PLoS ONE: identifikation og validering af en multigenfamilie Predictor af Gentagelse i Primary Laryngeal Cancer

Abstrakt

Formål

Lokal gentagelse er den største manifestation af behandlingssvigt hos patienter med operabel larynx karcinom. Etablerede klinisk-patologiske faktorer kan ikke i tilstrækkelig grad forudsige patienter, der sandsynligvis vil gentage sig efter behandlingen. Yderligere værktøjer er derfor forpligtet til præcist at identificere patienter med høj risiko for tilbagefald. Denne undersøgelse forsøger at identificere og uafhængigt validere genekspression modeller, prognostiske af sygdomsfri overlevelse (DFS) i operabel larynxcancer.

Materialer og metoder

Brug Affymetrix U133A Genechips, vi profileret fersk- frosne tumorvæv fra 66 patienter med larynx cancer behandlet lokalt med kirurgi. Vi anvendte Cox regression proportionel risiko modellering til at identificere multigenfamilier prædiktorer for tilbagefald. Gene modeller blev derefter valideret i to uafhængige kohorter af 54 og 187 patienter (frisk-frosne og formalin-fikseret væv validering sæt, henholdsvis).

Resultater

Vi fokuserede på gener univariately forbundet med DFS (

s

0,01) i træningssættet. Blandt flere modeller omfatter forskellige antal gener, en 30-sonde sæt model demonstrerede optimal ydeevne i både uddannelse (log-rank,

s

0,001) og 1

st validering (

s

= 0,010) sætter. Specifikt i en

st validering sæt, median DFS som forudsagt af den 30-sonde sæt model, var 34 og 80 måneder for høj- og lav risiko patienter. Hazard ratio (HR) for tilbagefald i gruppen med høj risiko var 3,87 (95% CI 1,28-11,73, Wald er

s

= 0,017). Test af ekspressionen af ​​udvalgte gener fra ovenstående model i 2

nd validering sæt, med qPCR, afslørede betydelige sammenslutninger af enkelte markører, såsom ACE2, FLOT1 og PRKD1, med patient DFS. High PRKD1 forblev en ugunstig prognostisk markør ved multivariat analyse (HR = 2,00, 95% CI 1,28-3,14,

s

= 0,002) sammen med positive nodal status.

Konklusioner

Vi har etableret og valideret gen modeller, der med held kan stratificere patienter med larynx cancer, baseret på deres risiko for tilbagefald. Det synes værdig til at prospektivt validere PRKD1 udtryk som en larynxcancer prognostisk markør, for rutinemæssige kliniske anvendelser

Henvisning:. Fountzilas E, Kotoula V, Angouridakis N, Karasmanis I, Wirtz RM, Eleftheraki AG, et al. (2013) identifikation og validering af en multigenfamilie Predictor af Gentagelse i Primary larynxcancer. PLoS ONE 8 (8): e70429. doi: 10,1371 /journal.pone.0070429

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: 11. marts 2013; Accepteret: 18 juni 2013; Udgivet: 9. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Fountzilas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en intern Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) forskningsbevilling (HE R_5G). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: På tidspunktet for undersøgelsen Ralph M. Wirtz og Elke Veltrup var ansat i Siemens Healthcare Diagnostics. På vegne af Hellenic Foundation for Cancer Research, Athen, Grækenland, den ledende forfatter (GF) er verserende patentansøgninger med Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

