PLoS ONE: En to-Gene Blodprøve for Methyleret DNA Sensitive for kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Specifikke gener methyleres med høj frekvens i kolorektal neoplasi, og kan lække ind i blod. Påvisning af flere methylerede DNA biomarkører i blod kan forbedre analysens følsomhed for kolorektal cancer (CRC) i forhold til en enkelt markering. Vi foretog en case-kontrol undersøgelse vurdere tilstedeværelsen af ​​to methylering DNA-markører,

BCAT1

IKZF1

, i omløb for at afgøre, om de var komplementære til påvisning af CRC.

Metoder

methyleringsspecifik PCR assays blev udviklet for at måle niveauet af methyleret

BCAT1

IKZF1

i DNA ekstraheret fra plasma opnået fra koloskopi-bekræftet 144 raske kontroller og 74 CRC tilfælde

Resultater

DNA udbytter varierede 2-730 ng /mL plasma. (gennemsnitlig 18.6ng /ml; 95% CI 11-26 ng /ml) og korrelerede ikke med køn, alder eller CRC-status. Methyleret

BCAT1

IKZF1

DNA blev påvist i henholdsvis 48 (65%) og 50 (68%) af de 74 cancere. I modsætning hertil kun 5 (4%) og 7 (5%) kontroller var positive for

BCAT1

IKZF1

DNA methylering hhv. En to-gen-klassificeringen model ( “enten eller” -reglen) forbedret adskillelse af CRC fra kontroller, med 57 af 74 kræftformer (77%) sammenlignet med kun 11 af 144 (7,6%) kontrol bliver positiv for

BCAT1

og /eller

IKZF1

DNA methylering. Stigende niveauer af denatureret DNA blev observeret som CRC fase skred frem.

Konklusioner

Påvisning af methylerede

BCAT1

og /eller

IKZF1

DNA i plasma kan have klinisk anvendelse som en ny blodprøve for CRC. At kombinere resultaterne fra de to methylering specifik PCR-assays forbedret CRC detektion med en minimal ændring af specificitet. Yderligere validering af denne to-gen blodprøve med henblik på anvendelse i screening er nu angivet

Henvisning:. Pedersen SK, Baker RT, McEvoy A, Murray DH, Thomas M, Molloy PL, et al. (2015) En to-Gene Blodprøve for Methyleret DNA Sensitive for tarmkræft. PLoS ONE 10 (4): e0125041. doi: 10,1371 /journal.pone.0125041

Academic Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Faculty of Medicine, CHILE

Modtaget: November 13, 2014 Accepteret: 8 marts 2015; Udgivet: 30 April, 2015

Copyright: © 2015 Pedersen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde var medfinansieret af Clinical Genomics Pty Ltd, og Commonwealth videnskabelig og industriel forskning Organisation (CSIRO). LCL, SKP, RTB, AM, DHM og MT er ansat af Clinical Genomics Pty Ltd. PLM, SM og TL er ansat af CSIRO. GPY er en betalt konsulent for Klinisk Genomics Pty Ltd. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Følgende forfattere erklærer potentiale konkurrerende interesser, at de var ansat af eller modtaget konsulenthonorarer fra Klinisk Genomics Technologies Pty. Ltd. .: LCL, SKP, RTB, AM, DHM, MT, og GPY. LCL, RTB, SKP, PLM, SM, TL er opfindere på en eller flere patentansøgninger dækker methylering DNA biomarkører, der er beskrevet i dette dokument. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en stor udfordring for folkesundheden og screening er et vigtigt redskab i kræft kontrol i lande med en betydelig CRC byrde. Men deltagelsen med screening baseret på invasiv koloskopi eller fækal sampling er lave [1]. En nylig undersøgelse af screening-alder fag understøtter den sandsynlige accept af en blodprøve for CRC med 78% af deltagerne foretrak en blodprøve for at en skammel test [2].

De seneste forbedringer i molekylære teknologier har vist, at kan detekteres tumorafledte nukleinsyrer i blod i en robust og reproducerbar måde [3]. Især er der akkumulere litteratur dokumentere cirkulerende tumorspecifik muterede og /eller methyleret DNA og RNA [4-8].

