PLoS ONE: Overekspression af CARMA3 i ikke-småcellet lungekræft er Linked til Tumor Progression

Abstrakt

Vi havde til formål at undersøge den kliniske betydning af udtrykket af nye stillads protein CARMA3 i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) og den biologiske funktion af CARMA3 i NSCLC-cellelinier. Vi observerede moderat til høj CARMA3 farvning i 68,8% af 141 NSCLC prøver sammenlignet med tilsvarende normale væv. Overekspressionen af ​​CARMA3 var signifikant korreleret med TNM fase (P = 0,022) og tumor status (P = 0,013). CARMA3 opregulering også korreleret med en kortere overlevelsesrate for patienter af nodal status N0 (P = 0,042) samt ekspressionen af ​​epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) (P = 0,009). I EGFR mutation positive tilfælde, CARMA3 ekspression var meget højere (87,5%) sammenlignet med ikke-mutation sager (66,1%). Derudover observerede vi, at knockdown af CARMA3 inhiberer tumorcelleproliferation og invasion, og inducerer cellecyklusstop på grænsen mellem G1 og S-fase. Vi yderligere demonstreret en direkte sammenhæng mellem CARMA3 og NF-KB-aktivering. Ændringen af ​​biologisk adfærd i CARMA3 knockdown celler kan være NF-KB-relateret. Vores resultater demonstrerede, for første gang, blev denne CARMA3 overudtrykt i NSCLC og korreleret med lungecancer progression, EGFR, og EGFR mutation. CARMA3 kunne tjene som et potentielt følgesvend drug target, sammen med NF-kB og EGFR i EGFR-mutant lungekræft

Henvisning:. Li Z, Qu L, Dong Q, Huang B, Li H, Tang Z, et al. (2012) Overekspression af CARMA3 i ikke-småcellet lungekræft er Linked til Tumor Progression. PLoS ONE 7 (5): e36903. doi: 10,1371 /journal.pone.0036903

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: November 15, 2011; Accepteret: April 9, 2012; Udgivet: 15. maj 2012 |

Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.972.967) og Research Fund for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (nr 20092104110018). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CARMA3 (også kendt som CARD10 eller Bimp1) tilhører CARMA familie og indeholder tre medlemmer, CARMA1 (også kendt som CARD11), CARMA2 (CARD14), og CARMA3. Disse tre proteiner deler lignende strukturelle motiver, indeholde en CARD domæne, en Src-homologi 3 (SH3) domæne, en eller flere PDZ-domæner, og en GUK domæne. Imidlertid udviser de særskilte udtryk profiler; CARMA1 udtrykkes i hæmatopoietiske celler, CARMA2 i placenta, og CARMA3 i alle ikke-hæmatopoietiske celler [1] – [4]. Nyere undersøgelser har vist, at CARMA3, som et stillads protein, spiller en kritisk rolle i GPCR-ligander og PKC-induceret NF-KB-aktivering [5] – [8]. Det er tidligere blevet påvist, at NF-KB-aktivering er involveret i tumorigenese og i udviklingen af ​​neurale, hjerte og immunsygdomme [9] – [13]. CARMA3 aktiverer NF-KB ved at rekruttere Bcl10 og MALT1, to uundværlige proteiner, der er nødvendige for GPCR og PKC-induceret NF-KB-aktivering [6], [14] – [16]. PKCA-CARMA3 signalering akse spiller en væsentlig rolle i LPA-induceret æggestokkræft celle in vitro invasion [17]. En nylig undersøgelse viste, at CARMA3 mangel forringet cancercelleproliferation in vitro og in vivo, hæmmede overlevelse, migration og invasion i human brystcancer-cellelinier MDA468 og A431 [18]. CARMA3 knockdown forårsagede markant inhibering af SDF-1α medieret invasion af orale pladecellecarcinom TB2-T4-celler [7]. Imidlertid har det protein ekspression af CARMA3 i lungekræft væv og potentielle rolle CARMA3 i den biologiske opførsel af lungecancerceller ikke blevet undersøgt. Således har vi undersøgt ekspressionen af ​​CARMA3 i lungekræft væv og dets forhold til forskellige klinisk-patologiske parametre. Desuden vurderede vi sammenslutningen af ​​CARMA3 udtryk med spredning og metastatisk potentiale af flere NSCLC cellelinjer.

