Abstrakt
Baggrund
Mange forskellige genetiske ændringer er observeret i kræftceller. Individuelle cancer gener vise punktmutationer såsom baseændringer, indsættelser og sletninger, der initierer og fremme kræft vækst og spredning. Somatisk hypermutation er en stærk mekanisme til generering af forskellige mutationer. Det blev vist tidligere, at somatisk hypermutabilitet af proto-onkogener kan fremkalde udvikling af lymfomer.
Metodologi /vigtigste resultater
Vi fandt en usædvanlig høj forekomst af enkelt-base mutationer i tumorsuppressorgener
RASSF1
RBSP3 (CTDSPL)
begge placeret i 3p21.3 regioner, LUCA og AP20 hhv. Disse regioner indeholder klynger af tumorsuppressorgener, der er involveret i flere forskellige typer cancer, såsom lunge, nyre, bryst-, livmoderhals-, hoved og hals, nasopharyngeal, prostata og andre carcinomer. Helt i 144 sekventeret
RASSF1A Salg kloner (exon 1-2), 129 mutationer blev påvist (mutationsfrekvens, MF = 0,23 pr 100 bp) og i 98 kloner af exoner 3-5 vi fundet 146 mutationer (MF = 0,29). I 85 sekventeret
RBSP3
kloner blev 89 mutationer fundet (MF = 0,10). De mutationer blev ikke cytidin-specifikke, som man ville forvente fra ændringer genereret af AID /APOBEC familien enzymer, og syntes
de novo
under celledeling. De formindskede evne tilsvarende transgener til at undertrykke celle og tumorvækst indebærer et tab af funktion. Disse høje niveauer af somatiske mutationer blev fundet både i kræft biopsier og kræft cellelinjer.
Konklusioner /Betydning
Dette er den første rapport af høje frekvenser af somatiske mutationer i
RASSF1
og
RBSP3
i forskellige kræftformer tyder det kan lå til grund for mutator fænotype af kræft. Somatiske hypermutationer i tumor suppressor gener involveret i store menneskelige maligniteter tilbyder en roman indsigt i kræft udvikling, progression og spredning
Henvisning:. Kashuba VI, Pavlova TV, Grigorieva EV, Kutsenko A, Yenamandra SP, Li J, et al. (2009) Høj foranderlighed af tumorsuppressorgener
RASSF1
RBSP3 (CTDSPL)
i Cancer. PLoS ONE 4 (5): e5231. doi: 10,1371 /journal.pone.0005231
Redaktør: Maria G. Masucci, Karolinska Institutet, Sverige
Modtaget: 9. december 2008; Accepteret: 18 marts 2009; Udgivet: May 29, 2009
Copyright: © 2009 Kashuba et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra den svenske Cancer Society, Research Council svenske, den svenske Fonden for internationalt samarbejde i forskning og videregående uddannelse (tørn), det svenske institut, den Kongelige svenske Videnskabernes Akademi, INTAS og Karolinska Instituttet. A.K. vil gerne anerkende det svenske Forskningsrådet for projektet tilskud til unge forskere. EB blev støttet med den russiske Foundation for Basic Research (Grant 07-04-00097-a). IK og MIL blev finansieret af Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. VNS og LLK blev støttet af russiske Foundation for grundforskning og af ministeriet for uddannelse og videnskab (tilskud til støtte af førende russiske videnskabelige skoler). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Vi har udført en omfattende sletning undersøgelse af 3p på mere end 400 af lunge-, nyre-, bryst-, livmoderhals- og ovariecarcinomer (store epitelial kræft) ved hjælp af et defineret sæt af markører, der kombinerer konventionel LOH med kvantitativ real-time PCR (QPCR), sammenlignende genomiske og NotI microarrays hybridiseringer [1], [2], [3], [4], [5]. Vi identificerede to hyppigst ramt 3p21.3 regioner, Luca (lungekræft) på centromerregionen og AP20 ved telomeriske grænse 3p21.3. blev påvist afvigelser enten region i mere end 90% af de undersøgte tumorer tyder de harbor flere tumorsuppressorgener (GTS) [5], [6], [7].