Vi har tidligere beskrevet opdagelsen og validering af en række hidtil ukendte hypermethyleret gener karakteristiske for colorectal neoplastisk væv [9]. Methylering specifikke assays designet til at detektere disse hypermethyleret gener udviste minimal signal i DNA ekstraheret fra samlet blod fra raske donorer til en delmængde af markørerne [9]. Baseret på deres relative niveauer af potentiel baggrund valgte vi to gener, forgrenet aminosyre transaminase 1,

BCAT1

, og Ikaros familie zink finger protein 1,

IKZF1

[9,10] som bly kandidater til evaluering som grundlag for en blodprøve for CRC.

Vi rapporterer evaluering af to methylering-specifikke PCR-analyser til påvisning af methylerede

BCAT1

IKZF1

DNA ekstraheret fra plasmaprøver fra 218 koloskopi overvejelse individer (144 raske kontrolpersoner og 74 CRC tilfælde) at afgøre, om de methylering biomarkører var komplementære til påvisning af CRC.

Materialer og metoder

Cases og kontroller

Blod blev opnået fra frivilligt og informeret emner planlagt til koloskopi på Flinders Medical Centre (FMC) eller Hjemsendelse General Hospital (Adelaide, SA, Australien), som gav skriftligt samtykke i overensstemmelse med de i forsøgsprotokollen gennemgået og godkendt af forsknings- og etiske komité for repatriering General Hospital og etiske komité af Flinders Medical Centre. Blod blev indsamlet af tapning efter tarm forberedelse, men forud for koloskopi. Klinisk diagnose blev fastsat på grundlag af coloskopisk resultater og histologisk vurdering. Kræft blev iscenesat efter AJCC Cancer staging 7

th edition. Yderligere plasmaprøver fra koloskopi overvejelse emner blev indkøbt fra Proteogenex Inc. CA, USA (PGX) der indsamlet blod fra frivillige 3-10 dage efter sonderende koloskopi. Prøver blev udvalgt til analyse med tilbagevirkende kraft for koloskopi-baserede diagnose. Kræfttilfælde (FMC: n = 25, PGX: n = 49) blev valgt baseret på volumen tilgængelighed, mens kontroller (FMC: n = 85, PGX: n = 84) blev udvalgt på grundlag af ikke forekomsten af ​​hyperplastiske og adenomatøs polypose (men tillader godartede tilstande såsom hæmorider og divertikelsygdom), med et forsøg på at køn alder match CRC sager til rådighed til test.

plasma forberedelse

plasma komponent fra fuldblod tappet i K

3EDTA VACUETTE rør (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland) blev isoleret ved centrifugering ved 1.500 g i 10 minutter ved 4 ° C (bremser deaktiveret på centrifuge). plasmafraktion toplaget blev hentet og centrifugering blev gentaget. Den resulterende ‘to spin “plasma blev opbevaret ved -80 ° C indtil videre anvendelse. Den samlede tid fra blod uafgjort til frysning af plasma var ikke mere end fire timer på alle rekruttering sites.

Process Controls

samlet plasma fra køns- og aldersmatchede donorer under 30 år blev kommercielt indkøbt (Bioreclamation, NY, USA) og anvendt neat som en negativ kontrol eller tilsat sonikeret fuldt methyleret humant genomisk DNA (Millipore, MA, USA), 1250pg /ml, som en positiv kontrol. Disse proceskontrol blev fremstillet som 2 liters portioner og efterfølgende opbevaret som 4 ml portioner ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Study Design

plasmaprøver blev tilfældigt behandlet i partier af 24 prøver indeholdende en positiv processtyring, én negativ proceskontrol og 22 kliniske prøver (fænotyper blindet til analyse operatører).