Materialer og metoder

Patienter og Prøver

Denne undersøgelse blev godkendt fra den etiske komité i Kina Medical University, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient. 141 tilfælde af NSCLC prøver blev opnået fra den første Tilknyttede Hospital i Kina Medical University i perioden fra 2008 til 2011. histologisk diagnose og grad af differentiering af tumorerne blev defineret af evaluering af hematoxylin og eosin-farvede vævssnit, ifølge World Health Organization retningslinjer for klassificering. Alle 141 prøver blev revurderet med hensyn til deres histologiske undertyper, differentiering status, og tumor etaper. For NSCLC prøver blev SCC og adenocarcinom identificeret i 65 og 76 af de 141 sager, hhv. Lymfeknudemetastaser blev observeret i 68 af de 141 patienter. Den p-TNM taging systemet af Den Internationale Union Against Cancer (7. udgave) blev anvendt til at klassificere prøver som trin I (n = 64), II (n = 41), III (n = 30) og IV (n = 6) .

cellelinier

A549, H1299, HBE og H460 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), LK2 blev opnået fra den japanske Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan), SPC blev opnået fra CCTCC (kinesisk center Typisk Kultur Conserve, Wuhan, PRChina), H157 blev købt fra Cell Bank, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), The BE1 og LH7 var gaver fra Dr. Jie Zheng (College of Medicine, Beijing University, Kina) .De celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 100 IU /ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO , USA), og 100 pg /ml streptomycin (Sigma). Celler blev dyrket på sterile vævsdyrkningsskåle og blev passeret hver 2 dage ved hjælp 0,25% trypsin (Invitrogen).

Immunhistokemi

Kirurgisk udskårne tumorprøver blev fikseret med 10% neutral formalin, indlejret i paraffin og 4 um tykke snit blev fremstillet. Immunfarvning blev udført under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-kompleks-metoden (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Kina). Snittene blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i gradueret alkoholserie og kogt i 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) i 2 minutter i en autoklave. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved anvendelse af hydrogenperoxid (0,3%), som blev efterfulgt af inkubation med normalt gedeserum for at reducere ikke-specifik binding. Vævssnit blev inkuberet med CARMA3 kanin polyklonale antistof (1:80 fortynding) (Sigma). Muse-immunoglobulin (ved den samme koncentration af antigenet specifikt antistof) (Maixin, Fuzhou, Kina) blev anvendt som en negativ kontrol. Farvning for alle primære antistoffer blev udført ved stuetemperatur i 2 timer. HRP-konjugeret anti Polymer Mouse /Rabbit IgG (klar-til-brug) (Maixin, Fuzhou, Kina) blev anvendt som det sekundære antistof. Efter vask blev sektionerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret streptavidin-biotin, efterfulgt af 3, 3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid at udvikle peroxidase reaktionen. Kontrastfarvning af sektionerne blev gjort med hæmatoxylin, som var så dehydreret i ethanol før mounting.Two uafhængige efterforskere undersøgt alle tumor glider tilfældigt. Fem synspunkter blev undersøgt per dias, og blev observeret 100 celler per view på 400 × forstørrelse. Normal bronkieepitel stede i tumorsnit blev anvendt som negativ kontrol. Immunfarvning af CARMA3 blev scoret efter en semikvantitativ skala ved at evaluere i repræsentative tumorområder, intensiteten og procentdelen af ​​celler, der viser højere immunfarvning end kontrolcellerne. cytoplasmatisk farvning af tumorcellerne blev betragtet som positiv immunfarvning. Intensiteten af ​​CARMA3 cytoplasmatisk farvning blev også bedømt som 0 (ingen farvning), 1 (svag), 2 (mærket). Procent scoringer blev tildelt som 1- 1-25%, 2- 26-50% og 3- 51-100%. Pointene for hver tumor prøve blev multipliceres for at give en endelig score fra 0 til 6, og den totale ekspression af CARMA3 blev bestemt som enten negativ eller lav ekspression (-): score 3 eller positivt udtryk eller høj ekspression (+): score ≥3.