En af dem er
RASSF1
genet (fra LUCA område), som kan eksistere i forskellige alternativ splejsning former (mindst 7 forskellige isoformer). I dette arbejde har vi undersøgt det vigtigste
RASSF1A
, den største splejsning form [8]. Adskillige undersøgelser har vist, at tabet af
RASSF1A
ekspression forekommer på grund af tumor erhvervet promotor-DNA-methylering i mange forskellige cancerformer. F.eks
RASSF1A
er tavse af promotor hypermethylering i over 90% af småcellede lungecarcinomer (SCLC) og clear cell renal cell carcinoma (RCC) og i omkring 40% af ikke-småcellet lungecarcinomer (NSCLC ). Genet er i stand til at undertrykke væksten af lunge og renal cancerceller i kultur og tumordannelse i mus [6]. Derudover lejlighedsvise missense mutationer i
RASSF1A
er blevet rapporteret.
RASSF1A
koder for 340 aminosyrer. Aminosyresekvensen af
RASSF1A
indeholder en forudsagt diacylglycerol (DAG) bindende domæne og et Ras association domæne. RASSF1A kan fremkalde celle-cyklus anholdelse ved at engagere Rb-familien cellecyklus checkpoint [9]. Disse og andre resultater tyder på, at RASSF1A er en vigtig menneskelig tumor suppressor protein handler på forskellige tumor progression [6].
En anden gen
RBSP3
også kaldet
HYA22
og
CTDSPL
. Den findes i to splejsede former (A, 265 aminosyrer og B, 276 aminosyrer), der kort til AP20 region og hører et gen familie af små C-terminale domæne phosphataser, der kan styre RNA-polymerase II transkription maskiner [10]. Ekspression af genet blev stærkt reduceret i flere SCLC og NSCLC cellelinier.
RBSP3
viste vækst undertrykkelse med regulerede transgener i kultur og undertrykkelse af tumordannelse i SCID-mus. Det blev påvist, at transient ekspression af både A- og B-former resulterede i drastisk reduktion af phosphorylerede form af RB-protein formentlig fører til en blok af cellecyklussen på G1 /S grænsen. Efter dette fund genet blev omdøbt (RB protein serin phosphatase fra kromosom 3). Alle disse funktioner er i overensstemmelse med klassiske karakteristika for en GTS
Det er interessant, både
RASSF1
RBSP3
kunne samarbejde i cellecyklusstop:. Den tidligere ved at hæmme cyclin D1 [ ,,,0],9] og sidstnævnte ved dephosphorylere RB [10]. Dette understøtter den hypotese, at GTS i disse to regioner kan virke synergistisk [4], [5]. Desuden to andre GTS fra disse regioner kan forårsage stigende mutationsfrekvenser i tumorer (
MLH1
fra AP20 og
G21 /NPRL2
fra LUCA) [11], [12], [13].
det er velkendt, at kræft er resultatet af genetiske og epigenetiske ændringer og punktmutationer er en af de vigtigste mekanismer for udvikling af kræft [14], [15].
Tidligere, andre, og vi opdaget talrige enkeltslebne base-ændringer /mutationer i
RASSF1A Hoteller, som mentes at være SNPs [8], [16], [17]. Desuden
blev påvist RBSP3
mutationer i alle 14 tumorer af forskellig oprindelse, der udtrykker genet [10].
For at undersøge de tilsyneladende høje mutation frekvenser af TSG (r) i disse regioner af 3p21. 3, udførte vi en omfattende mutation analyse af
RASSF1A
[18], [19] og
RBSP3 /HYA22
[10] i flere kræftformer. Her viser vi, at usædvanligt hyppige single-base mutationer forekommer i disse gener i flere cancertyper. Mutationerne blev ikke cytidin-specifik som ville forventes, hvis der genereres af AID [20] eller andre APOBEC familie [21], [22] enzymer. Disse mutationer var ikke på grund af RNA-redigering og syntes
de novo
under celledelinger.
