PLoS ONE: NOTCH3 induceres i Cancer-associerede fibroblaster og Fremmer angiogenese i Oral planocellulært Carcinoma

Abstrakt

Nylige undersøgelser har vist, at Notch signalering er involveret i mange typer af kræft, herunder mundtlige planocellulært karcinom ( OSCCs). Imidlertid er rollen af ​​Notch signalering i tumormikromiljøet endnu ikke fuldt forstået. I denne undersøgelse undersøgte vi roller NOTCH3 signalering i kræft forbundet fibroblaster (CAFS) i OSCCs. Immunhistokemisk undersøgelse af 93 humane OSCC sager tungen indikerede, at omkring en tredjedel af OSCCs viste NOTCH3 ekspression i CAF, og at dette udtryk signifikant korreleret med tumor-størrelse. In vitro-undersøgelse viste, at OSCC cellelinjer, især HO1-N-1-celler stimuleret NOTCH3 ekspression i normale humane dermale fibroblaster (NHDFs) gennem direkte celle-til-celle-kontakt. Immunhistokemisk og morfometrisk analyse ved hjælp af humane OSCC prøver viste, at NOTCH3 udtryk i CAF signifikant korreleret med mikro-fartøj tæthed i kræft stroma. In vitro angiogenese assays involverer co-dyrkning af NHDFs med HO1-N-1 og humane umbilical endotelceller (HUVEC’er), og NOTCH3 knockdown i NHDFs vha siRNA, viste, at HO1-N-1-celler fremmes signifikant dannelse rør afhængig NOTCH3-ekspression i NHDFs. Desuden blev NOTCH3 ekspression i CAF relateret til dårlig prognose af OSCC patienterne. Dette arbejde giver en ny indsigt i den rolle, Notch signalering i CAF forbundet med tumor angiogenese og muligheden for NOTCH3 målrettet molekylær terapi i OSCCs

Henvisning:. Kayamori K, Katsube Ki, Sakamoto K, Ohyama Y, Hirai H, Yukimori A, et al. (2016) NOTCH3 induceres i Cancer-associerede fibroblaster og Fremmer angiogenese i Oral pladecellecarcinom. PLoS ONE 11 (4): e0154112. doi: 10,1371 /journal.pone.0154112

Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Forskningscenter, SAUDI ARABIEN

Modtaget: December 28, 2015; Accepteret: April 9, 2016; Udgivet: 28 April, 2016

Copyright: © 2016 Kayamori et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information fil

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Japan Society for fremme af videnskab: Grant-in-støtte til Unge Forskere (B) (KAKENHI 26.861.543 til Kou Kayamori ) og videnskabelig forskning (C) (20.233.760 til Ken-ichi Katsube). Dette arbejde blev også støttet af Japan Society for fremme af videnskab: Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (A) (KAKENHI 25.253.098 til Akira Yamaguchi)

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerer eksisterer interesser.

Introduktion

Hoved- og halskræft stammer fra den øvre aerodigestive tarmkanalen herunder næsehulen, bihulerne, mundhulen, svælget og strubehovedet. Histopatologisk, den dominerende malignitet i hoved og hals kræft er planocellulært karcinom (SCC).

Oral SCC (OSCC) er den mest almindelige form for hoved og halscancer. Ifølge de seneste GLOBOCAN skøn, blev ca. 300.000 nye læbe /mundhulen kræftpatienter diagnosticeret i 2012 på verdensplan [1]. Det 5-års overlevelsesraten for OSCC patienter stadig spænder fra 40 til 60% [2, 3]. Undersøgelsen af ​​molekylære mekanisme, der regulerer vil være behov maligne adfærd af OSCC til udvikling af behandlingsformer og forbedring af dårlig prognose.

Cancer stroma er sammensat af forskellige typer af celler, herunder fibroblaster, immunceller, pericytter og endotel celler. Nylige undersøgelser har vist, at disse celler og deres produkter etablere passende mikromiljøer for cancerproliferation, invasion, angiogenese, metastase, og kemoresistens [4, 5]. Især cancer-associerede fibroblaster (cafeer), som er de vigtigste kræft stroma komponenter, spiller en afgørende rolle i tumor progression i forskellige typer af kræft [6]. Deres oprindelse menes at være enten væv-resident fibroblaster, mesenkymale stamceller rekrutteret fra knoglemarv, eller kræftceller, der undergik epitelial-mesenkymale overgang [7]. Flere undersøgelser har rapporteret, at CAF stimulerer kræftcelle invasion [8-10] eller proliferation [11], og korrelerer med dårlig prognose i OSCCs [12, 13].