larynxcancer er den ellevte mest almindelige type af cancer hos mænd verden over. Hvert år 52.000 sager er nyligt diagnosticeret i Europa og 10.000 i USA [1], [2]. På trods af de seneste fremskridt inden for diagnostiske og terapeutiske teknikker, størstedelen af ​​patienterne stadig gentage sig efter behandling [3]. Etablerede klinisk-patologiske faktorer kan ikke i tilstrækkelig grad forudsige patienter der vil gå igen. Yderligere faktorer skal derfor præcist at identificere patienter med dårlig prognose. Expression profilering er med succes blevet brugt i lagdeling af kræftpatienter med ugunstig prognose [4], [5], [6], [7]. Tidligere undersøgelser af patienter med hoved- og halscancer har knyttet genekspression profiler til nodal status [8], [9], [10], fjernmetastaser [11], [12] og sygdomsfri overlevelse [13], [14], [15], [16]. Mens disse undersøgelser forudsat stor indsigt i den molekylære kompleksitet hoved- og halscancer de ikke identificere et robust gen profil. Den kliniske anvendelse af disse modeller er blevet begrænset af det store antal gener, de små datasæt og manglen på reproducerbarhed og uafhængig validering. Desuden er ingen af ​​disse undersøgelser udelukkende fokuseret på larynx cancer.

I den foreliggende undersøgelse, vi søgte at identificere gener prognostiske for tilbagefald hos patienter med primær larynx cancer. Endepunktet af vores analyser var sygdomsfri overlevelse (DFS). Vi profileret tumorprøver fra to separate grupper af patienter, der anvender global genekspression profilering. Brug af den første gruppe som et træningssæt, vi identificeret flere prognostisk gen modeller, som derefter blev valideret i den anden gruppe af patienter. For yderligere at validere vores resultater, profilerede udvalgte vi gener af vores modeller for relative ekspression med kvantitativ real time-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) på en uafhængig kohorte af patienter.

Materialer og metoder

studiepopulation

Vores undersøgelse består af 307 patienter diagnosticeret med primær planocellulært larynx cancinoma (træningssæt: 66, 1

st validering sæt: 54 og 2

nd validering sæt: 187 patienter ), med median opfølgning på 52, 33 og 89 måneder. Alle patienter gennemgik kirurgisk fjernelse af tumoren ved Otorhinolaryngologi Institut for AHEPA Hospital i Thessaloniki, Grækenland, mellem 1985 og 2008. Postoperativ administration af strålebehandling blev besluttet af den behandlende læge og oftest blev givet til patienter med positive tumor margener, patienter med T4 tumorer eller dem med T1 /T2 supraglottiske tumorer, for hvem en profylaktisk elektiv lymphadenectomy ikke blev gjort. Ingen af ​​patienterne modtog systemisk terapi som en del af deres oprindelige behandling. Dette er den nuværende standard for pleje i mange europæiske lande [17], men dette kan ikke være tilfældet i andre lande, som USA, hvor det primære fokus er bevarelsen af ​​strubehovedet med samtidig kemostråleterapi, forud i udvalgte tilfælde ved induktion kemoterapi [18]. Opfølgning inkluderet fysisk undersøgelse, hver tredje måned i de første tre år og hvert halve år derefter. Billeddannende undersøgelser blev udført, som angivet ved symptomer og fysisk undersøgelse. Detaljerede demografi og kliniske karakteristika for de patienter med gyldige gen data er anført i tabel 1, mens de individuelle patientdata vises som i tabel S1.

Tumor prøver

Frisk frosset tumor vævsprøver, fra patienter, som træning og 1

st validering sæt, blev prospektivt indsamlet på tidspunktet for kirurgi, 2004-2008, blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret i -80 ° C indtil bearbejdning. Formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE) tumor vævsprøver, fra patienter, der omfatter 2

nd validering sæt blev retrospektivt indsamlet (patienter behandlet mellem 1985 og 2008). Sidstnævnte blev fikseret i formalin i mindst 6 timer, før de indlejres i paraffin. Larynx tumorer blev histologisk vurderes og verificeres i alle tilfælde, herunder de friske-frosne vævsprøver.