(A) Stærk CARMA3 udtryk i lunge adenocarcinom (400 ×). (B) Svag CARMA3 ekspression i lunge adenocarcinom (400 ×). (C) Kraftig CARMA3 ekspression i lunge pladecellecarcinom (400 ×). (D) Svag CARMA3 ekspression i lunge pladecellecarcinom (400 ×). (E) Normal bronkieepitel viser svag farvning for CARMA3 (400 ×). (F) Negative kontroller for CARMA3 farvning med ikke-immunt muse-IgG-antistof (400 ×).

immunhistokemisk farvning for CARMA3 og EGFR i to repræsentative NSCLC prøver. Den ene viste stærk udtryk for CARMA3 (A) og stærk EGFR (400 ×) (B). Den anden viste svag ekspression af CARMA3 (400 ×) (C) og svag EGFR (400 ×) (D). (E, F) Korrelation af CARMA3 og EGFR i NSCLC prøver med EGFR-mutation (400 ×).

Analyse af EGFR Mutation

Paraffinsnit af 75 NSCLC prøver til EGFR-mutation analyse blev opnået fra First Affiliated Hospital i Kina Medical University mellem 2009 og 2011. Kort beskrevet DNA blev ekstraheret fra paraffinindlejrede vævssnit ved hjælp TaKaRa DEXPAT Easy Kit (TAKARA Biotechnology, Dalian, Kina) ifølge fabrikantens protokol. EGFR-mutationer blev påvist ved hjælp af EGFR mutation afsløring kit (GP Medical Technologies, Beijing, Kina) på 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Californien).

kvantitativ real-time PCR (SYBR Green metode)

Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) i et totalt volumen på 20 pi på 7900HT Hurtig real-Time PCR System (Applied Biosystems) som følger: 95 ° C i 30 sekunder, 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder. En dissociation trin blev udført for at fremskaffe en smeltekurve for at bekræfte specificiteten af ​​amplifikationen. β-actin blev anvendt som reference-genet. De relative niveauer af genekspression var repræsenteret ACt = Ct-gen -Ct reference, og folden ændring af genekspression blev beregnet med 2-ΔΔCt metode. Primeren sekvenser er tilvejebragt i tabel S1 blev Eksperimenter gentaget tre gange.

Western blot-analyse

Total proteiner fra primære væv og cellelinier blev ekstraheret i lysepuffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og kvantificeret under anvendelse af Bradford-metoden. Halvtreds mikrogram protein blev separeret ved SDS-PAGE (12%). Efter overførsel blev det polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende antistoffer CARMA3 (1:200, Sigma), Bcl-10 og β-actin (1:500 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-phospho-ERK, anti-phospho-IKK, anti-phospho-IKB, anti-phospho-Rb, anti-P27, anti-cyclin A, anti-cyklin D1, anti -Cyclin D3, anti-CDK4 og anti-CDK6 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Efter inkubation med peroxidase-koblet anti-mus eller kanin-IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved 37 ° C i 2 timer blev bundne proteiner visualiseret under anvendelse af ECL (Thermo Fisher Scientific) og påvist under anvendelse Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). De relative protein niveauer blev beregnet på grundlag af β-actin som lastning kontrol.

Små interfererende RNA Behandling

Dharmacon siGENOME SMARTpool siRNA for CARMA3, Bcl10 og Dharmacon siGENOME Non-targeting siRNA # 1 var indkøbt fra Dharmacon (ThermoFisher Scientific). For transfektioner blev celler podet i en 24-brønds plade 24 timer før forsøget. Cellerne blev transficeret med siRNA hjælp af DharmaFECT 4 (0,20 pl /brønd; ThermoFisher Scientific) ifølge fabrikantens protokol. Efter transfektion blev mRNA og protein niveauer vurderet 48 timer senere.

Cell Proliferation Test

Celleproliferation assay blev udført under anvendelse af Cell Counting Kit-8® opløsning (Dojindo, Gaithersburg, MD) ifølge til fabrikantens protokol. Kort fortalt blev cellerne podet ved en koncentration på 5 × 10

3 celler /100 pl /brønd i 96-brønds dyrkningsplader og behandlet med 10 pl /brønd af Cell Counting Kit-8® løsning under de sidste 4 timer af kultur. Optisk densitet af brøndene blev målt ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser.

kolonidannelse Assay

I kolonidannelse assays celler blev dyrket på 6 cm skåle med en densitet på 5.000 celler /skål og transficeret med CARMA3, Bcl10 eller negativ kontrol siRNA’er. Kolonier blev vasket to gange med PBS, fikseret og farvet med formaldehyd-krystalviolet 13-15 dage efter transfektion. Alle eksperimenter blev uafhængigt gentaget mindst tre gange under identiske betingelser.

