PLoS ONE: Tetramethoxychalcone, et chalcon Derivative undertrykker spredning, blokke Cell Cycle Progression, og fremkalder apoptose hos humane ovariecancerceller

Abstrakt

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi

in vitro

antitumor funktioner af en syntetisk chalcon afledte 4,3 ‘, 4’, 5’tetramethoxychalcone (TMOC) i æggestokkene cancerceller. Vi fandt, at TMOC inhiberede proliferation og kolonidannelse af cisplatin følsom cellelinie A2780 og resistent cellelinje A2780 /CDDP samt ovariecancer cellelinie SKOV3 på en tids- og dosisafhængig måde. Behandling af A2780 celler med TMOC resulterede i G

0 /G

1 cellecyklusstop gennem nedregulering af cyclin D1 og CDK4, og opregulering af p16, p21 og P27-proteiner. Vi viste, at TMOC kunne inducere celleapoptose gennem undertrykke Bcl-2 og Bcl-XL, men forøgelse af ekspressionen af ​​Bax og spaltningen af ​​PARP-1. Behandling af TMOC også reduceret invasion og migration af A2780 celler. Endelig fandt vi, at TMOC inhiberede den konstitutive aktivering af STAT3 signalvejen og induceret ekspression af tumor suppressor PTEN uanset p53-status i cellelinier. Disse data tyder på, at TMOC kan udvikles som et potentielt kemoterapeutisk middel til effektivt at behandle visse kræftformer, herunder kræft i æggestokkene

Henvisning:. Qi Z, Liu M, Liu Y, Zhang M, Yang G (2014) Tetramethoxychalcone, en chalcon Derivative undertrykker spredning, blokke Cell Cycle Progression, og fremkalder apoptose hos humane Ovarian Cancer Cells. PLoS ONE 9 (9): e106206. doi: 10,1371 /journal.pone.0106206

Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

Modtaget: 16. april, 2014 Accepteret: August 3, 2014; Udgivet 2. september, 2014

Copyright: © 2014 Qi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inkluderet i papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.071.839 for M. Liu, og nr 91.129.721 og 81.372.797 for G. Yang. ), af Kina Postdoc Science Foundation (nr 2013M531126) for M. Liu, af Shanghai Pujiang Program (11PJ1402200) fra Shanghai Municipal Kinas regering for G. Yang, og ved Forskerskolen fonden af ​​Undervisningsministeriets Kina (20120071110079 ) for G. Yang. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den hyppigste dødsårsag fra gynækologiske maligniteter hos kvinder. På grund af manglen på følsomme og specifikke metoder til tidlig påvisning, er næsten 60-70% af patienter med ovariecancer diagnosticeret på fremskredne stadier [1], [2]. Trods fremskridt i behandlingen af ​​ovariecancer, overvejende involverer cytoreduktive kirurgi efterfulgt af platinbaseret kemoterapi, overlevelsesraten for æggestokkene kræftpatienter fortsat meget lav [3]. Kliniske problemer, herunder erhvervet resistens over for konventionelle kemoterapier samt metastatisk og invasive kapaciteter af sygdommen har alvorligt svækket behandlingen succes [4], [5]. Derfor er den fortsatte udvikling af nye terapeutiske midler til kræft i æggestokkene, især for platin resistente celler, er stadig presserende.

Naturligt forekommende produkter fra forskellige planter er altid vigtigt i opdagelsen af ​​nye terapeutiske midler [6], [7]. For eksempel chalcon derivater (molekyler indeholdende 1,3-diphenyl-2-3propen-1-en-grupper), en af ​​de vigtigste kategorier af fysiske produkter med bred distribution i krydderier, te, øl, frugt og grøntsager, få vist forskellige interessante biologiske aktiviteter, herunder anti-inflammatorisk, antimikrobielle, antioxidant, og anticancer egenskaber [8] – [10]. Specifikt som en struktur efterligninger af combretastatin A-4 (CA-4), 3 ‘, 4′, blev 5’-trimethoxychalcone rapporteret at udvise antimitotiske egenskaber forårsaget af inhibering af tubulin-polymerisation [11] – [14].

