PLoS ONE: Novel CCL21-Vault nanokapsel intratumoral Levering Forhindrer lungekræft Growth

Abstrakt

Baggrund

Baseret på vores prækliniske resultater, vi vurderer effekten af ​​intratumoral injektion af dendritiske celler (DC ) transduceret med en adenovirusvektor der udtrykker den sekundære lymfoide chemokin (CCL21) gen (Ad-CCL21-DC) i et fase i forsøg i fremskreden ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Mens denne tilgang viser immun ekstraudstyr, udarbejdelse af autologe DC for CCL21 genetisk modifikation er besværligt, dyrt og tidskrævende. Vi evaluerer en ikke-DC tilgang, som udnytter hvælving nanopartikler til intratumoral CCL21 levering til mægle antitumoraktivitet i lungekræft.

vigtigste resultater

Her beskriver vi, at hvælving nanokapsel platform for CCL21 levering fremkalder antitumoraktivitet med vækstinhibering lungekræft. Vault nanokapsel pakket CCL21 (CCL21-hvælvinger) viste funktionelle aktivitet i kemotaktiske og antigenpræsentationsaktiviteten analyser. Rekombinante hvælvinger påvirket kemotaktisk migration af T-celler, og denne virkning var overvejende CCL21 afhængig som CCL21 neutralisering ophævede CCL21 medieret forbedring i kemotaksi. Intratumoral administration af CCL21-hvælvinger i mus med lungekræft forbedrede leukocytiske infiltrater (CXCR3

+ T, CCR7

+ T, IFNy

+ T-lymfocytter, DEC205

+ DC), hæmmet lungekræft tumorvækst og reducerede hyppigheden af ​​immunsuppressive celler [myeloide afledte suppressorceller (MDSC), T regulerende celler (Treg), IL-10 T-celler]. CCL21-hvælvinger inducerede systemiske antitumor svar ved at øge milt T-celle lytisk aktivitet mod forældrenes tumorceller.

Betydningen

Denne undersøgelse viser, at hvælvingen nanokapsel effektivt kan levere CCL21 at opretholde antitumoraktivitet og hæmmer lunge cancervækst. Den hvælving nanokapsel kan fungere som en “off the shelf” tilgang til at levere antitumor cytokiner til at behandle en bred vifte af maligniteter

Henvisning:. Kar UK, Srivastava MK, Andersson Å, Baratelli F, Huang M, Kickhoefer VA et al. (2011) Novel CCL21-Vault nanokapsel intratumoral Delivery Hæmmer Lung Cancer Growth. PLoS ONE 6 (5): e18758. doi: 10,1371 /journal.pone.0018758

Redaktør: Siyaram Pandey, University of Windsor, Canada

Modtaget: December 21, 2010; Accepteret: 9 Marts 2011; Udgivet: May 3, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en University of California Discovery Grant (til LHR og VAK) en Jonnson Comprehensive Cancer Center Fellowship til UKK) og ved national Institutes of Health Tilskud (RO1 CA95686 og RO1 CA126944), University of California Los Angeles Lung Cancer Program, Department of Veterans Affairs Medical Research Funds og tobaksrelaterede sygdomme Program Award Program for University of California (15RT-0207). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA og resten af ​​verden [1]. Til dato med de eksisterende former for terapi, den samlede overlevelse på lang sigt er kun 15%. Således er der behov for nye terapeutiske strategier. Vi evaluerer en ny hvælving nanokapsel som en proof of concept for levering af immun forstærkende cytokiner for en “off the shelf reagens” for immun terapi for lungekræft.

Vaults er cytoplasmatiske allestedsnærværende ribonucleoprotein partikler først beskrevet i 1986 [2]. Native hvælvinger er 12,9 ± 1 MDA ægformede kugler med overordnede dimensioner på ca. 40 nm i bredden og 70 nm i længden [3], [4], til stede i næsten alle-eukaryote organismer med mellem 10

4 og 10

7 partikler per celle [5]. På trods af deres cellulære overflod, hvælving funktion forbliver undvigende selv om de har været forbundet med mange cellulære processer, herunder medfødte immunreaktion, multilægemiddelresistens i cancerceller, mangeartede signalveje, og intracellulær transport [6].