Isolering og bisulfit omdannelse af cellefri cirkulerende DNA

cellefri cirkulerende DNA (cfDNA) blev ekstraheret fra 4 ml plasma ved hjælp af QIAamp Cirkulerende Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Ekstraktionen blev halvautomatisk på to QIACube flydende handlere (12 prøver pr instrument pr løb) som anbefalet af producenten (Qiagen). Elueringsvolumen blev sat til 40 pi og eluatet blev igen manuelt påført på silicasøjle at forbedre cfDNA udbytte. Den EpiTect Hurtig omdannelse med bisulfit (Qiagen) blev anvendt til graensevaerdi konvertere isolerede cfDNA. Den bisulfit konverteret DNA blev oprenset på QIACube instrumentering hjælp af EpiTect Plus Bisulfite kit (Qiagen) med to modifikationer: 1) kolonner fra QIAamp Cirkulerende Nucleic Acid kit blev anvendt i stedet for kolonner tilvejebragt i Epitect Plus Bisulfite kit; 2) Epitect Plus Bindingsbuffer blev fremstillet med isopropanol i stedet for ethanol. Elueringsvolumen blev sat til 40 pi og eluatet blev igen manuelt påført på silicasøjle at forbedre cfDNA udbytte. I alt 36μL bisulfit omdannet cfDNA blev genvundet fra hver 4 ml plasma prøve. Vellykket udvinding af bisulfit konverteret cfDNA blev bekræftet på duplikat indgang af 5 pi 1: 5 fortyndet bisulfit omdannet DNA under anvendelse af et ACTB PCR-assay som tidligere beskrevet [11] med mindre modifikationer (se S1 tabel). Hver PCR-kørsel omfattede tre kontrol uden template prøver og en standardkurve baseret på en 4-fold seriefortynding af 5 ng bisulfit omdannede humane DNA isoleret fra hvide blodlegemer (WBC; Roche Applied Science, Basel, Schweiz) fremstillet i en baggrund af nuklease-frit vand (Promega, WI, USA). Massen af ​​genvundet bisulfit omdannet cfDNA for hver forarbejdet prøve blev estimeret ud fra standardkurven ved lineær regression passer til Cycle tærskel (Ct) værdier (se S1 Fig).

Påvisning af methylerede

BCAT1

og

IKZF1

DNA

Udseende af methylerede

BCAT1

IKZF1

DNA i omløb blev målt på tre eksemplarer input af 5 pi renset bisulfit omdannet DNA (f.eks tilsvarende til 0,5 ml plasma pr PCR) under anvendelse bisulfit konverterings- og methylering specifikke assays som tidligere beskrevet [9] med mindre modifikationer (se S1 tabel). Kort fortalt de to real-time PCR-analyser målrettet methylerede CpG steder i regioner spænder 102- eller 95-nukleotider, enten inden eller lige opstrøms for den første exon af

BCAT1

IKZF1

gener, henholdsvis (se S2 fig). DNA-mål forstærkning blev udført i 50 cykler i en LC480 LightCycler, Model II (Roche). Ct-værdier blev beregnet under anvendelse af en 2

nd derivat algoritme forsynet med LC480 software.

BCAT1

PCR assay (hydrolyse probe) og

IKZF1

PCR assay (SYBR grøn /smelte) blev kvalitativt kaldes “positiv” for

BCAT1

methylering hvis en total ændring i fluorescensintensitet over baggrundsniveauer blev målt inden for 50 PCR amplifikationscykler. Endvidere for

IKZF1

positive kaldelser, smelte profil analyse komponent af

IKZF1

PCR assay måtte give en smeltetemperatur på over 80 ° C (se S1 tabel). PCR-assays med intet signal blev tildelt en arbitrær Ct-værdi på 50 til grafiske formål. Hver PCR-kørsel omfattede tre uden template kontrolprøver, tre 5 ng bis-konverterede WBC DNA (Roche) negative kontrolprøver, og en standardkurve baseret på 4-fold seriefortynding af 5 ng bisulfit omdannede fuldt methyleret humant genomisk DNA (Millipore) fremstillet i en baggrund af bisulfit-omdannet WBC DNA (Roche) (se S2 fig). Hver standard punkt koncentration indeholdt i alt 5 ng DNA. De methylering specifikke assays var kvantitativt fra 20 pg (0,4%) til 5 ng (100%) af methyleret mål-DNA i en baggrund af WBC DNA (R

2 firkantede værdier:

BCAT1

, 0,9370;

IKZF1

, 0,9387, S2 fig), men i stand til at opdage ned til 5PG (svarende til 1-2 genomiske kopier) af methyleret

BCAT1

IKZF1

DNA. Massen af ​​methylerede

BCAT1

IZKF1

DNA for hver forarbejdet prøve blev estimeret ud fra standardkurven ved lineær regression passer til Ct-værdier. Massen af ​​methylerede

BCAT1

eller

IKZF1

DNA blev udtrykt som den gennemsnitlige masse (picogram, pg) af methyleret

BCAT1

eller

IKZF1

DNA pr tre eksemplarer PCR analyse eller pr mL plasma (se S2 tabel).