Etik Statement

tumor vævsprøver Friske frosne og FFPE blev indsamlet i henhold til protokoller, der er godkendt af Institutional review Board af “AHEPA” Hospital og bioetik Udvalg Aristoteles-universitetet i Thessaloniki, School of Medicine. Skriftligt informeret samtykke til videnskabelig brug af biologisk materiale blev opnået fra alle patienter, som træning og 1

st validering sæt og fra patienterne i 2

nd validering sæt behandlet efter 2004. Ophævelse af samtykke blev opnået fra Bioetik Komité for patienter behandlet inden 2004 og for hvem skulle efterfølgende indsamles FFPE tumor vævsprøver. Alle kliniske undersøgelser i forbindelse med denne undersøgelse er blevet udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen.

RNA isoleret fra frisk frosset væv og global genekspression profilering

RNA isoleret fra frisk frosne tumorprøver blev udført under anvendelse af RNeasy protokollen (Qiagen, Hilden, Tyskland), som tidligere beskrevet [19]. RNA mængde blev bestemt ved at måle UV-absorbans ved 260 og 280 nm, mens RNA kvalitet blev vurderet ved anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 LabChip kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). RNA blev revers transkriberet, mærket og hybridiseret til Affymetrix (Santa Clara, CA) HG-U133A arrays, som tidligere beskrevet [19]. Eksperimenter vedrørende uddannelse og 1

st validering sæt blev udført separat på forskellige tidspunkter, på Siemens Healthcare Diagnostiske Products (Köln, Tyskland). De genekspression data er blevet deponeret i National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) og er tilgængelige via GEO serien tiltrædelse nummer GSE27020. er blevet oprettet følgende link for at tillade gennemgang af GSE27020: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dxcdxksauqicizy acc=GSE27020

RNA isoleret fra FFPE tumor vævsprøver og QRT-PCR

Alle undersøgelser, der involverer FFPE vævsprøver blev udført på Laboratoriet for Molekylær Oncology, Hellenic Foundation for Cancer Research, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki School of Medicine. For at validere den prognostiske værdi af gener, der stammer fra vores microarray analyse, brugte vi en separat kohorte af patienter med tilgængelige tumorvæv materiale. Denne prøve gruppe omfattede 187 FFPE vævsprøver, der blev macrodissected på tidligere histologisk evaluering til at indeholde 50% tumorceller. RNA blev isoleret efter fuldstændig overnight væv lysis under anvendelse af Trizol-LS (Life Technologies, Paisley, UK), som tidligere beskrevet [20] og blev revers transkriberet med Superscript III (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. cDNA’er blev normaliseret ved 25 ng /ul og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. mRNA-ekspression blev undersøgt med FAM-mærket TaqMan® genekspression Assays i duplex reaktioner, der involverer en primer-begrænset VIC-mærket henvisning assay for glucuronidase beta (GUSB, assay # Hs00939627_m1), som en endogen template kontrol. GUSB blev foretrukket frem normalt anvendte endogene kontrol, fordi ingen pseudogener har, endnu, er blevet rapporteret for dette gen. Derudover er det blevet identificeret som en blandt de bedst bevarede mRNA-mål i FFPE væv [21]. qPCR mRNA target udvælgelse omfattede evaluering af de 30 sonder af U133A signatur for gen-dubletter, gen egenskaber (gyldigt gen identiteter, type gen, indspillede splejsningsvarianter der ikke ville blive skelnes ved sonden på array eller af qPCR assay), samt en parametrisk

s

-værdi på 0,05 for fold-ændring i genekspression. Ud af de 30 U133A sonder, 23 forblev gældende for QRT-PCR program (tabel 2). For disse 23 mål, søgte vi efter foruddefineret TaqMan® genekspression assays (Applied Biosystems), der ville matche målsekvenserne detekteres af de tilsvarende prober i U133A array. Det var muligt at hente 16 sådanne assays (tabel 2). Duplex 10 ul reaktioner blev kørt in duplo, hver indeholdende 50 ng template, i en ABI PRISM 7900HT systemet (Applied Biosystems /Life Technologies) på en 384-brønds blok under standard betingelser, der involverer 45 amplifikationscykler, sammen med en henvisning RNA-prøve ( TaqMan® kontrol Total RNA, kat. nr 4307281, Applied Biosystems) og uden template kontrol. Henvisningen RNA blev anvendt som en positiv plade kontrol og for evaluering af analysens ydeevne blandt kørsler (inter-run validering). To af de 16 udvalgte analyser gav deltaRQ værdier 1,5 blandt forskellige kørsler, og dermed mislykkedes inter-run validering og ikke yderligere undersøgt (tabel 2)