i vores bestræbelser på at opdage cytotoksiske midler mod kræft i æggestokkene celler, en serie af CA-4 relaterede forbindelser blev syntetiseret og vurderet for deres anti-proliferative aktiviteter i human epitelial kræft i æggestokkene cellelinje A2780

in vitro

(data ikke vist). Blandt disse forbindelser, 4,3 ‘, 4′, 5’-tetramethoxychalcone (TMOC, fig. 1A) havde den højeste inhiberende styrke over A2780-celler. Men efterfølgende

in vitro

analyser viste, at TMOC ikke afbryde tubulin polymerisering (fig. 1B), hvilket indikerer, at anti-cancer mekanisme TMOC mangler stadig at blive belyst.

Materialer og metoder

Materialer

TMOC blev syntetiseret i henhold til den foregående rapport og blev bestemt ved spektre herunder

1 H-NMR,

13C-NMR, og højopløsningsmassespektrum (HRMS), som stort blev aftalt med litteratur [14], [15]. Renheden af ​​TMOC var mere end 98%, som blev analyseret ved HPLC.

RPMI-1640 medium og kalvefosterserum (FBS) blev indkøbt fra Thermo Scientific (South Logan, UT, USA). MTT, propidium indide (PI), 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og antistoffet til p-actin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ensian violet blev købt fra Solarbio (Beijing, Kina). Annexin V-FICT /PI apoptose afsløring kit, invasion kamre, matrigel, og antistoffet til p21 blev indkøbt fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NY, USA). Cellelysebuffer og BCA proteinassay-kit blev indkøbt fra Beyotime (Shanghai, Kina). PVDF-membran og kemiluminescerende reagenser var fra Millipore (Billerica, MA, USA). Antistoffer mod cyclin D1, CDK4, p16, p21, Bd-XL, Bax, STAT3, p53, PTEN, c-myc var fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer mod phospho-Src (Tyr416), Src, phospho-STAT3 (Tyr705) og kløvet-PARP-1 blev købt fra Cell Signaling Technology.

Cell kultur og transfektion

Den menneskelige epitelial ovariecancer cancercellelinjer A2780 og SKOV3 blev indkøbt fra ATCC. Den cisplatin resistente ovariecancer cellelinje A2780 /CDDP blev venligst stillet til rådighed af prof Ling-Ya, Pan [16]. Udødeliggjort men præneoplastiske humane ovarieepitelceller T29 blev afledt af ovarie overflade epithelial cellelinier IOSE-29 som tidligere beskrevet [17]. Celler blev rutinemæssigt dyrket med RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en befugtet inkubator ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2. Til transfektion undersøgelser blev cellerne transient transficeret med STAT3-CA (konstitutiv aktiv mutant, A661C og N663C) [18], [19], STAT3-DN (dominant negativ mutant, Y705F) [20] eller kontrolvektoren hjælp Fugene HD ( Promega). De STAT3 konstruktioner var gaver fra Dr. Hesham M. Amin (MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA).

In vitro

anti-spredning assay

in vitro

anti-proliferative aktivitet af TMOC blev målt ved MTT reagenset, som beskrevet i litteraturen [21]. Kort fortalt, 5 × 10

3-celler i 100 pi medium per brønd blev udpladet i 96-brønds plader. Efter inkuberet i 24 timer, blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af TMOC eller DMSO (som negativ kontrol) i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Derefter blev mediet med forbindelsen eller DMSO erstattet med 200 pi frisk medium indeholdende 10% MTT (5 mg /ml i PBS) i hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Sidst, blev MTT-holdige medium kasseret, og 150 pi DMSO per brønd blev tilsat for at opløse de formazankrystaller nydannede. Absorbansen af ​​hver brønd blev bestemt med en mikropladelæser (Synergy H4, Bio-Tek) ved en 590 nm bølgelængde. Inhiberingsforholdene satser proliferation blev beregnet med den følgende ligning:

Kolonidannelse assay

5 × 10

2 celler pr brønd blev podet i seks-brønds plader med en enkelt celle densitet. 48 timer senere blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af TMOC eller DMSO (som negativ kontrol) i 48 timer. Derefter blev mediet erstattet med frisk medium for at tillade cellevækst i en uge. Cellerne blev fikseret med methanol til 15 min og farvet med ensian violet i 30 min. Kolonier bestående af mere end 50 celler blev talt.

Cellecyklusanalyse

Cell cycle status blev påvist ved flowcytometri ifølge en tidligere publiceret metode [22], og blev analyseret ved Multicycle AV ( til vinduer, versionen 320) software. Kort beskrevet blev celler først behandlet med forskellige koncentrationer af TMOC eller DMSO i 24 timer, og derefter høstet, vasket to gange med 1 × PBS og resuspenderet i 200 pi 1 × PBS. Cellerne blev fikseret i 4 ml iskold 75% ethanol ved -20 ° C natten over og farvet med 500 pi PI (50 pg /ml, Sigma) indeholdende 0,1% RNase (1 mg /ml, Sigma) i 15 minutter i mørk tilstand ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter analyseret ved flowcytometri (Cytomics FC 500 MPL, Beckman Coulter). Resultaterne blev angivet som middelværdier fra tre uafhængige bestemmelser.

Cell apoptose analyse

For at detektere apoptose blev celler inkuberet med forskellige koncentrationer af TMOC eller DMSO (som negativ kontrol) i 24 timer . Cellerne blev høstet, vasket to gange med kold 1 × PBS og resuspenderet i 200 pi bindingsbuffer ved densitet på 1 x 10

5 celler /ml. Cellerne blev derefter farvet med 5 pi Annexin-V og PI, i 15 minutter i mørke omgivelser ved stuetemperatur og underkastet analyse ved flowcytometri. Den tidlige apoptose blev evalueret baseret på procentdelen af ​​celler med Annexin V + /PI-, mens den sene apoptose var, at af celler med Annexin V + /PI +. Resultaterne blev angivet som middelværdier fra tre uafhængige bestemmelser.

DAPI og PI-farvning

Nuclear morfologiske og membran integrale ændringer af apoptose blev bestemt ved DAPI og PI-farvning henholdsvis som tidligere beskrevet [23 ], [24]. 3 × 10

5-celler blev podet i 6-brønds plader og dyrket i 48 timer, efterfulgt af behandling med fortyndingsmiddel eller med ønskede koncentrationer af TMOC i 24 timer. For DAPI farvning blev cellerne vasket med PBS i tre gange, fikseret med menthol og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100, efterfulgt af farvning med DAPI (1:2000 fortynding i 1X PBS) ved 37 ° C i 15 minutter i mørk. For PI-farvning blev cellerne vasket af PBS tre gange og gælder farvet med PI ved 37 ° C i 15 minutter i mørke. Efter farvning blev cellerne vasket med PBS for at fjerne ubundet farvestof (PI) og observeret ved anvendelse af fluorescensmikroskopi (Olympus). Fluorescerende billeder blev optaget med en kølet CCD-kamera.

sårheling assay

For at detektere celle motilitet blev celler podet i 6-brønds plader og dyrket til 90% sammenflydning. En enkelt ridse sår er oprettet monolag celler ved anvendelse af en steril mikropipette spids. Efterfølgende medium med cellerester blev fjernet, og frisk serum-frit medium (uden FBS tilskud) indeholdende forskellige koncentrationer af TMOC eller DMSO blev tilsat. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C og billeder af hver sårede monolag blev taget ved 0, 36 og 72 timer.