Sample Resultat Fortolkning

Inddrivelse af bisulfit konverterede DNA blev bekræftet, hvis mindst én gentagelse var positiv i

ACTB

qPCR assay. Den resterende bisulfit konverterede DNA blev derefter analyseret som tredobbelte input af 5 pi i enten

BCAT1

eller

IKZF1

qPCR assays. Følgende data blev indsamlet for hver forarbejdet prøve: to

ACTB

qPCR Ct målinger masse af bisulfit konverterede DNA, tre

BCAT1

qPCR Ct målinger tre methylerede

BCAT1

masse målinger, tre

IKZF1

qPCR Ct målinger og tre methylerede

IKZF1

målinger (S2 tabel). Alle PCR-amplifikation kurver blev visuelt inspiceret. Før demaskering prøve fænotyper, blev en prøve kvalitativt defineret som klinisk positive for CRC rapportering, hvis nogen af ​​tre eksemplarer på

BCAT1

eller

IKZF1

PCR-assays var positive.

Statistisk analyse

statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism v5.0d til Mac OS X (GraphPad Software, San Diego, CA). For densitet afbildninger af mængder af methylerede

BCAT1

eller

IKZF1

DNA, prøver med “Intet signal” resultater blev udeladt. Hver af de tredobbelte assays indeholdt DNA isoleret fra hvad der svarer til 0,5 ml plasma. Den empiriske tæthed af ln (methylerede

BCAT1

, pg) eller ln (methylerede

IKZF1

, pg

)

blev estimeret separat for raske kontrolpersoner, tidlig fase (fase I + II) og sent (fase III + IV) kræft. Antages en Gauss-fordeling for methylering masseværdierne (PG), til opnåelse af maksimal entropi (det værste tilfælde) med den observerede gennemsnitlige og varians blev densiteter igen estimeret. Ved hjælp af disse tætheder, vi beregnet den kumulative fordelingsfunktion (F (x) = P (X≤x)) og rapport 1-F (x) for ln (pg) denatureret

BCAT1

IKZF1

værdier på 3, 3,9 og 4,6. Vi rapporterer også sandsynligheden forhold i forhold til raske kontrolpersoner.

Resultater Salg

Isolering af cellefri DNA fra plasmaprøver

Ti individuelle batcher blev udført for at behandle de 218 plasmaprøver . Proceskontrol bekræftet ingen confounding variation i batchbehandling (data ikke vist).

ACTB

qPCR assay bekræftede vellykket inddrivelse af bisulfit omdannet DNA fra alle 218 behandlede plasmaprøver (se S3 Fig og S2 Table) og median DNA-koncentrationer i forhold til fænotype og kliniske tilstande ved indsamling er sammenfattet i tabel 1. størstedelen af ​​de udvundne DNA udbytterne var inden for en dobbelt koncentrationsområde (95% CI interval: 11.2-26.2ng /ml). Markant lavere udbytter af bisulfit konverterede DNA blev udvundet fra prøver indsamlet af FMC i forhold til de gennemsnitlige udbytter udvundet fra prøver indsamlet af PGX (median koncentrationer: FMC: 7,0 ng /mL, PGX: 17.8ng /ml, t-test p værdi 0,0001, se S3 fig). Inter-site protokolforskelle er blevet rapporteret at forårsage den stærkeste variationen i målt cirkulerende DNA-koncentrationer [12]. Vi overvåges nøje procedurer indsamling og behandling for at sikre fælles protokoller. Den eneste systematiske variation, der kan tage højde for disse kontrasterende DNA udbytter var de forskellige tidspunkter, hvor blod blev opsamlet i forhold til koloskopi. Der var ingen sammenhæng mellem mængden af ​​DNA udvundet fra plasma og klinisk fænotype (se S3 Fig) i modsætning til undersøgelser, der omfattede en højere andel af sene stadie kræft [13,14]. Desuden blev ingen korrelation observeret mellem DNA udbytte, patientens alder eller køn (data ikke vist).