Som naturligt forekommende nanokapsel, kan hvælvingen partikel være en ideel struktur til ingeniør som et terapeutisk system for forbindelse indkapsling, beskyttelse, og levering. Hvælvinger er yderst stabile strukturer

in vitro Salg, og en række undersøgelser viser, at partiklerne er ikke-immunogen [7]. Hvælvinger kan konstrueres og udtrykkes under anvendelse af et baculovirus-ekspressionssystem og heterologe proteiner kan indkapsles inde i disse rekombinante partikler ved anvendelse af et protein-targeting domæne betegnes INT til hvælving Interaction. Adskillige heterologe proteiner er blevet fusioneret til INT-domænet (f.eks fluorescerende og enzymatiske proteiner), og disse fusionsproteiner når pakkes i de rekombinante hvælvinger, bevarer deres oprindelige egenskaber, og således give nye vault egenskaber [8], [9].

CCL21 er blevet identificeret som en lymfoid kemokin, der overvejende og konstitutivt udtrykt af højendotelvenoler i lymfeknuder og peyerske plaques, lymfekar og stromale celler i milt og appendiks [10]. CCL21 binder til kemokinreceptoren CCR7 og er en kemoattraktant for modne dendritiske celler (DC), naive og memory-T-celler [11], [12]. Dette kemokin, sammen med CCL19, er påkrævet for normal lymfevæv organisation, der i sidste ende er afgørende for en effektiv T-celle-DC-interaktioner. Naturlig killer (NK) og naturlige killer T (NKT) antitumor effektorer udtrykker også CCR7 receptor og er kemo tiltrukket af CCL21. Anvendelsen af ​​kemokiner at tiltrække DC, lymfocyt, NK og NKT effektorer i tumorer kan tjene som en effektiv antitumor-strategi. Baseret på dette koncept, har vi tidligere vist, at intratumoral administration af rekombinant CCL21 reducerer tumor byrde i murine lungekræft modeller [13]. Antitumoraktiviteten induceret af rekombinant CCL21 kræves imidlertid høj og hyppig dosering, fordi proteiner administreres intratumoralt ikke tilbageholdes lokalt i længere perioder. Selv om disse undersøgelser afgrænset rolle CCL21 som et effektivt antitumormiddel, er hyppig højdosis intratumoral administration klinisk begrænsende med potentialet i unødvendig systemisk toksicitet. Baseret på de begrænsninger af denne tilgang, vi undersøgte brugen af ​​DC til intratumoral CCL21 levering [14], [15]. I prækliniske undersøgelser viste vi, at intratumoral administration af CCL21 gen modificeret DC førte til udryddelse tumor i murine lungekræft modeller. Efter vores indledende beskrivelse af antitumor aktiviteter af CCL21 har adskillige grupper rapporteret, at CCL21 har potente antitumor egenskaber i en række modelsystemer [16], [17], [18], [19], [20]. I alle modeller, CCL21 demonstrerede potent regression af tumorer, som blev vist at være afhængig af vært T-celle immunitet.

Baseret på omfattende præklinisk evaluering, begyndte vi en NCI finansieret klinisk forsøg for et år siden at vurdere intratumoral injektion af DC transduceret med en adenoviral vektor, der udtrykker CCL21 genet (Ad-CCL21-DC) i et fase i forsøg i fremskreden ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [21]. Mens vores kliniske forsøg med intratumoral administration af CCL21 gen modificeret DC viser immun ekstraudstyr, udarbejdelse af CCL21 udtrykke autolog DC er besværlig, dyrt og tidskrævende. En effektiv off-the-shelf reagenset vil lette evalueringen af ​​dette chemokin-baseret behandling. Mod at nå dette mål, er vi evaluere en ikke-DC tilgang, som udnytter hvælving nanopartikler til intratumoral CCL21 levering med henblik på at indlede antitumor immunreaktioner i lungekræft. Vi forventer, at brugen af ​​hvælving nanopartikler vil omgå autologe DC forberedelse, minimere batch til batch variation og give mulighed for sammenlignelighed og standardisering. Desuden vault nanopartikler manipuleret til at frigive CCL21 kan anvendes til at behandle en bred vifte af maligniteter.

I denne undersøgelse evaluerede vi effekten af ​​hvælving nanokapsel levering af CCL21 på væksten af ​​Lewis Lung (3LL) tumorer

in vivo

. Vores resultater viser, at en enkelt intratumoral administration af CCL21-hvælving nanokapsler rekrutterer antitumor effektorer, inducerer potent antitumoraktivitet og hæmmer tumorvækst.