Resultater
Bioinformatik analyse af EST cDNA kloner afslører høj mutation hyppigheden af
RASSF1
RBSP3
først undersøgte vi offentligt tilgængelige EST sekvensdata for
RASSF1A
RBSP3
(for
RASSF1A
tiltrædelse No. NM_007182;
RBSP3A
, tiltrædelse No. AJ575644, og for
RBSP3B
, tiltrædelse No. AJ575645). Sekvenser med homologi under tærsklen (se Materialer og fremgangsmåder) dvs. indeholder multiple distinkte fejlparringer til den kommenterede gener og ukendte nucleotider (N) blev ikke betragtet. Sekvenser tæt på slutningen af læser blev også udelukket. Dataene i tabel 1 viser, at
RASSF1A
RBSP3
gener muteret ved ekstremt høje priser. For
RASSF1A
betragtede vi kun 17 kloner (mutation frekvens pr 100 bp, MF = 0,22). Seks af dem blev opnået fra cancervæv og alle af dem indeholdt mutationer (MF = 0,42). Elleve sekvenser var fra normalt væv (fire kloner med en mutation) og MF = 0,1, dvs. mutationsfrekvenser var statistisk signifikant forskellig (P = 0,025).
Firs én procent af
RBSP3 Salg sekvenser (63 ud af 79) indeholdt mutationer /uoverensstemmelser. MF for
RBSP3
EST’erne var 0,63. Igen var meget højere i kloner isoleret fra cancer (MF = 1,05) end fra normale væv (MF = 0,45). Denne forskel var også signifikant (P 0,001). Forskellen var endnu mere udtalt for mutationer skiftende aminosyresekvenser (MF 0,72 versus 0,24) og lignende for RASSF1A kloner (MF 0,33 versus 0,1).
Antallet af tilgængelige (og muterede) EST-sekvenser var signifikant højere for både
RASSF1A
RBSP3
, men på grund af de meget strenge kriterier mange blev udelukket fra analysen.
det er vigtigt, vi har også opdaget hypermutationer i andre exoner af
RASSF1A
, delt med
RASSF1C
(for nylig vist sig at være et GTS med en anden vævsspecificitet end
RASSF1A
, se [23]. MF for exon 3-6 var 0,43 og for mutationerne skiftende aminosyrer MF = 0,25, og derfor
RASSF1C
også hypermutated.
En lignende bioinformatisk analyse blev gjort for insulin-genet (333 bp, komplet ORF). der blev ikke fundet mutationer i mere end 1000 sekventerede kloner isoleret fra cellelinjer og somatiske væv. i 20 ledige
p16 /INK4a
(exon 1-3, 447 bp) kloner sekventeret fra kræft og normale celler fandt vi ingen mutationer og i 6 kloner for
GPR14
(1170 bp) kun 1 mutation blev fundet i kræftceller (MF = 0,01). I vores eksperimenter, der er beskrevet nedenfor (se næste afsnit og afsnittet “forskellige mutationer frekvenser i andre gener”) i 31 sekventeret
GPR14
kloner ingen mutationer blev fundet indikerer, at denne mutation er temmelig sjældne. Mutationen frekvens for GPR14 var statistisk signifikant forskellig i forhold til både RASSF1A og RBSP3 (P = 0,01).
Hyppige mutationer i
RASSF1A
i humane carcinomer, cancer og hæmatopoietiske cellelinjer
Under analyse af
RASSF1A
vi har isoleret flere muterede kloner, herunder en dobbelt mutant [16]. Denne høje frekvens af mutationer var overraskende, da for
RASSF1A
andre kandidatgener i AP20 og LUCA regioner mutationen frekvenserne blev rapporteret til at være lav til ingen [6], [19]. Samtidig mange polymorfier blev registreret for
RASSF1A
og i mange tilfælde var det ikke klart, om det var en reel enkelt nukleotid polymorfi eller somatisk mutation i kræftceller, fordi kontrol normale celler ikke var tilgængelige [8]. Vigtigere er, i alle disse undersøgelser blev anvendt enkeltstrenget konformation polymorfisme (SSCP) og direkte sekventering fra PCR-produkter. Iblanding af stroma, blodkar, lymfocytter og andre normale celler ville hæmme påvisning af mutationer ved anvendelse af disse metoder (se M /M). Tumor heterogenitet skaber yderligere problemer for anerkendelse mutationer. Derfor besluttede vi at re-undersøge mutationsstatus af
RASSF1A
i flere tumorer, herunder primære tumorer og kræft cellelinjer. Først