Cycle tærskler (CT, svarende. til Cq i MIQE retningslinjer) for hvert mål og for den endogene henvisning blev automatisk opnået ved standard betingelser og relativ kvantificering (RQ) blev beregnet på en lineær funktion [22] ved at fratrække (45-avg deltaCT), hvorved 45 blev den samlede forstærkning cyklus nummer og avg DCT = gennemsnitlig [(CT mål) – (CT GUSB)] for dubletter. Kriterier for yderligere vurdering prøve inkluderet GUSB CT værdier af 38 for hver reaktion og deltaRQ for hver duplikere (intra-run variation) af 0,8. I 3 assays blev opnået ingen amplifikation kurver for FFPE og reference- mRNA prøver, mens det for en yderligere analyse blev der observeret høj værdi forskelle inden for en kørsel RQ i 87% af prøverne (tabel 2). Baseret på de ovennævnte filtrering trin for assay og prøve berettigelse, det var endelig muligt at evaluere RQ resultater for kun 10 gener.

Ved at anvende de ovennævnte kriterier for prøve berettigelse, følgende antal informative prøver blev opnået pr mRNA mål (informative analyser kun): ACE2, 159; DHTKD1 171; FLOT1, 178; MAP4K1, 169; NEK2, 156; SFRS8, 184; PRKD1, 162; TBC1D4, 165; TGOLN2, 183 og YTHDC2 blev 176.

Statistisk analyse

Prognostisk genekspression modeller udelukkende udviklet i træningssættet. DFS blev målt fra tidspunktet for diagnosen, indtil verificerede sygdomsprogression eller død. Alive patienter uden verificerede sygdomsprogression blev censureret på datoen for sidste kontakt. Gener udvalgte skulle univariately forbundet med DFS (

s

0,01, Cox proportional hazard model). Algoritmen passer proportional hazards modeller at relatere DFS til hvert gen, et gen på et tidspunkt, og giver en

s Drømmeholdet værdi for hvert gen, teste den hypotese, at DFS er uafhængig af ekspressionsniveauet af det bestemte gen. Gener fundet at være forbundet med DFS i træningssættet blev derefter rangeret baseret på deres absolutte hazard ratio værdi, tilvejebragt af algoritmen. Prognostiske gen modeller, der omfatter forskellige antal af top ranking gener, blev udviklet ved anvendelse den overvågede principal overlevelse komponent algoritme [23]. Algoritmen beregner hovedkomponenter og udfører Cox proportional hazard regressionsanalyse til at beregne en regression koefficient (vægt) for hver principal komponent. En overvåget principalkomponentanalyse model er udviklet til at give en prognostisk indeks for hver patient af undersøgelsen. En høj prognostisk indeks svarer til en høj værdi af risiko for tilbagefald. For at evaluere den prædiktive værdi af denne fremgangsmåde anvendte vi leave-one-out-krydsvalidering, hvor hvert tilfælde er undladt og hele analysen udføres ved anvendelse resten af ​​prøverne. For til direkte at anvende disse modeller til 1

st validering sæt, vi normaliseret træningen og 1

st validering sæt, ved hjælp af empiriske Bayes (EB) metoden [24]. Den metode bruger en algoritme designet til at justere for den ikke-biologiske eksperimentelle variation ( “batch-effekten”) mellem forskellige datasæt. Det reducerer mellem laboratorier variation, samt tekniske forskelle på grund af udnyttelsen af ​​forskellige platforme og metodiske tilgange. Efter normalisering, vi direkte anvendt de gen-modeller til en

st validering sæt uden ændringer.

