PLoS ONE: Hurtig KRAS, EGFR, BRAF og PIK3CA Mutation Analyse af Fin Needle aspirater fra ikke-småcellet lungekræft Brug allel-specifik qPCR

Abstrakt

endobronchiale Ultrasound Guided transbronkial Needle Aspiration (eBUS-TBNA ) og Trans-esophageal Ultralyd scanning med fin nål aspiration (EUS-FNA) er vigtige, nye teknikker til diagnosticering og iscenesættelse af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), der er indarbejdet i lungekræft mellemstationer retningslinjer. For at vejlede og optimere behandling beslutninger, især for NSCLC patienter i stadium III og IV,

EGFR

KRAS

mutation status er ofte påkrævet. Konkordansen satsen for mutationsanalyse mellem disse cytologiske udsugninger og histologiske prøver opnået ved kirurgisk stadieinddeling er ukendt. Derfor studerede vi i hvilket omfang allelspecifik kvantitativ realtids-PCR med hydrolysebetingelser prober kan pålideligt udført på eBUS og EUS fine needle aspirater ved at sammenligne resultaterne med histologisk materiale fra den samme patient. Vi analyserede en serie af 43 NSCLC-patienter, for hvem cytologisk og histologisk materiale var tilgængelig. Vi viste, at disse standard molekylære teknikker kan påføres nøjagtigt på fine needle cytologiske aspirater fra NSCLC-patienter. Vigtigt er det, viser vi, at alle mutationer detekteret i histologiske materiale af primær tumor også blev identificeret i de cytologiske prøver. Vi konkluderer, at molekylær profilering kan opgøres pålideligt udføres på fine nål cytologi aspirater fra NSCLC patienter

Henvisning:. Van Eijk R, Licht J, Schrumpf M, Talebian Yazdi M, Ruano D, Forte GI, et al. (2011) Hurtig

KRAS

,

EGFR

,

BRAF

PIK3CA

Mutation Analyse af Fin Needle aspirater fra ikke-småcellet lungekræft Brug allel-specifikke qPCR. PLoS ONE 6 (3): e17791. doi: 10,1371 /journal.pone.0017791

Redaktør: Ralf Krahe, University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: 26 oktober, 2010; Accepteret: 11 Februar 2011; Udgivet: 8 mar 2011

Copyright: © 2011 van Eijk et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Leiden University Medical center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til dødelighed af kræft i den vestlige verden [1]. Til kliniske og terapeutiske formål, er lungekræft traditionelt opdelt i småcellet (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Henviser SCLC behandles ved kemo- og /eller stråleterapi, er NSCLC primært behandles gennem resektion; dog kun 30% af NSCLC patienter har en resektabel sygdom (fase I /II) på tidspunktet for præsentationen [2]. Dette understreger vigtigheden af ​​præcise, præoperativ mediastinal iscenesættelse at forebygge unødvendige resektioner. Præoperativ iscenesættelse kan udføres gennem transbronkial (eBUS-TBNA) eller transesophageal (EUS-FNA) aspiration af de mediastinale lymfeknuder. Disse cytologiske procedurer er mindre invasive end rutinemæssig mediastinoscopy efterfulgt af biopsi af lymfeknuder, men [3] lignende høj specificitet og følsomhed – [9] er opnået. Endosonography er indarbejdet i lungekræft mellemstationer retningslinjer som et alternativ til den kirurgiske iscenesættelse af mediastinum [10], [11].

I mange tilfælde den øgede brug af disse minimalt invasive teknikker er tilstrækkelig til at diagnosticere og iscenesætte patienten korrekt. Selvom mængden af ​​cellulært materiale opnået ved disse procedurer er relativt lille, er det af klinikere ønskede oplysninger hastigt voksende, fx for NSCLC, immunhistokemi og molekylær patologi er blevet en del af standard pleje [12].