RASSF1A
cDNA blev isoleret fra en RCC biopsi (T356) og den omgivende normalt søger nyre parenchym (N356). Adskillige cDNA-kloner blev sekventeret. I seks kloner stammer fra normal nyre parenkym, blev der ikke fundet mutationer. Men for syv kloner fra tumorvævet blev mutationer detekteret i tre (P = 0,14). Alle var A til G udskiftninger. At udelukke RNA-redigering, genomisk DNA fra den samme patient blev isoleret og de første to exoner (DAG domæne) af
RASSF1A
blev amplificeret ved PCR. Adskillige kloner afledt fra normale og tumorvæv blev derefter sekventeret: alle seks kloner fra tumor biopsi viste mutationer mens de fjorten analyserede kloner fra normalt væv kun én var muteret (P 0,001). De observerede mutationer i cDNA’et fra tumorceller blev ikke skabt af RNA-redigering fordi mutationerne blev påvist også på genomisk DNA-niveau. Normal forurening celle og høj ekspression af
RASSF1A
i normale celler, sammenlignet med kræftceller, kan forklare de forskellige forhold mellem muteret og normal
RASSF1A
kloner fra cDNA og genomisk DNA. Mest overraskende var den kendsgerning, at med undtagelse af to genomiske kloner fra tumor biopsi med deletion af C i position 254 (Accession Nr NM_007182), alle andre påviste mutationer var i forskellige positioner.
Som kontrol vi amplificeret
GPR14
fra den samme patient og sekventeret 10 kloner fra cancer og fra det omgivende normale væv. Ingen mutationer blev fundet beviser, at høj mutation sats er specifik for
RASSF1A
gen.
For at kontrollere, om forskellige mutationer i samme tumor opstået på grund af tumor heterogenitet eller en anden mekanisme (r) vi isoleret og sekventeret
RASSF1A Salg kloner (kun exon 1 og 2; 391 bp) fra genomisk DNA fra fire RCC-cellelinier. I TK164 alle tre, og i KRC /Y (2 + 2) alle fire sekventerede kloner indeholdt mutationer. I TK10, blandt 22 kloner blev 9 muteret. Vigtigt er, at størstedelen af kloner indeholdt forskellige mutationer. Kun én klon blev sekventeret fra Caki1, og det blev muteret.
Vi sekventeret også dette gen fra genomisk DNA fra fire lymfoide cellelinier (BL2 og RAMOS er Burkitt cellelinier og IARC171 og MutuIII er lymfoblastoide cellelinjer) og resultaterne var meget lig de RCC-cellelinier (tabel 2). Helt, blandt 84 sekventerede kloner 55 indeholdt mutationer, i de fleste tilfælde afveg. MF i
RASSF1A
i disse forsøg var mellem 0,14 og 0,70.
I alle yderligere eksperimenter, vi analyserede genomisk DNA (exon 1 og 2 for
RASSF1A
det hele
RBSP3
transgen i PETE vektor) andet er angivet.
Mutationer i
RASSF1A
kan genereres
de novo
for at skelne mellem den mulighed, at forskellige muterede
RASSF1A
gener muteret på én gang ( “byge af mutationer”) eller var konstant genereret over tid, vi udførte eksperimenter med enkelte celler. I dette eksperiment BL2 celler, (som tidligere viste den højeste rate af mutation: 10 kloner med 25 mutationer), blev fortyndet og belagt i brønde med en forventet frekvens på 0,3 celler pr. Tre tilfældigt udvalgte brønde (udpeget som BL2-cl.1, 2 og 3), der indeholder enkelte celler blev udvidet og yderligere analyseret. DNA blev isoleret fra disse kloner efter 10 dage (ca. 10 divisioner, 10
3 celler)
Resultaterne blev som følger:. For BL2-cl.1, fem af 10 sekventerede kloner var muteret (mutation frekvens pr 100 bp (MF), var 0,14), for BL2-cl.2, fem af 13 kloner (MF = 0,15, to kloner indeholdt T43T mutationer med codon ændret fra ACA til ACG) og for BL2-cl.3, tre af 17 kloner var muteret (MF = 0,07; to kloner indeholdt N70G mutationer). I alt 16 enkelt basepar mutationer blev påvist, alle var overgange og kun fem af dem viste muteret G eller C. Dette eksperiment viser klart, at mutationer i
RASSF1A
locus kunne genereres
de novo
under celledeling.