(A) Western blot-analyse af CARMA3 ekspression i lungecancerceller transficeret med siRNA. (B) Relative CARMA3 ekspressionsprofiler i et panel af humane luftvejs afledte cellelinier vurderes ved real-time PCR.

(A) Cellevækst blev bestemt ved CCK-8 assay som beskrevet i § 2. dataene er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. (b) (Øverste panel) H1299 og A549-celler transduceret med siRNA for kontrol blev CARMA3 eller Bcl10 underkastes kolonidannelse assayet. (Nederste felt) Histogram kvantificering. Fejl søjler angiver ± SD (* p 0,05, ** p 0,01)

(øvre) CARMA3 og Bcl10 siRNA behandling hæmmede målbar celle invasion i begge cellelinier (200 ×).. (Nedre) Søjlediagrammet viser middelværdien og forskel i celleantal blandt fotografierne, og standard afledning blev beregnet ud fra gennemsnittet af celler i de 10 felter (**, P 0,01)

Matrigel invasion assay

Cell invasion assay blev udført under anvendelse af en 24-brønds Transwell kammer med en porestørrelse på 8 um (Costar, Cambridge, MA). Indsatsene blev overtrukket med 20 ul Matrigel (1:03 fortynding, BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne trypsiniseret og 3 × 10

5-celler i 100 pi serumfrit medium blev overført til den øvre Matrigel kammer og inkuberet i 16 timer. Efter inkubation blev ikke-besatte celler på den øvre membranoverfladen fjernes med en vatpind, og de celler, der passerede gennem filteret blev fikseret med 4% paraformaldehyd og farvet med hematoxylin. Antallet af invaderede celler blev talt i 10 tilfældigt udvalgte høj effekt felter under mikroskop. Dette eksperiment blev udført tre gange.

Cell Cycle Analysis

Celler (500.000) blev podet i 6-cm vævskulturskåle. Efter 12 timers inkubation blev celler transficeret med angivne mængder siRNA. Celler blev fikseret med 75% ethanol 48 timer efter transfektion, vaskes med phosphatbufret saltvand (PBS) og farvet i 5 mg /ml propidiumiodid i PBS suppleret med RNase A (Roche, Indianapolis, IN) i 30 minutter ved stuetemperatur . Data blev indsamlet ved hjælp af BD-systemer

Luciferase Assay

Celler blev oprindeligt transfekteret med CARMA3, Bcl10 eller negativ kontrol-siRNA’er for 24 timer.; celler blev derefter co-transficeret med 500 ng pnf-KB-Luc-reporterplasmidet, og 100 ng Renilla luciferase plasmid til 24 timer. Cellerne blev behandlet i 30 minutter med eller uden EGF (100 ng /ml), og derefter lyseret; luciferaseaktivitet blev bestemt med en dual-luciferase reporter assaysystem (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens anvisninger. NF-kB-aktivitet blev vurderet ved normalisering af ildflueluciferaseaktivitet, at Renilla luciferaseaktivitet. Eksperimenter blev udført tre gange i tre uafhængige forsøg.

Statistical Analysis

SPSS-version 16.0 for Windows blev anvendt til alle analyser. Chi-squared test blev anvendt til at undersøge mulige sammenhænge mellem CARMA3 udtryk og clinicopathologic faktorer. Kaplan-Meier-kurver blev anvendt til overlevelse analyse, og log-rank blev bestemt baseret på forskellene. Den t-test blev anvendt til at sammenligne andre data. p-værdier var baseret på tosidet statistisk analyse, og p. 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans

(A) (øvre) H1299 og A549-celler blev behandlet med CARMA3-specifikke siRNA i 48 timer . Derefter blev cellerne høstet og behandlet med RNase, og farvet med PI. Fordelingen cellecyklus blev analyseret ved flowcytometri. (Nedre) Procentdelen af ​​celler i G1, S, G2 fase i histogrammer. (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001) versus kontrolgruppen. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. (B) H1299 og A549-celler blev behandlet med CARMA3-specifikke siRNA i 48 timer. Cellelysater blev underkastet immunoblotting-analyse under anvendelse viste antistoffer.