Transwell invasion assay

Cell invasion blev analyseret under anvendelse kamre forhånd overtrukket med matrigel [ ,,,0],25]. Kort fortalt, 5 × 10

4-celler i 300 pi serumfrit RPM-1640 blev podet i det øvre kammer. Kammeret blev anbragt i en 24-brønds plade og de nedre brønde indeholdt RPM-1640 medium med 10% FBS og forskellige koncentrationer af TMOC eller DMSO (som negativ kontrol). Efter 24 timers inkubation blev cellerne på den øvre overflade af kammeret omhyggeligt pensles med en vatpind. Cellerne migrerede gennem kammeret blev fikseret med methanol, farvet med krystalviolet og efterfølgende tælles fra 5 forskellige områder fra hver brønd under omvendt mikroskop. Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg.

Western blot-analyse

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af TMOC eller DMSO (som negativ kontrol) i 24 timer, og derefter blev høstet, vasket med kold 1 × PBS to gange, lyseret med cellelysebuffer i 30 minutter på is og centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Koncentrationen af ​​totalt protein blev bestemt ved BCA-proteinassay-kit. Lige store mængder (30 ug pr belastning) af proteinprøver blev underkastet SDS-PAGE-elektroforese og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner, som derefter blev blokeret i 10% fedtfri mælk, og omsættes med primære antistoffer. Efter inkubering med de sekundære antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP), blev proteinbåndene fremkaldt med den kemiluminescerende reagenser.

Statistisk analyse

Data blev beregnet ved anvendelse Graph Pad Prism og udtrykt som gennemsnit ± SE Værdierne af IC

50 blev tilpasset ved anvendelse af en ikke-lineær regressionsmodel med en sigmoid dosis respons. Sammenligninger mellem kontrol og behandlede grupper blev bestemt ved parret

t

test eller envejs ANOVA efterfulgt af Tukey s flere sammenligning tests. Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant på

p

. 0,05 niveau

Resultater

TMOC undertrykker cellevækst

Vi først bestemmes anti-proliferative effekter af TMOC på humane ovariecancer celler, herunder A2780 (p53 vildtype), A2780 /CDDP (cisplatin resistente sublinie af A2780, p53 mutant) og SKOV3 (p53 null) celler, såvel som præ-neoplastiske ovarieepitelceller T29 celler. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer (i området fra 0,3125 til 40pM) af TMOC i 24, 48 og 72 timer. Som vist i fig. 2A, behandling af A2780 celler med TMOC resulterede i et tilsvarende fald i celleproliferation og levedygtighed på en dosis- og tidsafhængig måde. Lignende effekter blev opnået på behandling af A2780 /CDDP og SKOV3-celler (fig 2A). I modsætning hertil følsomheden af ​​T29 celler til TMOC var meget lav, når koncentrationen af ​​TMOC effektive på T29-celler blev påvist ved 40 pM i 72 timer. IC

50 værdier blev beregnet og anført i tabel 1. Således antyder disse data at TMOC har en cytotoksisk virkning på ovarietumorceller uanset p53-status, men behandler mindre cytotoksicitet i præ-neoplastiske ovarieepitelceller. Desuden har vi også testet de antiproliferative aktiviteter af chalcon (1,3-diphenyl-2-propen-1-on), der er mor forbindelsen med TMOC (tabel 1). Sammenlignet med TMOC, chalcon udviste meget svag virkning på inhiberingen af ​​både neoplastiske og præ-neoplastisk cellevækst, og fremlagt ringe vandopløselighed, hvilket kan indikere, at de fire methyloxy grupper er afgørende for anti-cancer aktiviteter og fysisk-kemiske egenskaber.

(A) TMOC inhiberede celleproliferation i dosis- og tidsafhængig måde. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assays. (B) Repræsentative billeder af cellekolonier efter behandling med forskellige koncentrationer af TMOC i 24 timer. (C) Kolonidannelse efter behandling med TMOC i 24 timer.