Ud over denne ændring i mellemstationer procedurer, har den hurtige udvikling af nye medicinske behandlinger for NSCLC-patienter fundet sted. En undergruppe af NSCLC kræftformer kan harbor en aktiverende mutation i EGFR kinasedomænet [13]. Tumorer med disse mutationer er ofte følsomme over for tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er). På den anden side, aktiverende mutationer i

KRAS

er forbundet med resistens over for TKI’er. Selv om de fleste publikationer rapporterer, at disse mutationer udelukker hinanden [14] – [19], tyder [20], at en tumor samtidig kan harbor et aktiverende

EGFR

mutation og mutationer nedstrøms i vejen i

KRAS

gen, hvilket betyder, at opstrøms inhibering af EGFR får ingen terapeutisk virkning i disse tilfælde. Også mutationer i

BRAF

PIK3CA

er rapporteret i NSCLC. Dog kræves yderligere forskning for at afgøre, i hvilket omfang disse mutationer kan have konsekvenser for behandling [21], [22].

På grund af denne udvikling og ønsket af patienter og klinikere til at minimere forsinkelsen af ​​behandlingen er der behov for hurtige og følsomme molekylære teknikker. Fortrinsvis bør disse teknikker kunne anvendes på formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) cytologiske prøver [23] – [25], fordi eBUS-TBNA og EUS-FNA aspiration prøver er ofte det første materiale, der er erhvervet fra patienter med NSCLC. Allel-specifik kvantitativ real-time PCR (qPCR) med hydrolyseprodukterne sonder er en pålidelig og følsom teknik, der kan anvendes til dette formål. Afsløring mutationer i

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

med hydrolyse sonder er blevet beskrevet tidligere i NSCLC patienter [23] – [26 ]. Følsomheden af ​​analyserne overgår også følsomheden forslaget sæt 1% for

KRAS

mutation test [27].

De fleste af

EGFR

mutationer er p.L858R den hotspot mutation i exon 21 og udeladelser i exon 19, som indberettes til udgøre op til 36% af alle aktiverende mutationer [15], [28].

KRAS

er muteret i 10% -30% af lungecarcinomer og over 95% af alle aktiverende mutationer i

KRAS

er placeret i exon 1 (codoner 12 og 13) [28], [ ,,,0],29].

BRAF

p.V600E hotspot mutation er rapporteret hos 3% af NSCLC og ændrer rester vigtige i AKT-medieret BRAF fosforylering, hvilket tyder på, at afbrydelsen af ​​AKT-induceret BRAF hæmning spiller en rolle i malign transformation [28] , [30]. Tre hotspot mutationer i

PIK3CA

kan være en anden årsag til over-aktivering af PI3K-AKT pathway, der fremmer den maligne transformation af humane luftvejs-epitelceller og er blevet rapporteret hos ca. 4% af lungecarcinomer [28 ], [31].

i den aktuelle undersøgelse, vi sammenlignet allel-specifikke qPCR assays til den hyppigste aktiverende mutationer i

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

og

PIK3CA

i tumor-positive fin nål cytologiske aspirater mod histologisk materiale af primære tumorer.

med denne tilgang, vi har til formål at bestemme, i hvilket omfang allelspecifik qPCR med hydrolysebetingelser prober kan udføres på cytologisk aspiration materiale ved sammenligning af mutation status og derefter observere konkordansen sats mellem cytologiske og histologiske materiale og mellem primære tumorer og metastaser.

materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

specifik behov for etiske udvalg godkendelse var ikke nødvendig for denne undersøgelse. Alle prøver blev håndteret i overensstemmelse med de medicinske etiske retningslinier, der er beskrevet i kodeksen Korrekt sekundær anvendelse af humant væv etableret af det hollandske Federation of Medical Sciences (www.federa.org, tilgås 27 oktober 2010). Følgelig til disse retningslinjer al menneskelig materiale anvendt i denne undersøgelse er blevet anonymiseret siden kliniske data ikke blev anvendt. På grund af denne anonymisering procedure enkelte patienters tilladelse ikke er nødvendig.