(A) H1299 og A549-celler blev transficeret med kontrol eller CARMA3-specifikke siRNA i 24 timer, derefter behandlet med NF-KB-luciferase og kontrol

Renilla

reporter plasmider til 24 timer. Cellerne blev behandlet med eller uden EGF (100 ng /ml) før høst, og det resulterende NF-KB-induktion blev målt ved at beregne luciferase /

Renilla

ratio. Data (mean_S.E.) Er fra mindst tre separate bestemmelser. (** P 0,01) (B) H1299 og A549-celler blev transficeret med en siRNA pool målretning CARMA3 i 48 timer, derefter behandlet med EGF (100 ng /ml) i de angivne tidsperioder. Totale cellelysater blev fremstillet ud fra disse celler, og derefter udsat for immunblotting analyse med angivne antistoffer.

Resultater

kliniske betydning af CARMA3 Protein Expression i NSCLC væv

Vi analyserede protein ekspressionsniveauer af CARMA3 hjælp immunhistokemi af 91 NSCLC prøver og deres tilsvarende normale væv. CARMA3 viste sig at være overvejende udtrykkes i det cytoplasmatiske rum. Normal bronkial epitel udstillet negativt eller svag CARMA3 farvning (fig. 1E), mens CARMA3 farvning var markant stærkere i lungekræft væv. Vi fandt moderat til høj CARMA3 farvning i 69% af lungekræft prøver (fig. 1A og C). Vi bruger også western-blotting til at analysere ekspressionen af ​​CARMA3 i 18 cases.The resultater viser, at 56% af lungekræft prøver viser moderat til høj CARMA3 ekspression (figur S2, S3).

Korrelationen mellem CARMA3 ekspression og clinicopathologicfactors af NSCLC er vist i tabel 1. CARMA3 overekspression udviste en signifikant korrelation med TNM fase (P = 0,022) og tumor status (P = 0,013), men ingen korrelation blev observeret vedrørende alder, køn, differentiering, lymfeknudemetastaser og tumor histologi. For bedre at gøre krav korrelationen mellem CARMA3 med lungekræft progression, vi vurderet forholdet mellem ekspressionen af ​​CARMA3 og samlet overlevelse af N0 etape NSCLC-patienter (38 CAMRA3 + og 16 CAMRA3 -). Efter Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, fandt vi, at patienter med lav udtryk for CARMA3 havde en statistisk signifikant længere overlevelse (median overlevelse = 32 ± 3,80 måneder, 95% konfidensinterval 24.56-39.44 måneder) end dem med høj ekspression af CARMA3 (median overlevelse = 20 ± 3,91 måneder, 95% konfidensinterval 12,33-27,67 måneder; p = 0,042;. Figur S4)

En nyligt rapporteret undersøgelse viste, at CARMA3 udtryk er nødvendig for EGFR induceret NF-KB-aktivering [15]. EGFR overekspression er blevet påvist i mange humane cancere, herunder lunge-, tyktarms-, pancreas, bryst, ovarie, blære, nyre og nervesystemet [19], [20]. Således har vi undersøgt sammenhængen mellem CARMA3 udtryk og EGFR status i NSCLC. Vi fandt, at EGFR blev udtrykt i cellemembranen og cytoplasmatisk. En signifikant korrelation mellem CARMA3 ekspression og ekspression af EGFR blev observeret (P = 0,009) i NSCLC prøver (tabel 1 og fig. 2A-D). For at bestemme hvorvidt EGFR mutation er korreleret med forhøjede CARMA3 ekspression, undersøgte vi forholdet mellem CARMA3 ekspression og EGFR mutation. Vi anvendte en EGFR mutation afsløring kit, og fandt 16 af 75 tumorprøver var positive for EGFR mutation (tabel S2). Blandt de 16 sager, 87,5% udviste positive CARMA3 udtryk, en meget højere sats sammenlignet med ikke-mutation sager (66,1%). Vi fandt, at 86,67% EGFR positiv mutation tilfælde også udstillet positive CARMA3 udtryk (fig. 2E og F).