Notch signalering er en evolutionært bevaret vej, der regulerer celledeling , apoptose og differentiering [14]. Notch signalering initieres ved binding af NOTCH-ligand til dens receptor, som medieres ved celle-til-celle-kontakt. Hos mennesker er der fire receptorer (NOTCH1-4) og fem ligander (JAGGED1, 2 og DLL1, 3 og 4). Binding af ligand til dens receptor fører til spaltning og frigivelse af det intracellulære domæne af NOTCH receptor (NiCd). NiCd translokerer fra plasmamembranen til kernen, hvilket initierer transskription af indhakket målgener [15]. Nylige undersøgelser har vist, at dysregulering af Notch signalering er involveret i forskellige sygdomme, herunder forskellige typer af cancere [16, 17]. Ændringer af Notch signalering i kræftceller omfatter gevinst eller tab af funktion mutationer, og receptor /ligand overekspression [18]. Vi har tidligere demonstreret NOTCH1 nedregulering i kræftceller i OSCC ved microarray og immunhistokemiske undersøgelser med humane OSCC prøver [19], og de seneste undersøgelser har vist, at NOTCH1 fungerer som en tumor suppressor i OSCC patogenese [20-22].

Selv om både CAF og Notch signalering spille vigtige roller i kræft progression, Notch signalering i CAF, i modsætning til kræftceller, og dens bidrag til ondartet adfærd er ikke fuldt belyst. NOTCH3 er fysiologisk udtrykt i de glatte muskelceller i små arterier og regulerer differentiering og modning af disse celler. Tab af funktion mutation af NOTCH3 har vist sig at forårsage cerebral autosomal dominant arteriopathy med subkortikale infarkter og leukoencefalopati (CADSIL), der er kendetegnet ved degeneration eller tab af vaskulære glatte muskelceller for medierne, fortykkelse af karvæggen og aflejringer af granulære osmiophilic materialer (GOM) tæt til celleoverfladen af ​​de glatte muskelceller eller pericytes [23]. Nylige undersøgelser viste, at NOTCH3 induceres i fibroblaster ved direkte celle-til-celle-kontakt med HUVEC’er og fremmer dannelse fartøj [24, 25]. Disse resultater tyder på, at NOTCH3 har en vigtig rolle i reguleringen af ​​angiogenese.

I denne undersøgelse har vi fokuseret på analyse af NOTCH3 i CAF at undersøge sit bidrag til OSCC progression. Vi viste NOTCH3 ekspression i CAF ved immunohistokemisk undersøgelse af prøver af 93 tilfælde af menneskelig tunge OSCC og fandt, at NOTCH3-positive CAF fremme tumorangiogenese i nærvær af forskellige cancercellelinier

in vitro

. Desuden er denne NOTCH3 induktion i CAF korreleret med dårlig overlevelse OSCC patienter. Disse resultater tyder på nytten af ​​NOTCH3 målrettet molekylær terapi i OSCCs.

Materiale og metoder

kliniske prøver

Primær tunge pladecellekræft prøver blev indsamlet fra 93 patienter, som havde blevet behandlet på Dental Hospital i Tokyo Medical og Dental University. Ni primære gingivale VKF, 10 buccale SCCS og 9 SCC’er af gulvet i munden blev også indsamlet. Alle væv blev fikseret med 10% neutral bufret formalin og indlejret i paraffin ifølge rutinemæssige laboratorie- protokoller. Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med den ændrede Helsinki-deklarationen og godkendt af den etiske komité i Tokyo Medicinsk og Dental University (register nr 1063). Vi brugte kirurgisk resektion, formalin-fikseret og paraffin-indlejrede humane OSCC væv til immunhistokemisk undersøgelse. Selvom skriftligt informeret samtykke ikke blev opnået fra patienterne, godkendte den etiske komité afkald på specifik informeret samtykke i overensstemmelse med ændrede etiske retningslinjer for kliniske undersøgelser, som Ministeriet for Sundhed, Labor og dyrevelfærd Japan (31 Juli 2008). Denne forskning plan blev offentliggjort i en plakat format i ambulatoriet af den mundtlige kirurgi afdeling for at sikre, at patienterne havde mulighed for at afvise forskning brug af deres patologiske prøver, der substitueret til skriftlig informeret samtykke, og etiske komité godkendt dette samtykke procedure.