Materialer og Metoder

Rekombinante Vaults

CCL21 cDNA blev fusioneret i ramme til enten INT eller mCherry-INT [22]. Murint CCL21 blev PCR-amplificeret med primerne: CCL21- fremad GCGCGGATCCCCATGGCTCAGATGATG og CCL21- vende GCGCAGATCTTCCTCTTGAGGGCTGTGTCTG. Til dannelse mCCL21-mCherry-INT i pFastBac, blev oprenset CCL21 PCR-produkt spaltet med BamH1 og Bg I og ligeret til BamH1 phosphatase behandlet mCherry-INT pFastBac. Menneskelig CCL21 blev PCR-amplificeret med primerne: CCL-21 F-Spel CCCCACTAGTC CAGTTCTCAGTCACTGGCTCTG, CCL-21-Nhel CCCCGCTAGCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTG, INT med NheI CCCCGCTAGCTGCACACAACACTGGCAGGA, INT med Xhol GGGGCTCGAGTTAGCCTTGACTGTAATGGA at danne hCCL21-INT. Rekombinante (r) baculovirusser blev dannet som beskrevet [7]. Sf9-celler blev inficeret med mCCL21-mCherry-INT, hCCL21-INT eller CP-MVP koder baculovira ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 0,01 i 65 timer. De inficerede celler blev fremstillet som beskrevet [7]. Lysater indeholdende CP-MVP hvælving blev blandet med lysater indeholdende mCCL21-mCherry-INT eller hCCL21-INT og blev inkuberet på is i 30 minutter for at tillade de INT fusionsproteiner at emballere indersiden af ​​hvælvinger. Hvælving blev oprenset som beskrevet [8], resuspenderet i sterilt PBS og proteinkoncentration bestemt ved BCA-assay (Bio-Rad, CA). Prøveintegritet blev analyseret ved negativ farvning elektronmikroskopi eller Coomassie-farvning af SDS-PAGE efterfulgt af Western blot analyse. CCL21-INT protein i hvælvingen blev kvantificeret ved densitometrisk analyse af Western blots mod renset rekombinant INT protein som standard.

Antistoffer

Primære antistoffer til Western blot analyser var kanin-anti-MVP-antistof (1 /1000-fortynding) [23] eller kanin-anti-VPARP antistof (1/500 fortynding) [24] og sekundært gede-anti-kanin-HRP-antistof (1:2000 fortynding) (Amersham). Den CCL21 og CXCR3 (220.803) mAb var fra R Middelværdi ± SEM, * p 0,05 mellem mCCL21-hvælvinger og kontrol hvælvinger eller anti-CCL21 antistof behandlingsgrupper. B. mCCL21-hvælvinger forbedret DC APC aktivitet og blokerer CCL21 vendt stigningen i APC-aktivitet. B3Z celler (1 x 10

5 celler /200 pi /brønd) blev co-dyrket med DC 2,4 (5 x 10

4 celler /200 pi /brønd) og ovalbumin (350 ug /ml) i nærvær eller fravær af mCCL21-hvælvinger (200 ng /ml) og anti-CCL21 antistof (5 ug /ml) eller kontrol-antistof (5 ug /ml gede-IgG) i 24 timer. Kontrol- hvælvinger blev anvendt ved en koncentration på 200 ng /ml. T-celleaktivering status blev målt ved IL-2-produktion ved ELISA. Data er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter. Bars; Middelværdi ± SEM, * p. 0,05 mellem mCCL21-hvælvinger og kontrol hvælvinger eller anti-CCL21 antistof behandlingsgrupper

CCL21-hvælvinger forbedre rekrutteringen af ​​leukocytiske infiltrater og hæmme 3LL tumorvækst