Kaplan-Meier kurver og log-rank test blev anvendt til at estimere og sammenligne overlevelse distributioner hos patienter med høj – og lav risiko for tilbagefald. Alle indberettede

p

værdier er tosidet. Cox proportional hazard analyse blev anvendt til univariate analyser og multivariate justering for kendte prognostiske faktorer. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af BRB-ArrayTools udviklet af Dr. Richard Simon og BRB-ArrayTools Development Team og SPSS statistikpakke version 18,0, (IBM Corporation, Armonk, NY).

Vi brugte opsyn “underklasse Mapping” (Submap) metode [25] for at vurdere den molekylære korrespondance af patienter med gunstige og ugunstige prognose mellem den indstillede uddannelse og 1

st validering sæt. Denne metode begge retninger vurderer foreningen af ​​foruddefinerede undertyper i flere uafhængige datasæt, på trods af deres tekniske variation. Algoritmen giver beregningen af ​​en

s Drømmeholdet værdi at demonstrere sandsynligheden for molekylær lighed mellem de forskellige underklasser, det gennemføres i GenePattern software (Version 3.0, Broad Institute, Cambridge, MA), og kan findes på https://www.broad.mit.edu/genepattern/

gensæt analyse (GSA) blev anvendt til at detektere genet netværk deregulering karakteristisk for grupper af patienter med god eller dårlig prognose [26]. Brug offentligt tilgængelige data, vi så forudsagde onkogen-aktivering status i hver patient af uddannelse og 1

st validering sæt. Vi anvendte genekspression modeller, tidligere udviklet og valideret in vitro, til at estimere sandsynligheden af ​​pathway aktivering i hver prøve [27]. Endelig hjælp af Bayesianske probit regressionsmodeller vi tildelt hver patient en sandsynlighed for pathway aktivering.

Resultater

Identifikation og validering af prognostiske klassificører hjælp genekspression profilering

flowchart af vores undersøgelse er vist i figur 1 (consort diagram). Vi analyserede primære larynx tumorer fra 66 patienter (uddannelse sæt) og 54 patienter (1

st validering sæt) ved hjælp af globale genekspression profilering. Efter vurderingen af ​​kvaliteten af ​​microarray data, vi udelukket 7 og 4 tekniske outliers fra de to sæt, henholdsvis. For nogle af de gener, blev udtryk beregnet under anvendelse af to forskellige probesæt. Prognostiske sonde sæt modeller blev udelukkende identificeret i træningssættet. Efter at have udelukket en fjerdedel af de mindst variantgener, vi fokuseret på gener forbundet med DFS (Wald s

s

0,01). Vi derefter rangeret de 253 probesæt fundet at være signifikant associeret med DFS, baseret på deres Cox regression koefficient. Vi identificerede flere prognostisk sonde sæt modeller, der består af så mange som 250 til så få som 20 probe sæt, som udføres lige godt i træningssættet.

Efterfølgende har vi anvendt disse multigenfamilier prædiktorer direkte til en

st validering sæt. Den 30-sonde sæt model udført bedst i valideringen sæt (model med færrest gener demonstrerer højeste statistisk forskel i DFS mellem patienterne høj og lav risiko). Median DFS for de grupper af patienter med ugunstig og gunstig prognose, som forudsagt af den 30-sonde sæt model, var 34 og 80 måneder, henholdsvis (log-rank,

s

= 0,010). Den hazard ratio (HR) for tilbagefald i højrisikogruppe versus gruppe lav risiko var 3,87 (95% CI 1,28-11,73, Wald er

s

= 0,017). Kaplan-Meier kurver for alle sonde sæt modeller i uddannelse og 1

st validering sæt kan findes i File S1. Overensstemmelse mellem de risikofaktorer opgaver både i træning og 1

st validering sæt baseret på de forskellige klassifikatorer var høj, 81-87% (Cramer V test = 0,62-0,75).