I de følgende eksperimenter bestemte vi effekten af ​​TMOC på kolonidannelse evne ovarian cancer cellelinjer. Kolonidannelse assayet er en

in vitro

celleoverlevelse assay baseret på evnen af ​​en enkelt celle til at proliferere i det uendelige, og derved bevarer sin reproduktive evne til at danne en koloni bestående af mindst 50 celler. Kolonidannelse assayet er den foretrukne metode til bestemmelse celle reproduktiv død efter behandling med cytotoksiske midler, og nu almindeligt anvendt til at bestemme cytotoksiciteten induceret af forskellige kemoterapeutiske midler [26]. I denne undersøgelse som vist i fig. 2B, behandling af A2780, A2780 /CDDP og SKOV3 celler med TMOC i koncentrationer på 0,3125, 0,625, 1,25 og 2,5 uM i 48 timer dosisafhængigt inhiberede kolonidannelse i sammenligning med behandling med fortyndingsmiddel (DMSO). Antallet af kolonier dannet af celler behandlet med TMOC eller fortynder blev sammenfattet i figur 2C, som bekræftede hæmmede effekt af TMOC på væksten af ​​kræft i æggestokkene celler.

TMOC inducerer G

0 /G

1 fase cellecyklusstandsnings

Kemiske antitumormidler kan inhibere celleproliferation gennem induktion af standsning af cellecyklus. Derfor, for at forstå, hvordan cellevæksten blev inhiberet af TMOC blev cellecyklusprogression analyseret ved kvantificering DNA-indhold ved anvendelse af flowcytometri. Vi behandlede A2780 celler med TMOC i 24 timer og undersøgt DNA-indholdet ved propidiumiodid (PI) farvning (fig. 3A). Som illustreret i fig. 3B, sammenlignet med kontrolceller behandlet med fortyndingsmiddel, når A2780 celler blev behandlet med høje koncentrationer af TMOC ved 5, 10 og 20 uM, procentdelen af ​​celler i G

0 /G

1 fase blev forhøjet fra 42,3 % til 64,1%, og procentdelen af ​​celler i S og G

2 /M fase blev reduceret samtidigt. Fordi cellecyklusprogression reguleres af cyclin /cyclinafhængige kinase (CDK) komplekser, kan de ukontrollerede udtryk for cycliner og /eller CDK’er føre til cellecyklus dysregulering og tumorigenese [27]. Derfor har vi undersøgt, om TMOC ramt cycliner eller CDK’er udtryk. Som vist i fig. 3C, behandling af celler med TMOC nedreguleret udtrykkene for cyclin D1 og CDK4, men opreguleres udtrykkene for p16, p21

Cip1 og p27

Kip på en dosis-afhængig måde. Tilsammen kan de ændrede udtryk af cellen cycliner og CDK-inhibitorer være forbundet med cellecyklusstandsning forårsaget af TMOC.

(A) cellecyklusfordeling efter behandling med forskellige koncentrationer af TMOC i 24 timer. (B) Kvantitativ analyse af TMOC-behandlede celler. (C) Regulering af cellecyklus associerede proteiner i A2780 celler. Forsøgene blev gentaget tre gange, og et repræsentativt forsøg er vist. *

s

0,05, **

s

. 0,01 sammenlignet med kontrol

TMOC inducerer cellulær apoptose

DAPI kerner farvning blev anvendt til at visualisere apoptose induceret af TMOC. Som vist i fig. 4A, blev den nukleare apoptose af TMOC-behandlede A2780-celler kendetegnet ved kondenseret og fragmenteret kromatin farvet med stærke blå fluorescerende prikker, hvorimod kontrolceller blev farvet med ensartet blå [24]. Desuden blev apoptose også angivet ved farvning med PI, en membran nyrefunktion nuklear farvestof, som vist i fig. 4B. Disse resultater viste, at TMOC kunne inducere cellulær apoptose. For yderligere at bestemme antallet og stadium af apoptotiske celler, blev Annexin-V /PI dobbelt farvning anvendes til at kvantificere antallet af apoptotiske celler behandlet med TMOC [22]. Som illustreret i fig. 4C og 4D, de samlede andele af celler farvet med Annexin V + /PI