Vi bestemt antitumoraktivitet mCCL21-hvælvinger på etablerede 3LL tumor

in vivo

. En enkelt intratumoral injektion af mCCL21-bankbokse (200 ng) medførte signifikant fald i tumorvækst i forhold til tomme bankbokse (Fig. 3A). Den mCCL21-hvælving behandlingsgruppen viste forbedret intratumorale leukocytiske infiltrater i forhold til kontrol hvælvinger (fig. 3B) og immun farvning viste, at de infiltrater overvejende var CD3 udtrykker T-celler (fig. 3C nederste højre panel). Den antitumor effekt af mCCL21-hvælvinger blev bestemt i 7-dages etableret ortotopisk 3LL lungekræft model. mCCL21-hvælvinger hæmmede tumor byrde med 7-gange sammenlignet med kontroller (Fig. 4A-B). I kontrolgruppen behandlingsgrupper (fortyndingsmidler eller kontrol hvælving), der var 7-9% fald i den gennemsnitlige kropsvægt ved slutningen af ​​den eksperimentelle varighed, men blev ikke observeret nogen signifikant vægtændring i CCL21-hvælving behandlingsgruppe. En evaluering af intratumorale leukocytiske populationer viste forøget frekvens af CD4, CD8, CD3 CXCR3, CD3 CCR7 og DEC205 men mindre hyppig MDSC og tregs (fig. 4C).

A. CCL21-hvælvinger inhiberede tumorvækst og forbedrede intratumoral T-celle infiltrater i lungekræft. C57BL /6 mus med 9 dages 3LL etablerede tumorer (

s.c.

) Blev behandlet intratumoralt med kontrol bankbokse (200 ng), mCCL21-bankbokse (200 ng) eller fortynder normalt saltvand (NS). Gennemskærende tumordiametre blev målt med passere. B-C. mCCL21-hvælvinger øget tilstrømningen af ​​CD3 udtrykkende T-celler i tumoren sammenlignet med kontroldyr hvælvinger. UBC-GFP /BL6 mus med 9 dages etablerede tumorer blev behandlet intratumoralt med kontrol hvælvinger eller mCCL21-hvælvinger. Oktober frosne væv blev sektioneret, fikseret på objektglas og modfarvet med nuklear farvestof DAPI (blå). Kontrol tumorer (

toppanelet

) demonstrere meget begrænset grøn fluorescens (infiltrerende celler) under en high-power visning (forstørrelse, × 400). De fleste grønne fluorescerende celler er store polygonale stromale celler, mens tumorceller modfarvet blue af DAPI. Immunfarvning for T-celler viser meget få CD3 udtrykkende T-lymfocytter (øverste højre panel). I modsætning hertil fremtrædende tumorinfiltrerende lymfocytter, små runde grønne fluorescerende celler er tydelig i tumorer fra mCCL21-hvælving-behandlede mus (pil,

bundpanelet Salg). Immunfarvning for T-celler viser, at infiltrater er CD3 udtrykkende T-celler (nederst til højre). data; Middelværdi ± SEM, * p 0,05 mellem mCCL21-hvælving og kontrolgruppe, n = 10 mus /gruppe

5 × 10

3 3LL-GFP tumorceller blev injiceret i venstre lunge. via transtorakal rute. En uge efter tumor injektioner blev musene behandlet med fortyndingsmiddel (NS), kontrol hvælvinger (2 ug) eller mCCL21-hvælvinger (2 ug) via transtorakal rute i venstre lunge. Dag 28 efter tumorimplantation blev lunger høstet til analyse af tumorbyrde og leukocytiske infiltrater. A. H 0,05 mellem CCL21-hvælvinger og kontrol hvælving grupper, n = 10 mus /gruppe

CCL21-hvælvinger øge tumor infiltrerende T-celler med forbedret IFNy men reducerede IL. -10 og forøge systemisk T-celle cytolytisk aktivitet

Tumor T lymfatisk infiltrerer fra mCCL21-hvælving behandlede mus havde øget intracytoplasmatisk IFNy og reducerede IL-10 (fig. 4D-E). Intratumoral mCCL21-hvælvinger induceret systemisk antitumor immun aktivitet:. Milt-T-celler fra mCCL21-hvælving behandlede mus havde augmented lytisk aktivitet mod forældrenes tumorceller

in vitro

(. Figur 4F)