Den komplette liste over 129 mutationer (111 mutationer var forskellige) fundet i exon 1 og 2 i
RASSF1A
i alle forsøg er vist i tabel S1A. Se også tabel 2 og 3 og figur 1
A
. I alt 144 kloner blev sekventeret (56,3 KB) og den gennemsnitlige hyppighed af mutationer var 0,23 /100 bp for transskriberede sekvenser og 0,17 /100 bp for kodende sekvenser. Blandt dem var der fire nukleotid ændringer, der skete i ikke-kodende 5 ‘, tre stop (nonsens) og fem frameshift (deletioner) mutationer. Af de resterende 127 mutationer, 82 var missense og 35 synonyme.
Placering af mutationer fundet i
RASSF1A
RBSP3
er vist i A og B henholdsvis. Eksempler på mutationer er vist i C. For
RASSF1A
kun mutationer i kodende sekvenser af exon 1 og 2 er vist. Mutationer i hele den kodende del af RBSP3 er vist. Rødt “X” markerer stoppe nonsense mutationer eller sletninger. “Z” betegner synonyme mutationer.
RBSP3
også hypermutated i forskellige kræftformer
Under tidligere analyser af småcellet lungekræft (SCLC) celle line N417, to RCC, det ene bryst carcinom (BC) og to æggestokkene karcinom (OC) biopsier, at alle udtrykte
RBSP3
, vi har registreret mutationer i
RBSP3
cDNA i alle seks sager [10 ; se tabel S2A].
For at teste, om hypermutation funktion er en karakteristisk kun for
RASSF1A
gen eller en mere generelt fænomen, vi analyseret på samme måde den nyligt identificerede multiple tumorsuppressorgen
RBSP3
placeret i AP20, 3p21.3 telomere region [10].
Brug RT-PCR, blev cDNA isoleret fra to af hver RCC, BC og OC biopsier og SCLC cellelinie N417. Flere kloner blev sekventeret. Resultater, vist i tabel S2A, tabel 3 og figur 1B, viste, at næsten alle isolerede kloner lidt mutationer. Som revers transkriptase anvendes i RT-PCR har en væsentlig større fejlrate end andre polymeraser, der anvendes i PCR, vi forsøgte at reproducere den observerede høje mutationsgrad på det genomiske DNA-niveauet, som i tilfældet med
RASSF1A
. Desværre var det vanskeligt at udføre dette forsøg på det genomiske
RBSP3
grund af den store størrelse af genet (mere end 120 kb), talrige små exoner (mindst 9), og højt GC-indhold (nå 100 % i nogle regioner). Men dette problem blev løst ved hjælp af klonet
RBSP3
i SCID-mus.
RBSP3
afslørede stor foranderlighed i SCID mus på genomisk niveau
SCLC cellelinje ACC -LC5 og RCC cellelinje KRC /Y transficeredes med
RBSP3A
RBSP3B
splejsning isoformer i PETE vektor og stabile celle kloner blev isoleret. Fire af disse kloner (AHA1 og AHB1 for ACC-LC5 og KHA4 og KHB9 for KRC /Y), blev indpodet i SCID-mus (se M /M).
Cellekloner KHA4 og KHB9, der indeholder
RBSP3A
eller
RBSP3B
blev dyrket
in vitro
parallelt med tumorer i SCID-mus. Efter 8 uger blev DNA isoleret fra dyrkede tumorer og cellelinjer, og
RBSP3A
B
gener blev opformeret ved PCR fra PETE vektor og klones. Igen multiple kloner blev sekventeret, og resultaterne af forsøget er vist i tabel 4 og tabel S2B. Kun 30% af
RBSP3
KHA4 og KHB9 plasmidkloner var muteret
in vitro
, sammenlignet med 85% muterede kloner efter vækst i SCID-mus. Denne forskel ifølge Fischer test er statistisk signifikant (P 0,001).
Sammenfattende i
RBSP3
eksperimenter vi identificeret 89 mutationer blandt hvilke 79 var individuelt tydelig (se tabel S2A og S2B). Den gennemsnitlige frekvens af mutationer var 0,10 /100 bp for transskriberede sekvenser. Denne frekvens er mere end 0,11 /100 bp for kodende sekvenser (se tabel 3 og figur 1 B). Blandt dem, forekom syv nukleotidændringer i ikke-kodende regioner og fem var læserammeforskydning (deletioner) mutationer. Af de resterende 77 mutationer, 68 var missense og ni synonyme.