– (højre nedre kvadrant repræsenterer tidlig apoptose) og Annexin V

+ /PI

+ (højre øvre kvadrant repræsenterer sent apoptose og nekrose) -celler blev forøget fra 1,2% til 35,5% efter behandling af A2780 celler med TMOC ved 5, 10 og 20 uM i 24 timer. Disse data bekræftede yderligere, at TMOC kraftigt kunne inducere cellulær apoptose af ovariecancerceller på en dosis-afhængig måde.

(A) DAPI kerner farvning blev anvendt til at visualisere apoptose induceret af TMOC. Pile repræsenterer de apoptotiske celler. Scale bar = 10 um. (B) PI optagelse blev analyseret under et fluorescerende mikroskop. Scale bar = 50 um. (C) repræsentant flowcytometri profiler af apoptose og (D) kvantitative resultater opnås ved anvendelse af Annexin V /PI-farvning. (E) Western blots af apoptotiske beslægtede proteiner. Assayet blev gentaget tre gange, og et repræsentativt resultat er vist. *

s

0,05, **

s

0,01 sammenlignet med kontrol

Dernæst undersøgte vi signalvej involveret i TMOC induceret apoptose ved. Western blot-analyse. Vi viste, at (fig. 4E), TMOC opreguleret ekspression af pro-apoptotisk protein Bax, men nedreguleret udtrykkene for de anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-xL i en ikke afhængig måde. Desuden sammenlignet med kontrolceller, udsættelse for TMOC inducerede spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), en markør for celler, som undergår apoptose [28]. Disse resultater antydede, at TMOC kunne fremkalde cellulær apoptose gennem disse proteiner.

TMOC undertrykker celle migration og invasion

metastatisk breder sig, en af ​​funktionerne i æggestokkene cancerceller, er en vigtig faktor for lavt overlevelsesraten for patienter [29], mens anticancermidler kan ikke kun inhiberer cancercellevækst, men kan også standse celle metastaser. I denne undersøgelse, at afgøre, om TMOC undertrykker invasion og migration i æggestokkene cancerceller, udført vi sårheling og Transwell invasion assays. Ved sårheling assay efter en enkelt sår blev ridset på monolag af A2780 celler blev mediet ændret med serum-frit medium indeholdende TMOC eller fortyndingsmiddel (som kontrol) for at undgå indflydelse af celleproliferation. Som vist i fig. 5A og 5B, migration af celler blev signifikant reduceret med TMOC. Undertrykkelsen af ​​migration skyldtes ikke apoptose eller vækst anholdelse som koncentrationen af ​​TMOC på 0,5 uM eller 1 pM kun inducerede en relativ lav toksicitet i A2780 celler. De opnåede fra Transwell assay resultater, viste, at TMOC inhiberede invasion og migration af A2780 celler på en dosis-afhængig måde (Fig. 5C og 5D).

(A) TMOC inhiberede cellemigration. Repræsentative fotografier af cellerne blev taget ved tiden 0, 36 eller 72 timer. (B) Kvantificering af sårheling. Forsøgene blev gentaget tre gange. (C) Repræsentative fotografier af invasive celler i Transwell invasive assays. Scale bar = 20 um. (C) Kvantificering af invasive A2780 celler. Forsøgene blev gentaget tre gange. *