Diskussion

Vi har tidligere vist, at intratumoral rekombinant CCL21 eller CCL21 gen modificeret DC fremkalde en T-celle tumor reduktion i murine modeller af lungekræft [13], [14], [15], [28], [29]. Baseret på omfattende præklinisk modellering, har vi oversat vores intratumoral DC-AdCCL21 tilgang til behandling af fremskreden lungekræft i et klinisk fase I studie. Selvom de første resultater af dette forsøg tyder immun ekstraudstyr, er vi evaluere CCL21 gennemførelsesmekanismer, der vil fjerne behovet for at isolere og kultur autolog DC. Til dette formål evalueret vi CCL21-hvælving nanokapsler som en “off the shelf” terapeutisk platform mod tumorvækst

in vivo

udnytte den velkarakteriserede 3LL kræft model. Vores begrundelse for administration af intratumorale CCL21-hvælving nanokapsler er at fremme rekrutteringen af ​​T-lymfocytter og DC ind i tumoren mikromiljø for et robust antitumoraktivitet.

Som et naturligt forekommende, ikke-immunogen, protein-baserede nanoskala kapsel, hvælvingen partikel har potentialet til at fungere som en fleksibel terapeutisk leveringsvehikel. Udviklet i baculovirus systemet, partikel selv-samler fra en enkelt udtrykt protein, som kan modificeres til at tillade celle målretning specifik endocytose og endosom penetration [7], [8], [9], [30]. Proteiner og peptider fusioneret til en hvælving målretningsdomæne er pakket i partiklen, beskyttet mod det eksterne miljø og frigives langsomt. Dette er den første undersøgelse til at beskrive denne hvælving nanokapsler kan manipuleres til at gruppere og fastholde biologisk aktivt CCL21. Vores resultater viser, at selv om tomme hvælvinger og rCCL21 hver kemotaktiske, emballering chemokinet i hvælving synergistisk forbedret T-celle migration, hvilket tyder på, at den vedvarende frigivelse af CCL21 af hvælvingen partikel kan etablere en stejl kemotaktiske gradient. Neutraliserende antistoffer mod CCL21 ophævede den kemotaktiske aktivitet af CCL21-hvælving påviser, at den kemotaktiske aktivitet var overvejende CCL21 afhængig. Baseret på resultaterne af kemotaktiske eksperimenter, vi evaluerede virkningen af ​​CCL21-hvælvinger på DC APC aktivitet. CCL21-hvælvinger augmented DC APC aktivitet og neutralisering af CCL21 ophævede denne aktivitet. I forhold til rCCL21, CCL21-hvælvinger stimuleret DC APC aktivitet til højere niveauer på en tiendedel af koncentrationen af ​​rCCL21, hvilket tyder på en større DC affinitet for CCL21-hvælving nanokapsel.

Baseret på vores

in vitro

resultater, CCL21-hvælvinger blev evalueret i et terapeutisk lungekræft model

in vivo

. Vores resultater viser, at hvælvingen design er effektiv til at hæmme væksten af ​​etablerede tumorer. En enkelt intratumoral injektion af CCL21-hvælvinger medførte signifikant hæmning i tumorvækst i forhold til kontroller. Vores data tyder på, at CCL21-hvælving formulering er lige så effektiv i sammenligning med de hyppige høje doser af rCCL21 [13]. I begge de subkutane og ortotopisk lunge tumor modeller CCL21-hvælving terapi blev administreret intratumoralt. I fremtidige studier, når de evaluerer effekten af ​​specifikke ruter hvælving nanocaspsules vaccination tumor antigen i de beskyttende og terapeutiske indstillinger, der omfatter

iv

eller

ip

levering ruter, ændringer i plasma /serum transaminase niveauet vil være kvantificeres for hvælving effekter på leverfunktionen. Selv i migration assay, kontrol- hvælvinger demonstrerede kemotaktisk aktivitet, havde kontrol hvælvinger ikke påvirke tumorvækst sammenlignet med fortyndingsmidler behandlingsgruppe. Dette antyder, at CCL21 er den kritiske komponent i hvælving nanokapsel til induktion af antitumoraktivitet. I det fremtidige arbejde vil vi screene både de pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner i tumorerne at bestemme ændringer i respons på CCL21-hvælving nanokapsel terapi til mekanistisk udforske de apoptotiske programmer induceret af denne terapi.

In vivo

, humane CCL21 indeholdende hvælvinger var lige så effektivt som det murine CCL21-hvælving reducere 3LL tumorvækst (data ikke vist). I forhold til kontrol, CCL21-hvælving behandling resulterede i omfattende tumor T og DC leukocytiske infiltrater.