CARMA3 Bidrager til lungekræft cellevækst og invasion

Vi først undersøgte udtryk for CARMA3 i flere lungekræft cellelinier, som vist i fig. 3B, H1299, A549, BE1 udviste høje ekspressionsniveauer af CARMA3 mens normale bronkieepitel (HBE) -celler, LK2, og LH7 udviste lavere CARMA3 ekspression. SPC, H157, og H460 udstillet moderate niveauer af CARMA3 udtryk.

Vi næste ansat en RNA-interferens tilgang at afgøre, om CARMA3 og CBM kompleks (CARMA3-Bcl10-MALT1) spiller en rolle i kræft cellevækst. De CARMA3 og Bcl10 ekspressionsniveauer var uændrede ved transient transfektion med den negative kontrol siRNA, hvorimod CARMA3- eller Bcl10-specifik siRNA undertrykte signifikant både mRNA samt protein-ekspressionsniveauer i H1299 og A549-cellelinier (fig. 3A og fig. S1 ). Dernæst undersøgte vi cellevæksthastigheden. Med CARMA3 eller Bcl10 siRNA, der vises, H1299 celler reducerede vækstrater i forhold til den negative kontrol (fig. 4A). Svarende til H1299 celler, fandt vi, at knockdown af CARMA3 eller Bcl10 også reduceret væksten i A549-celler (fig. 4A). Vi udnyttede en uafhængig metode, kolonidannelse analyser, at validere de anti-proliferative virkninger af CARMA3 eller Bcl10 hæmning i lungekræft celler. CARMA3- eller Bcl10-målretning siRNA’er ført til en klar reduktion af kolonidannelse kapacitet på to testede lunge cancercellelinier sammenlignet med kontrolgruppen siRNA-behandlede celler (fig. 4B). Disse tab-of-funktion studier viste, at CARMA3 og CBM siRNAs kunne hæmme tumorcelleproliferation forhold til irrelevant sinc. For yderligere at undersøge, om CARMA3 og Bcl10 bidrage til de invasive kapacitet ikke-småcellet lungekræft celler, vi gennemførte Matrigel invasion assays. Vores resultater viste, at de invasive kapacitet CARMA3- og Bcl10-Knockdown H1299 cancerceller blev reduceret sammenlignet med de negative kontrolceller (fig. 5). Tilsvarende knockdown af CARMA3 eller Bcl10 i A549 celler reduceres også de invasive kapacitet disse celler (fig. 5). Tilsammen viser disse resultater, at CARMA3 og CBM kompleks er positive regulatorer celle invasion.

CARMA3 Sletning Resultater i G1 Anholdelse og væksthæmning for lungekræft Cells

Cell cyklus analyser ved fluorescens cellesortering (FACS) blev udført i cancerceller med eller uden CARMA3-knockdown, og vi fandt, at procentdelen af ​​celler i G1-fasen blev forøget og celler i S-fasen blev reduceret i celler med CARMA3-knockdown sammenlignet med kontrolceller (fig. 6 A). Disse resultater antyder, at CARMA3 deletion inducerer standsning af cellecyklus ved G1 /S grænsen. For at undersøge den mekanisme ligger til grund for induktionen af ​​cellecyklusstandsningen, testede vi virkningen af ​​CARMA3-knockdown på cyklin A, cyklin D1, cyklin D3, CDK4, CDK6, P27, og P-RB-niveauer. Som vist i (fig.6 B), Western blot-analyse afslørede, at knockdown af CARMA3 reducerede proteinniveauer af cyklin D1, CDK4, CDK6, og P-Rb men steg niveauerne af p27. Taget sammen indikerer disse resultater, at inhibering af CARMA3 ekspression inducerer standsning af cellecyklus i G1-fasen og undertrykker lungecancer cellevækst.