Sample valg

Materiale fra 43 patienter med NSCLC, for hvilke både tumor-positive cytologiske og histologiske materiale blev tilgængelig blev udvalgt fra Institut Patologisk i Leiden University Medical center (LUMC) og identificeret gennem en PALGA databasesøgning; ikke-gynækologiske cytologiske prøver mellem 2005 og 2009 blev ransaget ved hjælp af søgning-strenge “lunge, maligne celler og ikke-småcellet lungekræft” og “mediastinum, maligne celler og ikke-småcellet lungekræft”. Fra de 447 unikke cytologiske prøver, valgte vi tilfælde, hvor tumor-positive histologisk materiale af den primære tumor var også tilgængelig (Supplerende tabel S1). Af de 43 patienter, blev 33 patienter subtyped: 14 planocellulært karcinom, 15 adenocarcinomer, 3 adenosquamøst carcinomer og en stor celle carcinom. De resterende 10 patienter var blevet klassificeret NSCLC kun.

DNA fra 42 kontrol FFPE prøver blev opnået fra sektionen Molekylær Diagnostik (MD) på Patologisk Institut i LUMC. Til validering, en serie af 10 DNA-prøver, heraf 9 havde en påvist

EGFR

exon 19 sletning ved DNA-sekventering, blev leveret af Holland Cancer Institute -. Anton van Leeuwenhoek Hospital

DNA-isolering

Før DNA-isolering, blev tumorceller beriget til opnåelse tumorcellelinier procentdele 70% (figur 1). De FFPE tumorblokke blev beriget for tumorceller styret af en hematoxylin og eosin (H . E slide og de tilsvarende tumor felter på de hæmatoxylin slides blev mikrodissekeres

mikroskopisk detalje af en cytologisk smear opnået gennem fin nål aspiration af en meadiastinal lymfeknude fra en NSCLC patient. Tumoren foci er markeret på bagsiden af ​​hvert dias med en diamant spids. Efterfølgende dækglassene fjernes, og tumorfoci skrabes fra slide under anvendelse af en skalpel (ikke vist).

I de cytologiske smears, microdissection blev initieret ved at markere tumorfoci med en diamant nål på bagsiden af ​​Giemsa-farvede dias. Efterfølgende blev dækglas fjernedes ved inkubation i xylen ved stuetemperatur i separate 50-ml rør for at undgå forurening. Inkubation blev udført natten eller indtil dækglasset blev fjernet (undertiden op til en uge). Efterfølgende blev objektglassene vasket i alkohol, tre gange i 100%, en gang i 70% og en gang i 50%, at rehydrere vævet. Ved hjælp af en skalpel, blev tumoren brændpunkter fra de markerede områder skrabet og opsamles i mikro rør til DNA isolation.

DNA blev isoleret ved hjælp af NucleoSpin Tissue XS Genomisk DNA Purification Kit (Machery-Nagel, Duren, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Det gennemsnitlige DNA Udbyttet fra de cytologiske udstrygninger og celle blokke var 282 ng og 280 ng hhv. Imidlertid blev cytologi udstrygninger fikseret under anvendelse af methanol i stedet for formalin, så det isolerede DNA forventedes at være af højere kvalitet. Den gennemsnitlige DNA Udbyttet fra biopsierne var betydeligt højere (985 ng).

Før analyse blev DNA-prøverne fortyndet med 5 eller 15 gange. Vi observerede, at DNA fortyndet over 15 gange generelt gav en kvantificering cyklus (Cq) 35 (data ikke vist); derfor i de efterfølgende analyser, vi brugte 5 × lager DNA fortyndinger i sterilt vand.

Mutation afsløring

De assays til påvisning af syv forskellige

KRAS

, tre

PIK3CA

en

BRAF

variant blev opnået gennem Custom TaqMan® Assay design Tool (Applied Biosystems, Nieuwerkerk a /d IJssel, NL). Hydrolyse sonder blev designet med mindre lund bindemiddel (MGB) ændringer i 3′-enden. Disse modificerede prober har den fordel, at relativt korte prober kan designes med højere smeltetemperatur (Tm) og øget duplex stabilitet og specificitet sammenlignet med konventionelle sonder [32].