Påvisning af cirkulerende methyleres

BCAT1

IKZF1

DNA

niveauerne af methylerede

BCAT1

IKZF1

DNA i bisulfit omdannet DNA udvundet fra 218 plasmaprøver blev målt ved tre eksemplarer analyse af en tilsvarende plasma volumen 0,5 ml plasma pr PCR godt. Sixty-otte af de 218 plasmaprøver var positive for enten

BCAT1

og /eller

IKZF1

methylering (tabel 1 og S2 tabel). blev ikke observeret nogen korrelation mellem assay positivitet satser og udbyttet af genvundet bisulfit omdannet cfDNA, patientens alder (figur 1) eller køn (se S4 Fig). Statistisk signifikante højere positivitet blev målt i CRC tilfælde i forhold til kontrol for både methylering assays (figur 2, p-værdier 0,0001).

BCAT1

methylering assay var positiv i 53 af de 218 analyserede prøver, herunder 48 (65%) kræft og 5 (4%) kontroller.

IKZF1

assay havde en lidt højere positivitet sats med 57 positive prøver, herunder 50 (68%) CRC sager og 7 (5%) kontroller. Stigende positivitet satser blev observeret med CRC scenen for begge mærker som vist i tabel 1. Behandlingseffekten steder var kendt for 70 af tilfældene 74 kræft (S2 tabel). Der var ingen forskel i positivitetsrater målt i proximale versus distale cancere (proximal, n = 21, 16 positiver (76%); distal, n = 49, 38 positiver (78%), t-test p-værdi: 0,9029).

korrelationskurver af gennemsnitlige Ct-signaler målt i

BCAT1

(sorte trekanter) og

IKZF1

(hvide trekanter) methylering analyser versus (A) masse af genvundet bisulfit omdannet DNA per ml plasma eller (B) alder af emner på tidspunktet for blodudtagningen. Assay replikater med “intet signal” blev tildelt den vilkårlige Ct værdien af ​​»50« for afbildningen formål.

BCAT1

(øverste panel, sorte trekanter) og

IKZF1

(bundpanel, hvide trekanter) blev methylering specifikke assays anvendes til at vurdere forekomsten af ​​cirkulerende methyleret

BCAT1

IKZF1

DNA i 218 plasmaprøver herunder 144 raske kontrolpersoner og 74 kræftformer. Mann-Whitney t-tests blev udført på beregnede positivitetsrater for hver fænotypisk klasse til at udlede P-værdier. De beregnede 95% konfidensintervaller (95% CI) er angivet.

Methylering biomarkør komplementaritet

otteogtres prøver var positive i mindst én af de to methylering assays, hvoraf kun 42 var positive for både methylering markører (41 CRC cases og en kontrol). Figur 3A viser, at et kombineret kvalitativt resultat baseret på mindst én positiv replikere i enten

BCAT1

eller

IKZF1

methylering assay produceret den højeste klassificering nøjagtighed (0,8469, 95% CI: ,7848-0,9091 ) i forhold til nogen af ​​de markører alene (

BCAT1

, 0,8070, 95% CI ,7368-,8771,

IKZF1

, 0,8135, 95% CI: 0,7448 til 0,8822). Den 2-genet klassificeringen model ( “enten eller” -reglen) havde en anslået følsomhed for CRC på 77% (95% CI: 65,8-86,0) med en specificitet på 92,4% (95% CI: 86,7-96,4, Fig 3), således forbedrer opdagelse sats kræft ved mere end 10%, med mindre end et fald i specificitet 4%. Den kombinerede to-gen assay positivitet for CRC stadier I-IV var 50%, 68%, 87% og 100% (Tabel 1).

følsomhed, specificitet og forskelsbehandling praecisionsvaerdier for

BCAT1

,

IKZF1

og kombinerede to-gen-analyser blev beregnet ved hjælp af de sande og falske positivitet satser målt i 144 raske kontrol og 74 kræfttilfælde (A) og efterfølgende plottet på Receiver Operator Karakteristisk (ROC) plads plots (B). Single-gen-analyser: En plasma prøve blev kvalitativt kaldt “positiv”, hvis mindst én PCR replikat resulteret i en Ct-signal. To-gen-analysen: En prøve blev kvalitativt kaldt “positiv”, hvis mindst én gentagelse i enten