Suppression af CARMA3 Hæmmer p-IKB og NF-KB-aktivering

For at bestemme om CARMA3 medierer EGF-stimuleret NF-KB-aktivering i lungekræft celler, vi brugte H1299 og A549 celler. De celler, der havde gennemgået CARMA3 siRNA behandling udviste NF-KB-inhibering i nærvær eller fravær af EGF. Tilsvarende vores resultater viste, at siRNA-medieret Bcl10-knockdown inhiberede NF-KB luciferaseekspression (Fig.7 A). Vores undersøgelsens resultater viser klart den afgørende rolle CARMA3-Bcl10-MALT1 signalering kompleks i EGF-induceret NF-KB-aktivering i lunge kræftceller. For yderligere at verificere rolle CARMA3 udtryk i EGF-induceret NF-KB-aktivering i kræftceller, H1299 celler og A549 celler transduceret med CARMA3 siRNA blev stimuleret med EGF. Vi observerede en blokade i evnen af ​​EGF til at inducere p-IKB samtidig med knockdown af CARMA3, men IKK EGF-induceret phosphorylering blev ikke påvirket i CARMA3-deficiente celler. Desuden har CARMA3 knockdown ikke forringe EGF-induceret fosforylering af ERK (fig.7 B). Tilsammen vores resultater viser, at CARMA3 via IKB-phosphorylering, medierer EGF-induceret NF-KB-aktivering i lungecancerceller

Discussion

I denne undersøgelse vurderede vi ekspressionsmønsteret og biologisk. rolle roman stillads protein CARMA3 i humant NSCLC. Vores resultater viste, at CARMA3 proteinekspression i lungekræft væv er højere sammenlignet med tilsvarende normale lungevæv. På proteinniveauet, blev CARMA3 ekspression begrænset til cytoplasmaet i alle prøver. Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem CARMA3 opregulering og både TNM stadie og tumor status. Desuden har vi demonstreret, at CARMA3 opregulering også korreleret med en kortere overlevelsesrate for patienter af lymfeknudestatus n0 samt EGFR status. CARMA3 er tidligere påvist at spille en afgørende rolle i EGFR induceret aktivering af NF-KB [18]. EGFR mutation er signifikant korreleret med forhøjet EGFR, dens downstream signalering, og klinisk respons på gefitinib terapi [21]. Således har vi yderligere undersøgt sammenhængen mellem CARMA3 udtryk og EGFR mutation. Vi fandt, at ekspressionen af ​​CARMA3 er betydeligt højere i EGFR mutation tilfælde sammenlignet med ikke-mutation tilfælde. Disse resultater antydede, at CARMA3 kan spille en vigtig rolle i EGFR-mutant lungekræft. En nylig rapport vist, at knockdown af flere komponenter af NF-kB-vejen specifikt forøget celledød induceret af EGFR TKI erlotinib i EGFR-mutant lungecancerceller [22]. Som overekspression af CARMA3 proteiner inducerer robust NF-KB-aktivering [3], [4], CARMA3 og NF-kB kan tjene som potentielle companion lægemiddelmål sammen med EGFR i EGFR-mutant lungekræft.

CARMA3 har været rapporteret at fremme ovariecancercelle progression [17], for at øge human brystcancer cellevækst og invasion [18], inducerer invasion af oral pladecellecarcinom (OSCC) [23]; CARMA3 spiller også en vigtig rolle i atherogenese [24] og NF-KB-aktivering i luftvejsepitelceller [25]. Men den funktionelle rolle forbliver uklar. At belyse den biologiske funktion af CARMA3 i lungekræft, anvendte vi siRNA til Knockdown CARMA3 ekspression i både A549 og H1299 cellelinjer, der udtrykker høje niveauer af CARMA3. Vi observerede nedsat proliferation kapacitet i både A549 og H1299 celler efter CARMA3 knockdown. Knockdown af Bcl10, som er en anden komponent af CBM komplekset, også nedsat celleproliferation. Således CARMA3 siRNA knockdown potentielt svækker malign celleproliferation gennem ødelæggelse af CARMA3-Bcl10-MALT1 kompleks. De fleste proliferative faktorer påvirker cellevækst ved at påvirke cellecyklusprogression. I denne undersøgelse analyser cellecyklus afslørede, at procentdelen af ​​celler i G1-fasen blev forøget, hvorimod procentdelen af ​​celler i S-fasen blev reduceret i CARMA3-knockdown celler sammenlignet med kontrolceller. Knockdown af CARMA3 inhiberede G1 til S overgang i cellecyklusprogression, hvilket tyder den rolle, som CARMA3 spiller i lungekræft celleproliferation. Cellecyklusprogression moduleres ved en række molekyler. For at bestemme den potentielle mekanisme CARMA3 om cellecyklusregulering undersøgte vi effekten af ​​CARMA3 knockdown på cellecyklus-relaterede molekyler. Vi analyserede niveauerne af cyclin A, cyclin D1, cyclin D3, CDK4, CDK6, p-Rb, og P27 og fandt, at knockdown af CARMA3 reducerede proteinniveauer af cyklin D1, CDK4, CDK6, og P-Rb men steg niveauerne af p27. Cyclin D1, som driver udviklingen af ​​celler i de proliferative faser af cellecyklussen, spiller en vigtig rolle i tumorigenese. Cyclin-D /CDK4, 6 /pRB-vejen er tidligere blevet påvist at blive ændret i over 80% af humane tumorer [26], [27]. Det er en vigtig regulator af den kritiske G1 til S faseovergangen af ​​cellecyklussen. Under G1-fasen, er pRB inaktiveret ved sekventielle phosphoryleringsbegivenheder medieret af forskellige cyclinafhængige kinaser (CDK’er), hvilket fører til frigivelse af E2F transkriptionsfaktorer, aktivering af mange gener, og progression af cellecyklussen [28]. Cyclin-afhængige kinase inhibitor p27 (også kaldet Kip1) er et vækstinhiberende protein, der blokerer cellecyklusprogression ved G1 /S overgang [29]. Tilsammen indikerer disse resultater, at CARMA3 styrer cellens cyklus ved at regulere cyklin D1, CDK4, CDK6, p-Rb, og p27.