Anmærkninger af alle 30 sonde sæt inkluderet i vores model er vist i tabel 3, mens en grafisk repræsentation af genekspressionsmønstre af 30-probe sæt model i høj og lav risiko patienter er vist i figur 2a. Vi observerede, at i denne model blev to gener (ACE2 og MAP4K1) repræsenteret af to probesæt. For at undgå virkningen af ​​at vægte disse to gener dobbelt så meget i forhold til hver af de andre individuelle probesæt, der repræsenterer et enkelt gen, vi efterprøvet vores model i træning og 1

st validering sæt med en enkelt probe sæt til hvert gen. I træningssættet, statistisk signifikans hos 28-gen model forblev identiske (log-rank test,

s

0,001, figur 3a) med den ene baseret på 30-sonde sæt model. Median DFS i en

st validering sæt, som forudsagt af den 28-genet model, var 34 og 80 måneder, henholdsvis (log-rank,

s

= 0,029, figur 3b). Den hazard ratio (HR) for tilbagefald i højrisikogruppe versus gruppe lav risiko var 4,38 (95% CI 1,06-7,01, Wald er

s

= 0,036).

Grafisk af de 30-sonde sæt model ekspressionsmønstre i patienter med gunstige og ugunstige prognose vises i panelet en. Rød farve angiver overekspression og grøn farve underekspression af de respektive gener. Molekylær lighed af patienter med gunstige og ugunstige prognose i uddannelse og 1

st validering sæt, der bruger Submap, vises i panelet f. Baren nedenfor viser forholdet mellem farve og Bonferonni korrigeret

p

værdier. Rød farve repræsenterer høj tillid til molekylær ensartethed mellem de respektive grupper, mens blå farve repræsenterer manglende tillid deraf.

Kaplan-Meier-overlevelse estimater for høj- og lavrisiko-patienter baseret på 28-genet model risiko forudsigelser i træningssættet (a) og 1

st validering sæt (b).

for yderligere at validere den prognostiske betydning af disse profiler, vi anvendt vores 28-gen model til en offentligt tilgængelig kohorte af patienter med tidlig fase larynxcancer [28]. På grund af tekniske variation mellem de to datasæt, 23 ud af de 28 gener af vores model blev brugt til at stratificere patienterne baseret på deres risiko for tilbagefald. På trods af de tekniske og biologiske begrænsninger (forskellige platforme, forskellige antal gener, tidlig vs all-stadie sygdom) vores model fastholdt sin prognostisk betydning. Median DFS for de grupper af patienter med ugunstig og gunstig prognose, som forudsagt af den 23-genet model, var 118 og 161 måneder henholdsvis (log-rank,

s

= 0,011, figur S1). HR for tilbagefald i højrisikogruppe versus gruppe lav risiko var 4,37 (95% CI 1,24-15,34, Wald er

s

= 0,022).

Molekylær homologi af patienter med gunstige og ugunstige prognose i uddannelse og 1

st validering sæt

Vores 28-gen profil ser ud til ikke blot være en samling af prognostiske gener, men rent faktisk at fange den underliggende biologi af tumorerne. For at demonstrere den molekylære homogenitet højrisiko-tumorer, brugte vi underklasse kortlægning (Submap), en metode, der vurderer molekylære lighed foruddefinerede grupper tilhører forskellige datasæt. Vi faktisk illustreret, at grupper af patienter med dårlig og god prognose i træningssættet aksjer de samme biologiske mønstre med de respektive grupper i valideringen sæt, udover de ekspression af specifikke gener. Diagrammer viser god “molekylær match” af høj- og lavrisiko-patienter er vist i figur 2b.