EGFR

analyser blev beskrevet tidligere [33]. qPCR reaktioner blev udført i 10-pi reaktioner indeholdende 5 pi FastStart Universal Probe Master (Roche Applied Science), 1 pi 10 × primer og hydrolyse probeopløsninger, 2 pi af 5 x fortyndet DNA og 2 pi sterilt vand i en forseglet LightCycler 480 flerbrøndsplade 384 (Roche Applied Science) i en LightCycler 480-system (Roche Diagnostics) som følger: 10 minutter ved 95 ° C og 45 cykler af 15 sekunder ved 92 ° C, 60 sekunder ved 60 ° C og 10 sekunder ved 72 ° C. For validering, udførte vi direkte Sanger sekventering hjælp M13 primere som tidligere [34] beskrives ved sekventering kernen i Leiden Genome Technology Center. Primersekvenser er opført i Supplerende tabel S2. Alle DNA-sekventering blev afsluttet den kendte gener og ingen nye sekventering blev afsluttet.

Rå data fra LC480 software blev importeret til en Microsoft Excel 2003-regneark in-house-skabt til at definere mutationen status. Kvantificeringen cyklus (Cq) anvendtes til vurdering og prøver kvalitet med CK værdier overstiger 35 (Cq 35) i vildtype-kanal blev afvist samt udelukket for videre analyser. At bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af en mutation, endepunktet fluorescensforholdet R

m /R

wt blev beregnet efter subtraktion af gennemsnitlige baggrundssignal fra tre negative kontroller. Regnearket er til rådighed efter anmodning. For

BRAF

,

PIK3CA

EGFR

p.L858R, mutation status blev direkte diskrimineret (figur 2a). Mutationer blev identificeret, da R

m /R

vægtforhold var højere end 0,7, mens et forhold lavere end 0,3 viste fraværet af en mutation. blev ikke observeret nogen mellemliggende værdier. I

KRAS

vildtype prøver, en øget signal baggrund blev observeret for c.34G T (R

m /R

wt ± 0,4) og c.38G C (R

m /R

wt ± 0,6) assay i mutant sonde kanal. Dette var sandsynligvis forårsaget af ufuldstændige hybridisering af disse prober til vildtype-allelen. Indstillingen til at identificere mutationen korrekt var c.34G TR

m /R

wt 0,7, mens c.38G T mutant blev identificeret, når en R

m /R

vægtforhold afskæring på 0,8 blev anvendt.

EGFR

exon 19 sletning sonde resulterede i et fald i endpoint fluorescens, mens i en prøve vildtype begge sonder gav et signal. At analysere

EGFR

exon 19 sletninger, R

m /R

wt 0,8 og Cq 32 blev betragtet som vildtype og R

m /R

wt≤0.6 og Cq 32 angivet en sletning. Mellemliggende værdier, med R

m /R

vægt forholdet mellem 0,6 og 0,8 og Cq 35, kræves bekræftelse ved hjælp af Sanger sekventering

Panel A viser EGFR p.L858R analysen.. Alle prøver viser en vildtype (kontrol) signal, VIC, nedre panel (grøn og blå linjer), mens kun gruppe 2 (blå linie) viser en mutant FAM signal. Panel B viser EGFR exon 19 mutation assay. Det nederste panel viser vildtype VIC-signalet for alle prøver (rød, grøn og lilla poster). De øverste paneler viser mutanten FAM-signalet. Gruppe 1 (røde linjer) viser vildtype signal, gruppe 2 (rød og lilla) viser mulige mutanter med nedsat fluorescens, gruppe 3 (grøn linie) viser en næsten helt forsvundet signal indikerer en sletning. Billederne fås fra LC480 softwareversion 1.5.0. Y-aksen viser den relative fluorescens for FAM (465-510 nm) og Victoria (533-580nm) sonder, x-aksen viser de PCR-cykler.

Resultater og Diskussion

assay design og validering

for

BRAF

, en enkelt assay er designet, der registrerer den aktiverende hotspot mutationen p.V600E, der følger af c.1799T en substitution [35]. For

PIK3CA

, vi designet prober for de tre mest almindelige udskiftninger [36]: c.1624G A (p.E542K), c.1633G A (p.E545K) og c.3140A G ( p.H1047R). Selv om disse tre analyser opdaget over 85% af alle mutationer i NSCLC, blev nogle af de sjældne udskiftninger i hotspot områder potentielt savnet. For

KRAS

, vi designet analyser for de syv hyppigste basepar substitutioner i codon 12 og 13: c.34G A (p.G12S), c.34G C, (p.G12R), c .34G T, (p.G12C), c.35G A, (p.G12D), c.35G C, (p.G12A), c.35G T (p.G12V) og c.38G A (p.G13D). Tilsammen udgør disse analyser opdage næsten alle udskiftninger i

KRAS

, selv om nogle sjældne varianter kan blive savnet. At påvise p.L858R hotspot og exon 19 sletninger i

EGFR

vi brugte tidligere rapporterede analyser [33].