Det er blevet mere og mere klart, at NF-KB-signalering spiller en afgørende rolle i kræft udvikling og progression [30] – [34]. Vores resultater viser endvidere en direkte forbindelse mellem CARMA3 og NF-KB-aktivering. Ændringen af ​​cellecyklusprogression efter CARMA3 knockdown potentielt relateret til NF-KB. NF-KB er genstand for talrige farmaceutiske undersøgelser som et mål for anti-cancer terapi. Blokering NF-KB potentielt standser tumorcelleproliferation og forårsager apoptose, eller forøger følsomheden over for virkningen af ​​antitumormidler. Den foreliggende undersøgelse viste, at CARMA3 knockdown hæmmer NF-KB-aktivering, og dermed blokerer lungekræft progression og foreslå den potentielle betydning af dette fund for nye behandlinger mod kræft.

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i USA og på verdensplan. Den største form for lungekræft er NSCLC [35] .Despite fremskridt i tidlig påvisning og standard behandling er NSCLC ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium og har en dårlig prognose. Oplev værdifuld biomarkør til påvisning af NSCLC på et tidligt tidspunkt kan forbedre overlevelsen betydeligt. Nu er der mange potentielt nyttige biomarkører for lungekræft er blevet verificeret, såsom CEA, CA-125, CYFRA 21-1, TPA [35] – [39]. Flere og flere nye potentielle biomarkører for lungekræft er blevet opdaget, som SAA, Hedeselskabet, EGFR, Mig-6 [40] – [43]. I denne forskning finder vi CARMA3 som et andet potentielt nyttigt biomarkør for lungekræft. Identifikationer af biomarkører fører til mere forståelse for de molekylære involverede veje i lungekræft og bidrage til at reducere de lidelser og tab af menneskeliv som følge af den dødelige sygdom [44].

Som konklusion, vores undersøgelse viste, at CARMA3 er overudtrykt i NSCLC og korrelerer med lungekræft progression. CARMA3 fremmer lungekræft spredning gennem cellecyklus regulering og NF-KB regulering.

Støtte Information

Figur S1.

CARMA3 mRNA knockdown blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0036903.s001

(JPG)

Figur S2.

TheCARMA3 udtryk i en normal (92 #) og 17 NSCLC væv prøver (400 ×)

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0036903.s002

(TIF)

Figur S3.

CARMA3 proteinekspression i NSCLC. Lige store mængder totalt protein (60 ug) fra normale (92 #) og NSCLC væv blev analyseret ved Western blotting med et anti-CARMA3 antistof eller et anti-β-actin antistof som ladningskontrol. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg, sammenlignet med kontrollen (92 #) prøver, der anvendes i forsøget var de samme prøver anvendt i figur S2

doi:. 10,1371 /journal.pone.0036903.s003