Uafhængig prognostisk betydning af 28-genet model

Vi var interesserede i at demonstrere den uafhængige prognostisk betydning af vores multigenfamilie prædiktor. Vi indgår i analysen scenen og kvalitet, er de eneste kendte prognostiske faktorer, som var til rådighed for patienterne i vores undersøgelse af data. Vi har også inkluderet strålebehandling, da det er kendt at reducere lokalt recidiv. I multivariat analyse, vores 28-gen model opretholdt borderline prognostisk betydning i en

st validering sæt. HR for tilbagefald i gruppen med høj risiko var 2,67 (95% CI 0,99-7,22, Wald er

s

= 0,05) (detaljer er vist i tabel 4).

Pathway analyse i høj- og lav-risikogrupper

for at få nogle yderligere indsigt i de biologiske processer hos patienter med gunstige og ugunstige prognose, vi udførte Gene Set Analysis (GSA). Vi udforskede gen netværk og biologiske temaer, som beskrevet af Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) Pathway Database. Vi faktisk identificeret en lang række veje, udtrykkes forskelligt mellem de to grupper af patienter (GSA Goeman globale test

p

værdier 0,01). Vi fokuserede på veje liberaliseret både i træning og i en

st validering sæt. Tabel 5 vises udvalgte veje af interesse, mens den fulde liste over veje kan findes som i tabel S2. Flere af disse veje er tidligere blevet vist at spille en vigtig rolle i hoved- og halscancer progression. Interessant vi observerede, at gener af fokal adhæsion (FA) pathway [29], vist sig at være prognostisk i vores datasæt, samt i hoved og halscancer, held stratificeret vores patienter baseret på deres risiko for tilbagefald (detaljer i figur 4 )

Kaplan-Meier sygdomsfri overlevelse estimater for høj og lav risiko patienter, som defineret af de fokale vedhæftning pathway gener (log-rank,

s

. 0,005).

Onkogene pathway aktivering mønstre i de enkelte patienter

Ud over de førnævnte sti analyseresultater, der stammer fra en vurdering patientgrupper, vi søgte at udforske pathway aktivering i individuelle patienter . Vi brugte tidligere udviklet og valideret “in vitro” genekspression “udlæsninger” til at identificere aktivering af kendte onkogene veje i hver patient af uddannelse og 1

st validering sæt. Vi undersøgte Src, Ras, p-catenin og E2F3 veje, som tidligere er blevet vist at være associeret med overlevelse i andre typer af cancer [27]. Interessant, viste vi, at patienter med dårlig prognose oftere havde tumorer karakteriseret af Ras-aktivering, odds ratio (OR) = 2,92 (95% CI 1,33-6,39, Wald er

s

0,01), mens patienter med god prognose oftere havde tumorer udviser Src og β-catenin-aktivering, OR = 4,54 (95% CI 1,64-12,50,

s

= 0,003) og 2,63 (95% CI 1,16-5,88,

s

= 0,03), hhv. Derudover udførte vi Cox proportional hazards overlevelse regression og bemærkede, at baneaktivering Ras viste sig at være associeret med dårlig prognose, HR = 2,55 (95% CI 1,19-5,45,

s

= 0,020). Src, p-catenin og E2F3 veje syntes ikke at være forbundet med DFS hos patienter med larynx cancer. Tilsvarende Kaplan-Meier-kurver er vist i figur 5. Endelig udførte vi flerdimensional analyse, herunder 28-genet model og den Ras-vejen og fandt, at prædiktor fastholdt sin uafhængige prognostisk signifikans (Walds

s

= 0,001) , som gjorde den onkogene pathway (tabel 6).

