt diagnose og behandling af de fem store histotypes af carcinomer som særskilte sygdomme.