s

0,05, **

s

. 0,01 sammenlignet med kontrol

signalveje involveret i TMOC-medierede anti-cancer effekter

Signal transducer og aktivator for transkription-3 (STAT3), et onkogent transskriptionsfaktor, er ofte konstitutivt aktiv i humane cancerceller [18]. Nylige undersøgelser har vist, at aktiveringen af ​​STAT3 spiller en central rolle i overlevelsen, hyper-spredning, og metastatisk progression af ovariecancer [30], [31]. Når den er aktiveret, kan den phosphorylerede STAT3 opregulere ekspressionen af ​​gener, såsom apoptoseinhibitorer (Bcl-xl, bcl-2), cell cycle regulatorer (cyclin D1) og onkogene transkriptionsfaktorer (c-myc) i tumorigenese [32], [33]. Derfor anvendte vi western blot at teste, om suppression af STAT3 signalvejen var involveret i TMOC-medierede anti-cancer effekter. Således som vist i fig. 6A, med stigningen i TMOC koncentration, phosphorylering af STAT3 samt ekspression af c-myc, en kendt nedstrøms mål for STAT3 [33], [34], blev dosisafhængigt undertrykt i A2780, A2780 /CDDP og SKOV3 celler, hvorimod ingen effekt på ekspressionsniveauerne af total STAT3 blev observeret.

(a) TMOC behandling inhiberede STAT3 phosphorylering og nedreguleres niveauet af c-myc på en dosisafhængig måde. (B) A2780 og A2780 /CDDP-celler blev transficeret med STAT3 konstitutivt aktiv (S3-CA) plasmid, STAT3 dominant negativ (S3 DN) plasmid eller kontrol vektor. (C) Indførelse af S3-CA signifikant blokerede anti-proliferative aktivitet af TMOC. I modsætning hertil indføres S3-DN sensibiliserede kræftcellerne til TMOC behandling. (D) TMOC inhiberede c-Src-kinase-phosphorylering og opreguleret tumoren surpressor PTEN i alle tre cellelinier, men kun opreguleret p53 i A2780-celler. β-actin blev anvendt som en lige loading kontrol. Forsøgene blev gentaget tre gange, og et repræsentativt forsøg er vist. *

s

0,05, **

s

. 0,01 sammenlignet med kontrol

For yderligere at bekræfte rolle STAT3 i TMOC-induceret cytotoksicitet, transficerede vi A2780 og A2780 /CDDP-celler med STAT3 konstitutivt aktiv (S3-CA) plasmid, STAT3 dominant negativ (S3-DN) plasmid eller kontrol vektor, henholdsvis og derefter bestemmes den anti-proliferative effekt af TMOC på de transficerede celler. Som vist i fig. 6C, indførelse af S3-CA signifikant resecued anti-proliferative effekt af TMOC. I modsætning hertil indføres S3-DN sensibiliserede cancerceller til TMOC behandling. Kollektivt antyder disse data, at TMOC kan fremkalde sin anticanceraktivitet gennem hæmning af STAT3 signalvejen.

Flere undersøgelser har vist, at den konstitutive aktivering af STAT3 ofte trigged af den ikke-receptor-tyrosinkinase c-Src og negativt reguleret af tumorsuppressorer p53 og PTEN [35], [36]. Derved undersøgte vi også, om TMOC kunne undertrykke aktivering af c-Src-kinase og modulerer ekspressionen af ​​p53 og PTEN i de tre ovarian cancer cellelinjer. Som vist i fig. 6D, fandt vi, at TMOC dosisafhængigt inhiberede phosphorylering af c-src-kinase, mens det samlede niveau af c-src forblev uændret. I mellemtiden TMOC opreguleret ekspressionsniveauerne af PTEN i alle tre cellelinier, men kun opreguleret p53 i A2780-celler.