Således mutationen frekvens var 2,5 gange mindre end for de første to exoner af
RASSF1A
(se ovenfor). kunne forklares den betydelige forskel i mutationsfrekvenser for forskelle i nucleotid sammensætning af generne, eller det kunne afspejle iboende forskelle i hypermutation satser af generne. Det kunne også være vigtigt, at for
RBSP3
hele genet blev sekventeret mens for
RASSF1A
kun 5′-enden.
RASSF1A
RBSP3
opformeret ved PCR fra
E.coli
DNA viser ikke høj frekvens af mutationer
Vi har udført PCR-amplifikation af
E. coli
DNA indeholdende plasmider (dvs. totalt DNA isoleret fra
E.coli
blanding af genomisk og plasmid-DNA) med disse to gener. For hvert gen ti og fire ng DNA blev anvendt. Desværre lavere mængde
E. coli
DNA ikke producerede tilstrækkelig mængde af PCR-produkter til yderligere kloning. Ti kloner i hvert forsøg blev sekventeret, og ingen mutationer blev påvist. Disse resultater indikerer, at den observerede hypermutation på
RASSF1A
RBSP3
kan ikke forklares ved PCR polymerase fejl.
Søg efter grundlægger mutationer i
RASSF1A
i enkelte celle kloner
Hovedidéen med dette forsøg var følgende. Hvis en mutation stammer i cellen og ikke i røret
in vitro
derefter i cellepopulationen vokset fra en celle nogle fraktion (afhængigt af antallet af alleler er til stede i enkelt celle) af plasmidkloner bør indeholde samme (dvs. en grundlægger) mutation. For at udføre dette eksperiment vi isoleret 15 enkelt celle KRC /Y-kloner, som beskrevet i afsnittet “Mutationer genereret de novo”. I dette tilfælde voksede vi cellerne i tre uger for at opnå mere DNA og generere mere muterede kloner. KRC /Y-celler blev anvendt i stedet for BL2 celler, som det var nemmere at opdage, at vi har en celle i brønden. Vi kan imidlertid naturligvis ikke udelukke, at i nogle af de 15 udvalgte brønde der var mere end én celle.
RASSF1A Salg exonerne 3-5 blev testet i dette forsøg (se M /M), som de var lettere isoleret end exon 1 og 2 og indeholdt mere sekvensinformation (516 nt vs. 391 nt). Ifølge EST sekvens data denne del af
RASSF1A
har højere MF. Fra hver PCR-reaktion 10 plasmid kloner blev selekteret, og DNA blev isoleret. Men på grund af forskellige tekniske problemer (ingen eller omarrangeret insert, dårlig kvalitet DNA eller sekventering, etc.) normalt blev analyseret yderligere, kun seks-syv plasmid kloner. Fuldstændig 98 plasmid kloner blev sekventeret (tabel 5). En stifter mutation blev fundet i alle cellekloner og i 46 (47%) af plasmidkloner. Det var en ændring af A til G (nt26735, Accession Nr AC002481) lige ved grænsen til intron 2 og exon 3. Denne mutation ødelagde splejsningsacceptorstedet AG /G og således inaktiverede gen. Da denne grundlægger mutation dukkede op i alle enkelt celle kloner sandsynligvis det stammer før vi begyndte at gøre dette eksperiment. Fyrre andre stiftende mutationer specifikke for hver celle klon blev også påvist (se tabel 5 og tabel S1B). Interessant i ét tilfælde var det muligt at konstruere et træ, der viser, hvordan stiftende mutationer blev akkumuleret. Først var det kun én mutation end to og derefter yderligere uafhængige mutationer (figur 2).
synonym mutation Pro122Pro skyldtes nukleotidændring ATC → AAC. Mutation GTC → GTA heller ikke medføre nogen aminosyre ændring (Val174Val).