BCAT1

eller

IKZF1

analyser produceret en Ct-værdi

Niveauer af methylerede

BCAT1

eller

IKZF1

DNA versus sygdommens sværhedsgrad

God korrelation blev observeret i cyklus-tærskel (Ct) værdier målt i prøver positive for både

BCAT1

IKZF1

DNA methylering (korrelation co-effektivitet R

2 = 0,9053, figur 4A). Hver af de tredobbelte assays indeholdt DNA isoleret fra hvad der svarer til 0,5 ml plasma. De gennemsnitlige masser af methylerede

BCAT1

eller

IKZF1

DNA målt i CRC stadie II, III og IV var signifikant højere sammenlignet med den gennemsnitlige masse af methylering målt i det begrænsede antal kontroller, der var positive (fig 4B og 4C). Forholdet mellem målte niveauer af cirkulerende methylerede

BCAT1

eller

IKZF1

DNA i plasma og kræft etape blev modelleret til at estimere sandsynligheden for kræft, da en methyleret

BCAT1

eller

IKZF1

DNA masse skøn pr tredobbelt assay. Density parceller blev estimeret (Fig 5A og 5B, brudte linjer) ved hjælp af kun positive methylering masserne for plasma af kendte fænotyper klassificeret som raske kontrolpersoner, tidlig fase kræft (fase I + II) og sent kræft (fase III + IV). De modellerede density plots, forudsat de observerede methylering niveauer blev trukket fra en normalfordeling (fig 5A og 5B, optrukne linjer), hvor der anvendes til at estimere kumulative sandsynligheder (Fig 5C) at en plasmaprøve fra en kendt klassifikation ville give en observeret kræft- afledt methylering niveau DNA lig med eller større end svarende til 20-, 50- eller 100 pg. Vi bestemt, at mindre end 8% af den positive kontrol plasmaprøver findes at indeholde mindst 20 pg af methylerede

BCAT1

eller

IKZF1

DNA, mens 63-77% af fase kræft tidligt havde 20 pg eller mere. Således sandsynligheden for en plasma prøve med ≥ 20 pg methylerede

BCAT1

eller

IKZF1

DNA at være en tidlig fase kræft er ca. 9: 1 og 210: 1, henholdsvis (tidlig fase CRC: kontrol). Endvidere et plasma prøve med 100 pg af methylerede

IKZF1

DNA er cirka 2,5 gange større sandsynlighed for at blive trukket fra et emne med sent tidspunkt CRC (fase III eller IV), end en genstand med tidlig fase CRC (fase I eller II).

(A) Korrelation plot af gennemsnitlige Ct-værdier (log (Ct)) målt ved

BCAT1

eller

IKZF1

analyser fra 144 raske kontroller (sort cirkler) og 74 CRC (hvide cirkler). PCR replikerer med noget signal blev tildelt en arbitrær Ct-værdi på 50 til afbildning formål. Square kvadranter (a) til (d) repræsenterer: (a) 15

BCAT1

negativ, men

IKZF1

positive tilfælde; (B) 42

BCAT1

IKZF1

positive tilfælde, herunder 41 kræft og en kontrol; (C) 11

BCAT1

positive, men

IKZF1

negative sager; (D) 150

BCAT1

og

IKZF1

negative sager. En lineær regressionsanalyse blev udført på 38 af 41

BCAT1

IKZF1

positive CRC sager (kvadrant b), udelade tre CRC outliers. Broken diagonale linjer angiver 95% CI rækkevidde. Den beregnede R firkantet værdi vises. Massen (ng) af methyleret

BCAT1

(B) og

IKZF1

(C) DNA blev beregnet og plottet som massen af ​​methylering pr ml plasma trukket fra 144 kontrol tilfælde, 4 trin I, 28 fase II, 23 Trin III, 8 trin IV (de 8 CRC sager med ukendt iscenesættelse udeladt). Gennemsnitlige og median masse niveauer i de fem fænotypiske klasser er angivet nedenfor graferne. Mann-Whitney t-test udført på medianværdier, ***: p-værdi 0,05, ns:. Ikke-signifikant, sammenlignet med de 144 sager raske kontrolpersoner

Den anslåede gennemsnitlige masse af (A)

BCAT1

og (B)