Diskussion

I et forsøg på at udvikle hidtil ukendte kemoterapeutiske stoffer med mindre skadelige bivirkninger til behandling af cancer, naturlige produkter og deres syntetiske analoger har modtaget stor opmærksomhed [37]. For eksempel har mange undersøgelser vist, at adskillige chalcon-forbindelser, begge afledt fra naturen og syntetiske versioner, udviser cytotoksiske og antitumoraktiviteter [38]. I denne undersøgelse bestemt vi at studere anticanceraktivitet og den underliggende mekanisme af TMOC, en syntetisk chalcon forbindelse i æggestokkene cancercellelinier. Vi viste, at TMOC inhiberede proliferation og kolonidannelse af A2780, A2780 /CDDP, og SKOV3-celler (fig. 2), hvilket antyder, at TMOC kan være et effektivt kemoterapeutisk middel mod både cisplatin følsomme og resistente ovariecancerceller betydeligt. Vigtigere, fandt vi, at TMOC udviste mindre toksicitet til at pre-neoplastiske humane ovarieepitelceller end til neoplastiske celler under samme koncentration.

Vi fandt, at TMOC induceret G

0 /G

1 cellecyklus arrest gennem nedregulering af cyclin D1 og CDK4, og opregulering af p16, p21 og P27-proteiner (fig. 3C). Cyclin D1 /CDK4-komplekset er ansvarligt for cellecyklusprogression i begyndelsen G

1 fase og ofte overudtrykkes i forskellige humane carcinomer, herunder ovariecancer [39] – [41]. P16-proteinet er en specifik hæmmer af CDK-cyclin D-kompleks, hvilket forhindrer phosphoryleringen af ​​Rb og cellecyklus reentry på G

0 /G

1 fase [39]. p21 og p27, som tilhører Cip /Kip familie, negativt regulerer cellecyklusprogression via inhibering af CDK-cyclin-komplekser [42].

Apoptose er normalt et balanceret system stramt reguleret af anti-apoptotisk og pro- apoptotiske effektorer, herunder proteiner fra Bcl-2-familien. De anti-apoptotiske proteiner bcl-2 og Bcl-xL fremme celleoverlevelse henviser pro-apoptotisk protein Bax inducerer den programmerede celledød. Forholdet Bax /Bcl-2 er kritisk for induktion af apoptose og afgør, om celler vil undergå apoptose [43]. I den foreliggende undersøgelse TMOC behandling resulterede i en forøgelse af Bax men førte til faldet af Bcl-2 og Bcl-XL (Fig. 4E). Stigningen af ​​Bax /Bcl-2-forholdet 0,07-1,90 kan være ansvarlig for samtidig apoptose på grund af forstyrrelser af mitokondrielle membran potentiale og inaktivering af vigtige cellulære proteiner såsom PARP-1.

Akkumulerende undersøgelser tilvejebringe stærke beviser, at aktiveringen STAT3 er blevet forbundet med en lang række tumorer, herunder myelomatose, ovariecancer, brystcancer, prostatacancer, og så videre [44]. Således har suppression af STAT3 signalvejen dukket op som en effektiv måde til cancerterapi. I vores nuværende undersøgelse, hvis resultater fra Western blots viste, at phosphorylering af STAT3 og dets opstrøms proteintyrosinkinaser c-Src (fig. 6A og 6D) blev inhiberet af TMOC, som også blev støttet af nedreguleringen af ​​transkriptionelt reguleret mål såsom cyclin D1, Bd-xL og c-myc [33]. Desuden har vi fundet, at TMOC kunne opregulere ekspressionen af ​​PTEN i alle tre cellelinier, men kun opreguleret ekspression af p53 i A2780-celler. Selv er p53 rapporteret til negativt regulere phosphorylering og DNA-bindingsaktivitet af STAT3 ved at lette tumor suppressor PTEN [36], [45], viste vores data, at TMOC fremkaldte anti-spredning funktion og inhiberede phosphorylering af STAT3 uanset p53-status, hvilket kan indikere, at anti-cancer aktivitet TMOC er p53-uafhængig.

som konklusion, vi giver stærke beviser for, at TMOC hæmmer cellevækst og motilitet, og inducerer cellecyklusstop og apoptose af humane ovariecancerceller gennem undertrykke STAT3 og c-Src aktivering. Imidlertid kan yderligere undersøgelse være nødvendig for at validere den potentielle anvendelse af TMOC i kræftbehandling.