Forskellige mutation frekvenser i andre gener
Lignende sekventering eksperimenter blev udført med insulin og albumin-gener isoleret fra KRC /Y-cellelinie (se M /M). I modsætning til
RASSF1A
og
RBSP3
resultater, kun én af 21 sekventeret insulin genomiske kloner (999 bp inklusive komplet ORF) og en af 19 albumin cDNA kloner (700 bp, exoner 12-15 ) var muteret (MF for begge gener var mindre end 0,01). Men i begge tilfælde, kunne vi ikke udelukke muligheden for polymorfier. Derudover blev yderligere to gener testet for mutationer i genomisk DNA.
GPR14
(G-protein-koblede receptorer 14, 1018 bp) og transskription elongeringsfaktor A (SII)
TCEA1
(1066 bp) blev PCR-amplificeret (se M /M) fra DNA fra KRC /Y-celler og 11 kloner for hvert gen blev sekventeret. Alle kloner indeholdt normale kopier af genet. Ingen mutationer blev fundet i andre 3p21.3 kandidatgener:
BLU Hotel (15 kloner blev sekventeret),
101F6
(6 kloner),
PL6
(6 kloner) efter KRC /Y stabile kloner indeholdende disse gener blev inokuleret i SCID-mus. Desuden for allerede muteret mut
FUS1 Hotel (10 kloner) og mut
P53 Hotel (6 kloner) ingen yderligere mutationer blev fundet (data ikke vist).
Mutationer i
RASSF1A
,
RBSP3A
RBSP3B
ikke genereret af støtte eller APOBEC relaterede mekanismer
det er for nylig blevet vist, at aktiveringen-induceret cytidindeaminase ( AID) er ansvarlig for somatiske hypermutationer i aktiverede B-celler. Desuden hypermutationer genereret af dette enzym i onkogener kan forårsage maligniteter i hæmatopoietiske celler [24]. Selvom der stadig er meget, der skal læres om AID har flere mål sekvens motiver til mutationerne blevet identificeret, nemlig WRC, RGYW og DGYW forårsager C /G mutationer. Den store familie af APOBEC gener, også vist for nylig at mutere gener på DNA-niveau [21], [22], for det meste målrettet de RCW motiver forårsager mutationer i C /G. Derfor har vi kontrolleret, om disse motiver var rettet eller hyppigere i
RASSF1
RBSP3
sekvenser i forhold til den stabile insulin genet. Hyppigheden af WRC motiv pr 100 bp varierer fra 12,3 til 14,3 for
RASSF1
RBSP3
gener, og insulin genet indeholder 16,5 sådanne motiver pr 100 bp. Andre motiver viste den samme fordeling (også højere i insulin-genet), argumenterer imod inddragelse af disse enzymer i hypermuterende
RASSF1
RBSP3
gener er beskrevet her. Faktisk APOBEC og AID enzymer forårsage mutationer næsten udelukkende i C /G nukleotider, mens vi observerede mutationer af alle 4 nukleotider (Figur 3). Resultaterne viste faktisk, at mutationer i A /T var endnu hyppigere end i C /G. Vi forsøgte at finde en anerkendelse motiv. Vi studerede alle mutationer (figur 3A) eller en delmængde af mutationer (figur 3B og 3C), men ingen tydelige motiver er endnu ikke identificeret.
For
RASSF1A
alle mutationer blev analyseret. For
RBSP3
mutationer findes i GIT (
B
) og i human cancer (
C
) blev analyseret separat. Boble grafer afbilder andelen af substitutioner forekommer ved hver af de fire baser i
RASSF1A
RBSP3
, afhængigt af afstanden fra det muterede nukleotid (nr 0). N, helst nukleotid; B = C, G eller T; D = A, G eller T; S = G eller C; V = A, C eller G; W = A eller T.
Flere undersøgelser er nødvendige for at løse dette spørgsmål, da dette mønster kan være forskelligt i normale celler og cancerceller og kan være afhængig af nukleotidsammensætningen af et gen. Disse små forskelle i mønstrene kunne maskere anerkendelse motiv.