EGFR

p.L858R mutation blev påvist under anvendelse af en probe-blanding indeholdende et vildtype-probe og to forskellige mutant prober: en for de mest almindelige variant (c.2573T G) og en til de sjældne kompleks c .2573_2574TG GT inversion

Hotspot mutation analyse i cytologi materiale fra NSCLC patienter

for at løse, i hvilket omfang mutationen analyse kan pålideligt udføres på eBUS-TBNA og EUS-FNA aspiration materiale. udførte vi de 13 analyser på 43 patienter med NSCLC, for hvilke både primær tumor (enten biopsier eller histologiske materiale fra resektioner) og tumor-positive cytologisk materiale var blevet indsamlet. Materialet fra de 43 patienter udgør 29 væv borekerner fra histologiske ekscisioner, 23 Mikrodissekterede biopsier og 3 hel-sektion biopsier, som blev sammenlignet med 45 Mikrodissekterede cytologiske udstrygninger og 17 Mikrodissekterede celle blokke (supplerende tabel S1).

Seks patienter præsenteret med en

KRAS

mutation: c.34G T (N = 2), c.34G a, c.35G a, c.35G C og c.38G a. En patient foretaget en sletning i exon 19 af

EGFR

(c.2238_2252del15) og to patienter viste

PIK3CA

mutationer: c.1633G A og c.3140A G. Sidstnævnte tilfælde viste en ekstra

KRAS

mutation (p.34G T). Ingen mutationer i

BRAF

blev observeret.

For nogle patienter, multipel histologiske og /eller cytologiske prøver blev analyseret. I forskellige prøver til den samme patient, blev modstridende resultater for samme type materiale aldrig observeret. Derfor vil der i tabel 1 hver patient er repræsenteret én gang, hvor der for hver type materiale de oplysninger fra alle patientens prøver er fusioneret. Det betyder, at det tydeligste signal for hvert assay havde forrang. I tabel 1 er de resterende mangler opkald, på grund af lave signaler angivet med “?”.

Den samlede takst i de 13 analyser, efter at fusionere, beløber sig til 95% (58 ubestemte resultater ud af 1118 tests). Indkaldelsen sats for histologiske materiale er væsentligt højere ved 99% (8 ubestemt ud af 559) end for cytologisk materiale på 91% (48 ud af 559). Inden for det cytologiske materiale, opkaldet sats for primære tumorer er lavere (84%) end for metastaser (96%). Bemærk, at disse observationer forbliver hvis patienten med de laveste kvalitet resultater (prøve 21) fjernes. Inden for det histologiske materiale kan observeres den samme forskel i takst, men i en langt lavere grad (98% for primære tumorer versus 99% for metastaser). Når man sammenligner takster pr assay, vi observerede, at de tre analyser på

PIK3CA

gen udført mindre (mellem 88 og 91%) end de øvrige 10 analyser (mellem 94 og 99%).

Som det kunne iagttages, når cytologisk materiale blev opnået fra primære tumorer, mutationen resultater for histologi og cytologi var overensstemmende i alle tilfælde, hvor begge resultaterne blev bestemt. Når cytologisk materiale blev opnået fra metastase, i en patient (nr 40) med en adenocarcinom /bronchoalveolær cellecarcinom (BAC), en KRAS c.34G En mutation blev identificeret i det mediastinale lymfeknuder, som ikke blev detekteret i den primære tumor. Dette kunne forklares ved den almindeligt observerede genetiske divergens af metastaser fra dets primære tumor. I dette tilfælde tidsrum er 18 år mellem den primære tumor og metastase. Samlet set uoverensstemmelse sats er kun 0,20% (1 assay ud af 503, hvor både histologiske og cytologiske resultater bestemmes).