RK værdier er blevet kombineret som binære variabler for at opnå 3-skala profiler ifølge array-data. Markører som angivet. Blå og røde kurver matcher de forventede prognostiske mønstre opnået i 28-genet model for bestemte gener. Grå kurver: uklassificerede patienter (mellemliggende skala)

qPCR validering af en delmængde af gener fra den 28-genet prædiktor

De nævnte analyser blev udført ved hjælp af frisk frosset. vævsprøver. Men denne fremgangsmåde har visse metodologiske begrænsninger, når det kommer til daglig klinisk praksis. Således har vi forsøgt at validere vores multigenfamilie prædiktor hjælp qPCR på FFPE tumor vævsprøver, en lettere anvendelig metodik. Som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder, men det var muligt på pålidelig undersøge i vores FFPE prøveserie ekspressionen af ​​kun 10 af de 28 gener i den oprindelige prædiktor. De beskrivende egenskaber RQ-værdier opnået fra de informative prøver pr assay er beskrevet i tabel 7 (midler, medianer, SD, min, max). Ved første, vi forsøgte at klynge kontinuerlig RQ-værdier for alle disse gener. Men hierarkisk klyngedannelse ikke give resultater kan sammenlignes med 28-genet prædiktor på en meningsfuld måde, med de fleste af høje og lave RK-værdier grupperet i den modsatte retning (figur 6a og b). Dette var ingen overraskelse, fordi vi kun undersøgt 1/3 af generne probet i array signatur, mens fold-ændring i ekspressionen af ​​disse gener var meget smalle og kan let vendes med en anden metode (qPCR vs. arrayet hybridisering ) eller en anden type materiale (FFPE vs. frisk-frosne væv). vil være behov for detaljerede analytiske og statistiske metoder til opførslen af ​​hver qPCR assay vs. array sonde i matchede FFPE vs. frisk-frosset prøver til afklaring af denne uoverensstemmelse, men sådan en dybtgående analyse var uden for den nuværende studere. Derfor vi næste anvendt forudbestemte profilering til undersøgelse af mulige virkninger af de testede med qPCR på patient DFS gener. Til dette formål, vi forvandlet løbende RQ-værdier til binære parametre (høj /lav udtryk). Baseret på den smalle fold-change af genekspression mellem gode og dårlige prognose grupper på 28-genet prædiktor anvendte vi median RK-værdier til at klassificere høj og lav ekspression for de 10 evaluerbare gener. Log-rank test for disse gener som enkelte markører gav associationer med resultatet svarer til dem observeret for de tilsvarende gener i U133A signatur (høje /lave mønstre sammenlignelige med op- og ned-regulering af genekspression, henholdsvis for 6 af de 10 gener), hvoraf nogle var signifikant (PRKD1) eller viste en tendens til signifikans (ACE2, FLOT1) (tabel 8). Hierarkisk klyngedannelse af kontinuerlige RQ værdier for de tre sidstnævnte gener gav to grupper af patienter med signifikant forskellig DFS (figur 6c og d). Det forventede genekspression mønster var til stede i den rette sammenhæng med resultatet, men var fraværende i de fleste tilfælde. Salg

Hierarkisk klyngedannelse RQ værdier fra de testede i 2

nd validering sæt gener (FFPE prøver ). I paneler A og B, blev RQ værdier af de 10 gældende gener evalueret. To store klynger blev identificeret (a), der viste sig at have en signifikant effekt på patient DFS (b). Cluster 1 var forbundet med en bedre prognose end klynge 2. størstedelen af ​​disse gener, blev imidlertid grupperet i den modsatte retning end den, der forventes fra 28-genet klassifikator. I paneler c og d, klyngedannelse af de 3 gener med enkelte væsentlige foreninger gav 2 patientgrupper med tydelig resultat; i forhold til den oprindelige 28-gen klassificeringen, korrekte mønstre af genekspression var til stede i de tilsvarende gode og dårlige prognose grupper. Røde og grønne farver i paneler a og c betegner høj og lav udtryk, henholdsvis. Vejviser

Anvendelse af god prognose høj /lav genekspressionsmønstre til de binære forvandlet RQ-værdier afsløret ingen enkelt tumor med det forventede mønster for alle 10 gener.