RASSF1A
RBSP3
mutanter fra RCC biopsi og lungekræft cellelinje har reduceret væksthæmmende aktivitet
Vi testede en
RASSF1A
gen, isoleret fra en RCC biopsi, der indeholdt to mutationer (Cys65Arg og Val211Ala), for væksthæmning under celle dyrkningsbetingelser efter transfektion i KRC /Y og prostatakræft LNCaP celler . I KRC /Y celler havde det muterede gen en betydeligt reduceret vækst undertrykkelse aktivitet (figur 4A), mens i LNCaP det havde næsten ingen undertrykkende aktivitet (samme som den tomme vektor, se [16], [17]).
A. Vækst af stabilt transformerede KRC /Y RCC celler med vildtype og mutant
RASSF1A
(Cys65Arg og Val211Ala) uden doxycyclin (genet er på) er præsenteret i A. På dag 6 er antallet af celler med vægt
RASSF1A
var 3 × 10
5 og antallet af celler med mutant
RASSF1A
var 5 × 10
5 (1,7 gange mere end vægt). På dag 10, antallet af celler med vægt
RASSF1A
var 6 × 10
5 og antallet af celler med mutant
RASSF1A
var 1,8 × 10
6 (3 gange mere end wt). Effekten af ekspressionen af vildtype og mutant
RBSP3A
RBSP3B
på kolonidannelse effektivitet i KRC /Y celler er vist i B. Mutanter blev isoleret fra N417 SCLC cellelinje (His139Tyr) , ovarietumoren biopsi T4 (tre mutationer: Asn31Asp, Pro79Ser og Glu87Lys) og KRC /Y-cellelinje (tre mutationer: Lys35Met, Asp103Gly og Leu181Pro). Antallet af blasticidin-resistente kolonier sammenlignet med den tomme pete var: 90% for mutant fra N417, 15% for mutant fra T4 biopsi og 25% for mutanten fra KRC /Y. Antallet af kolonier for wtRBSP3A var 5-10% i forhold til Pete kolonier.
I et andet eksperiment, vi brugte
RBSP3
kloner isoleret fra N417 SCLC cellelinje med en His139Tyr mutation . Igen blev observeret signifikant fald i væksten suppressor aktivitet (figur 4B) .Clearly ikke alle mutationer findes i denne undersøgelse vil inaktivere
RBSP3
RASSF1
gener, og det kan især være tilfældet for mutanter isoleret fra normale celler, hvoraf nogle kunne være polymorfier. Faktisk forskellige mutanter af
RBSP3
havde signifikant forskellig vækst undertrykkelse aktivitet (figur 4B).
Konklusioner
Ved sekventering 327
RASSF1A
RBSP3
kloner, vi har registreret 364 mutationer med frekvenser nåede 0,70 pr 100 bp. Interessant mange kloner indeholdt mere end 1-mutationer (se tabel S3A, B, C). Kun én SNP blev påvist i
RASSF1A
ti kloner (exon1α – AAG → KAG, K21Q), og det blev udelukket fra listen over mutationer [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi? locusId = 11186]. Ingen SNP blev fundet i RBSP3 sekvenser.
Hyppigheden af mutationer var ligner andre rapporterede tilfælde af somatiske hypermutationer fundet i Rho /TTF, MYC og BCL6 i stor celle lymfekræft (MF var fra 0,12 til MYC til 0,69 for BCL6). Men det var signifikant lavere end ved immunoglobulingener (12,7 mutationer pr 100 bp, se [25]. Men for første gang vi fandt høj frekvens af somatiske mutationer i forskellige væv, herunder ikke-hæmatopoietiske og i tumorsuppressorgener modsætning til den tidligere rapporter, hvor onkogener blev undersøgt.
som AccuPrime ™
Pfx
DNA-polymerase skaber maksimalt én fejl i 3 × 10
6 bp, vores resultater viste, at de observerede hypermutation frekvenser i forsøgene kunne ikke forklares med fejlagtig udførelse af polymeraser. i vores eksperiment med SCID mus, når AccuPrime ™
Pfx
DNA-polymerase og 25 cykler blev brugt 85% af
RBSP3
kloner indeholdt mutationer.
Under væksten af de samme cellelinjer
in vitro
, 30% af
RBSP3
kloner (også 25 cykler og AccuPrime ™
Pfx
DNA-polymerase) var mutant .
i forsøg med
RASSF1A Hotel (391 bp af den første og anden exon), 65% af kloner indeholdt mutationer (eksperimenter med normale celler er ikke inkluderet).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.