Tumor celleprocenten og DNA kvalitet

Fra biopsier og cytologi, kun små tumorfoci kan mikrodissekeres. Dette resulterer i et lavt DNA udbytte, at i tilfælde af formalin fiksering, er også delvist nedbrudt. For at undersøge kvaliteten af ​​DNA, sammenlignede vi DNA effektive assay performance. Vi observerede, at den gennemsnitlige mængde DNA isoleret (295 ng) var lavere i gruppen (n = 15), hvor to eller flere analyser mislykkedes [sammenlignet med gruppen uden svigtende analyser (n = 102, 2973 ng)]. Ikke desto mindre, i sidstnævnte gruppe, 44% af prøverne (n = 45) havde også en DNA-mængde mindre end 295 ng. Dette indikerer, at CQ værdier er en bedre indikator for DNA kvalitet og ydeevne end DNA koncentrationsmålinger.

allel-specifik qPCR med hydrolyse sonder er blevet rapporteret til at overgå følsomheden niveau 1% [27]. Men i betragtning af, at qPCR effektivitet afhænger også af DNA-fragmentering, kunne DNA isoleret fra FFPE prøver præcist analyseres på en følsomhed på 10% [26]. Vi bestemt detektionsgrænsen i serielle fortyndinger af DNA fra to tumorer bærer en

KRAS

c.34G T eller en c.35G En mutation. Dette viste, at den minimale DNA input skal være mindst 32 pg, svarende til 4-6 celler af høj molekylvægt DNA til opnåelse CQ værdier. 35 (figur 3)

Det øverste panel viser mutanten (FAM) signal for en række forskellige mængder af input-DNA i pg bærer c.34G T KRAS mutation. Ingen “mutant” signal er observeret i en vildtype DNA (grøn linje) og vand-kontrol (grå linje). I vildtype (VIC) panel alle DNA show en vildtype signal mens vandet kontrol er negativ (grå linie). Billederne fås fra LC480 softwareversion 1.5.0. Y-aksen viser den relative fluorescens for FAM (465-510 nm) og Victoria (533-580nm) sonder, x-aksen viser de PCR-cykler.

Desuden har vi valideret analyserne i en serie af DNA-isolater fra Mikrodissekterede FFPE prøver med kendt

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

eller EFGR varianter som fastsat af Sanger sekventering. Vi fandt en 100% korrelation med hydrolyse probeassays.

Vi valideret analysen for

EGFR

exon 19 i en serie på 10 prøver med mulige sekvens verificeret exon 19 deletioner og en tumor procentdel af mere end 50%. Prøverne blev testet uden forudgående kendskab til mutationen status. hydrolyseprodukter analyseresultaterne de blev sammenlignet med DNA-sekvensen resultater og alle ni prøver indeholdende en exon 19 deletion korrekt identificeret og skelnes fra vildtype-prøve (figur 2b). I et tilfælde var der en 18-bp indsættelse i exon 19. Da dette faldt uden påvisning område sonderne blev mutanten ikke opdaget af sletningen assay (SampleID 1012 i Supplerende tabel S3). Disse resultater viser, at alle hotspot mutationer og

kan detekteres EGFR

exon 19 deletioner under anvendelse af de hydrolyse- prober.

Krydsreaktivitet Salg

Mutationer i

KRAS

og

PIK3CA

klynge i hotspots. For

KRAS

, alle syv analyser hybridiseret til codon 12 og 13 (nukleotider c.34G, c.35G og c.38G), mens den for

PIK3CA

to analyser påviste exon 9 ændringer (c .1624G A og c.1633G A). Som sonderne potentielt hybridiseret i samme region, krydsreaktivitet mellem de forskellige

KRAS

eller

PIK3CA

analyser måske kan ses som et resultat af øget fluorescens aflæsninger fra ufuldstændigt matchede prober eller primere [26 ]. Derudover kan krydsreaktivitet skyldes (sjældne) basepar substitutioner, der ikke er omfattet af de anvendte assays.