IKZF1

DNA i hver af de tredobbelte assays indeholder DNA isoleret fra hvad der svarer til 0,5 ml plasma fra raske kontroller (sorte streger,

BCAT1

: n = 5,

IKZF1

: n = 2 * ), tidlig fase kræft (blå linjer, fase I + II,

BCAT1

: n = 19,

IKZF1

: n = 17) og sent tidspunkt kræft (røde linier, Stage III + IV ,

BCAT1

: n = 22,

IKZF1

: n = 26) blev anvendt til at beregne de empiriske sandsynlighedsfordelinger plots, udelade nej signal ‘resultater (brudte linier). Solid linjer: Befolkning midler (μ) og standardafvigelser (σ) blev beregnet under antagelse af en normalfordeling for hver af de tre fænotypiske klassifikationer. * Fem af de syv positive

IKZF1

kontrol sager havde Ct-signaler inden for de sidste 5 PCR-cykler, derfor ingen masse skøn. (C) Akkumuleret sandsynlighed for et plasma prøve med

BCAT1

eller

IKZF1

DNA methylering niveauer lig med eller større end 20-, 50- eller 100 pg methylerede DNA kommer fra en patient med den angivne fænotypiske klassifikation; tærsklerne massen blev bestemt som arealet under kurven (fuldt optrukne linier i panel A og B) for ln (PG) værdier større end 3, 3,9 og 4,6, henholdsvis (se stiplede lodrette linier og pile) i panel A og B. Sandsynlighed nøgletal i forhold til raske kontrolpersoner er vist i parentes.

diskussion

Vi har tidligere rapporteret udvikling af to bisulfit konvertering og methylering specifik PCR-analyser anvendes til at påvise kolorektal neoplastisk specifik methylering i gen loci

BCAT1

IKZF1

[9]. Vi optimeret

BCAT1

Der er rapporteret IKZF1

methylering qPCR assays til påvisning af methylering nøgletal så lave som 0,1%, som så lave niveauer af tumor-afledte DNA i plasmaprøver fra patienter med tidligt stadium CRC [4,15]. I dette tilfælde-kontrol studie vi vise, at methylerede

BCAT1

IKZF1

DNA detekteres oftere i CRC tilfælde (65% og 68%, henholdsvis) end i koloskopi-bekræftede raske kontrolpersoner ( 4% og 5%, henholdsvis), og at de to methylering DNA-markører er komplementære (kombineret positivitet på 77% og 7,6% i CRC og raske kontrolpersoner, henholdsvis).

i alt 41/74 kræfttilfælde var positiv for både methylerede

BCAT1

IKZF1

DNA sammenlignet med kun 1/144 kontrol). Ved at kombinere resultaterne fra de to analyser resulterede i en diskriminerende nøjagtighed på 0,8469, der var bedre end enten alene assay (

BCAT1

assay: 0,807,

IKZF1

assay: 0,8135), figur 3. Overvejer en enten-eller to-gen-assayet blev detekteret flere CRC tilfælde, med en korrekt adskillelse af 57/74 (77%) og kun 11/144 (7,6%) raske kontroller bliver kategoriseret. Disse to-gen data giver overbevisende, simple beviser for, at flere biomarkører kan forbedre følsomheden uden større kompromis af diagnoseværktøj i form af lavere specificitet.

Påvisning af methylerede

BCAT1

IKZF1

DNA i blod ikke afhænge af alder eller køn af emne, eller mængden af ​​genvundet bisulfit omdannet cfDNA. En signifikant sammenhæng blev kun observeret for kliniske fænotype. Både hyppigheden af ​​påvisning og mængden af ​​methylerede

BCAT1

og /eller

IKZF1

DNA frigivet i blodet steg med kræft scene. Sidstnævnte var statistisk signifikant i trin II, III og IV kræftformer, med en højere methylering masse observeret i forhold til niveauet målt i de få positive raske kontrolpersoner (Fig 4). er også blevet bemærket Lignende observationer for velundersøgte

SEPT9

methylering assay [16,17]. Ved montering modeller af klassificering kræft (kontroller, tidlig eller sen kræft), viser vi potentialet for at bruge niveauet for methylerede

BCAT1

og /eller

IKZF1

DNA i blodet til at estimere sandsynligheden for et positivt resultat er på grund af tilstedeværelsen af ​​cancer (fig 5). Tilsammen dataene understøtter en simpel model, hvor evnen til at detektere vævsafledte DNA-markører i kredsløbet er en funktion af graden af ​​invasion af læsionen [18].