Krydsreaktivitet blev undersøgt i en serie af 42 MD prøver bærer en

KRAS

mutation i stilling 34, 35 eller 38. Der blev udført i alt 294 assays (42 × 7). Den korrekte mutation status blev identificeret, når en R

m /R

vægtforhold cut-off 0,7 blev anvendt; men i 68 analyser blev en krydsreaktivitet signal observeret. Fem cross-reaktivitet signaler havde R

m /R

wt 0,7, men i disse tilfælde analysen for den ægte mutation havde R

m /R

wt 1,0. Krydsreaktivitet blev kun observeret for sonder dækker samme basepar position (ved position 34 eller 35). Krydsreaktivitet mellem signaler fra basepar 34 eller 35 og position 38 blev ikke observeret (Supplerende Tabel S4). Derfor er det sandsynligt, at ingen krydsreaktivitet effekter blev observeret for de to forskellige

PIK3CA

sonder.

Klinisk praksis

De beskrevne metoder kan implementeres i klinisk praksis. De molekylære diagnostik testresultater kan genereres på kort tid. I daglig praksis, er det cytologiske eBUS-TBNA eller EUS-FNA aspiration materiale morfologisk indtastet af patologer. Efterfølgende prøver grupperet til mikrodissektion på en ugentlig basis. Mikrodissektion er afgørende for at opnå en høj tumor celle procenter til at detektere EGFR exon 19 sletning, og tillade andre analyser med lavere følsomhed end den beskrevne metode, f.eks Sanger sekventering. Efter DNA-isolering, er hydrolyse probeassays udført på DNA fortyndinger. Ved slutningen af ​​den anden dag, er qPCR resultaterne analyseret i et in-house udviklede Microsoft Excel-baserede analyseværktøj til fortolkning af resultaterne, fx bestemme mutationen status for hver probe og fortolke effekten af ​​krydsreaktivitet. Resultaterne er efterfølgende indberettet til klinikken. En begrænsning ved hotspot analyse er per definition at der kun forekommer hotspot mutationer, mens Sanger-sekventering kan identificere alle mutationer i PCR-amplikon. I nogle tilfælde, hvor mutationen analysen ikke opfylder indstillingerne for kvalitet, vil Sanger sekventering udføres. For Sanger sekventering, skal ekstra PCR reaktioner, reaktion produkt rensninger og elektroforese skal udføres, hvilket vil kræve to ekstra dage i analysen pipeline.

Konklusion

Vi konkluderer, at somatisk mutation hotspot analyse for

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

EGFR

af fine nåle forhåbninger mediastinale lymfeknuder i NSCLC patienter er nøjagtig og pålidelig. Somatisk hotspot mutation analyse for

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

EGFR

kan pålideligt udføres med allel-specifik qPCR med hydrolyse sonder; mutationen resultater fra cytologiske prøver og de primære tumorer er meget samstemmende.

kan udføres Somatisk mutation analyse i NSCLC for molekylær iscenesættelse og vejledning af behandling beslutninger om eBUS og EUS fine nål aspirater, procedurer, der er mindre invasive for patienten end rutinemæssige mediastinoscopy.

Vores resultater viser, at den molekylære genetiske analyse af NSCLC bør indarbejdes med standard eBUS og EUS procedurer. Denne kombinerede tilgang vil resultere i præcis diagnosticering og iscenesættelse af de patienter, og vil også bidrage til at vejlede de optimale behandling beslutninger, især i fase III og IV NSCLC.

Støtte oplysninger

tabel S1. .

Generel oversigt

doi: 10,1371 /journal.pone.0017791.s001

(XLS)

tabel S2. .

Primer sekvenser

doi: 10,1371 /journal.pone.0017791.s002

(XLS)

tabel S3.

EGFR exon 19 validering eksperiment

doi:. 10,1371 /journal.pone.0017791.s003

(XLS)

Tabel S4.

Cross reaktivitet i KRAS-analyser

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0017791.s004

(XLS)

Tak

Vi takker teknikerne på molekylær diagnostik gruppe i LUMC Patologisk Institut for afprøvning af protokollerne i forskellige biologiske indstillinger og fejlfinding de forskellige aspekter af undersøgelsen.