BCAT1

og

IKZF1

begge involveret i tumorvækst og invasivitet [19,20]. En hypermethyleret

BCAT1

locus er blevet påvist i flere patologier, herunder CRC [21,22] og afvigende epigenetisk regulering medfører et forhold skift i tre vigtigste

BCAT1

mRNA-transkripter afviger kun i den første exon, hvilke havne alternative utranslaterede regioner [20]. Hvordan de BCAT1 isoformer påvirker celleproliferation er ukendt, men det spekuleres, dysfunktionel produktion af forgrenet aminosyre kan påvirke syntese af makromolekyler, der er nødvendige for celledeling, måske ved G1-til-S cellecykluskontrol punkt [23].

transskription faktor,

IKZF1

, regulerer adskillige biologiske begivenheder og dens rolle i lymfopoiese og leukæmiske neoplasi er blevet grundigt undersøgt. Et netværk af epigenetiske og transkriptionsfaktorer regulere

IKZF1

geners aktivitet [24] og nye data indebærer, at

IKZF1

er også afgørende for korrekt regulering af proliferation og differentiering af celler af ikke-hæmatopoietisk oprindelse, herunder kolon [25]. Med NuRD kompleks som den vigtigste interagerende partner [26], Ikaros styrer transskriptionel aktivitet af et lille sæt af gener [23,27], herunder

notch1

[28]. Den Notch signalvej er kritisk for mange celle-til-celle-interaktioner, herunder dannelsen af ​​invadopodia [29].

SEPT9

er en negativ regulator af pseudopodia dannelse [30], som er en vigtig begivenhed, der initierer formidling celle og fremdrift i omgivelserne væv og stroma (for nylig gennemgået af [31]). Således tab af

SEPT9

udtryk kan spille en aktiv rolle i tumor invasion, hvor metastatiske tumorceller gennem dårligt forståede mekanismer migrere til karsystemet [32]. Vi spekulere, om

IKZF1

er måske en opstrøms regulator af

SEPT9

aktivitet.

Notch vej spiller en afgørende rolle i selvfornyende proces med kolon krypt stamceller og deres produktion af prolifererende og transit-forstærke udifferentierede-stamceller, som bevæger sig krypten og ind i villus, hvor de yderligere, differentiere [33,34]. Vi spekulere hvis tab af

IKZF1

aktivitet på grund af hypermethylering, fører til konstitutiv aktiv Notch signalering, som inhiberer differentiering af krypt progenitorceller og resulterer i en stor stigning i udifferentierede forbigående forstærkende celler som beskrevet tidligere [35-37].

Den øgede positivitet observeret på tværs af trin i-IV kræft indebærer, at påvisning af tumor-afledte methylerede DNA-markører i blod kan afhænge en stor del på vaskularisering af kolorektal neoplastisk væv og øget invasion i almindelighed [18,38]. Hvis det er sandt, så en standardiseret følsomhed til påvisning af tumor-afledte markører i omløb vil blive påvirket af den del af fase I kræftformer, som de fleste af fase I kræft næppe vil have nogen lymfe eller venøs fartøj invasion [18]. Som sådan, blod assays er usandsynligt, at påvise en betydelig del af tidlige fase kræftformer, der kan påvises ved koloskopi. Dette kan forklare den lave følsomhed observeret i en nylig prospektiv evaluering af

SEPT9

i 7.900 asymptomatiske deltagere, hvor der blev opdaget kun 48% af 53 CRC sager (herunder toogtyve fase I kræftformer) og 11% af adenomer [17]. Vores egen datasæt inkluderet kun fire trin I kræftformer, og mens to (50%) af disse blev opdaget, prøven tal er i øjeblikket for lavt til at konkludere, om den methylerede

BCAT1

/

IKZF1

test vil give god detektion af trin i cancere. Inddragelse af vaskulatur-relaterede variable (vaskulær invasion, vaskulær overlevelse evne og tumor angiogenese) ser ud til at forbedre lagdeling af kræftpatienter [39].