Immunfarvning

For immunhistokemisk farvning, formalin-fikseret, paraffinindlejrede humane OSCC vævssnit blev brugt. De primære anvendte antistoffer var som følger: anti-NOTCH3, kanin polyklonalt, 1: 200 (ab23426, Abcam, CA, USA); anti-SMA, muse monoklonalt, 1: 100 (M0851, Dako, Glostrup, Sverige). Antigen genfinding blev udført ifølge producentens protokol. EnVision + Dual Link (Dako) blev anvendt til sekundært antistof, og farvning blev udført med diamino-benzidin substrat. For immunfluorescerende dobbelt-farvning, anti-NOTCH3, 1: 200 (Abcam), SMA, 1: 100 (muse monoklonale, M0851, Dako eller kanin monoklonale, Klon SP171, Spring Bioscinece, CA, USA), CD34, 1: 100 ( muse monoklonale, NCL-L-END, Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland) og cytokeratin, 1: 100 (muse monoklonalt, klon AE1 /AE3, M3515, Dako) blev anvendt som et primært antistof. For antigen hentning blev sektionerne behandlet med Tris-buffer (pH = 7,4) indeholdende 0,1 mg /ml trypsin i 30 min ved 37 ° C i CD34-antistof. Alexa Fluor 488 ged anti-kanin IgG (A11008, Invitrogen, CA, USA) og Alexa Fluor 594 ged anti-mus IgG (A11005, Invitrogen) blev anvendt som sekundært antistof. DAPI blev anvendt til nuklear farvning. De immunofluoroscent billeder blev taget til fange og analyseret ved hjælp Axioskop2 plus mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

Evaluering af Immunohistokemiske Analyser

De immunhistokemiske resultater for NOTCH3 og α-SMA blev evalueret på grundlag af farvningsintensitet og andelen af ​​positive fibroblastceller i cancer stroma ved to patologer uden forudgående kendskab til patientens klinisk-patologiske data. Farvningsintensitet blev opdelt i fire grupper: negativ, svage, moderate og stærke. Sager med moderat eller stærk intensitet i mere end 30% af de fibroblaster i kræft stroma blev betragtet som positive for ekspression af hvert protein.

Cell Culture

Følgende otte hoved og hals skællede celle karcinom cellelinjer, HO1-N-1, SAS, BHY, Ca9-22, HSC3, HSC4, HSC5 og SKN3 blev brugt. Disse linjer blev afledt fra mundhulen undtagen HSC5 der blev afledt af maxillary sinus. Seks cancercellelinier blev afledt fra ikke-orale læsioner, HeLa fra livmoderhalsen SCC, A549 fra lunge adenocarcinom, MCF-7 fra brystadenocarcinom, MKN74 fra gastrisk adenocarcinom, HCT-15 fra colonadenocarcinom og Panc-1 fra pancreas adenocarcinom, var også anvendes. Alle cancercellelinier blev dyrket som tidligere beskrevet [26]. HO1-N-1, SAS, Ca9-22, HSC3 og HSC5, og SKN3 blev købt fra japansk Indsamling af Research Bioressourcer (Osaka, Japan). BHY blev leveret af Dr. Masato Okamoto (Tella Inc, Tokyo, Japan). HSC4 blev etableret af Dr. Momose i afdelingen for Kæbekirurgi i Tokyo Medical og Dental universitet, som beskrevet i tidligere rapport [27]. Panc-1 blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC). HeLa, A549, MKN74 og HCT-15 blev indkøbt fra Riken Bioresource Center (Tsukuba, Japan). MCF-7 blev leveret af Cell Resource Center for Biomedical Research (Tohoku Universitet, Miyagi, Japan). Primære normale humane dermale fibroblaster (NHDFs) fra en voksen donor blev indkøbt fra Promocell (C-12302, Heidelberg, Tyskland) og primære humane umbilical vene endotelceller (HUVEC’er) blev indkøbt fra Lonza (CC-2517, Tokyo, Japan).

cokultur Analyser af kræftceller og NHDFs

NHDFs (5 × 10

4 celler /brønd) blev podet på plader med 24 brønde, rugede i fibroblast vækst Medium 2 Kit (C-23120 , Promocell) i 48 timer, og derefter dyrket sammen med forskellige cancercellelinier (5 x 10

3 celler /brønd) ved inkubering i α-MEM i 72 timer. Efterfølgende blev NHDFs isoleret ved anvendelse af følgende fremgangsmåde og vurderet under anvendelse af real-time PCR-analyse. Til Western blot-analyse, NHDFs (20 × 10

5 celler /brønd) og cancercellelinier (2 × 10

4 celler /brønd) blev dyrket sammen ved anvendelse af 6-brønds plader.

NHDF Isolation fra cokulturer

NHDFs blev isoleret fra cokulturer ved anvendelse af en magnetisk aktiveret celleseparation (MACS) systemet med anti-fibroblastmikroperler (130-050-601, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) og en MS-søjle ( 130-042-201, Miltenyi Biotec) ifølge producentens protokol.

siRNA Transfektion

Før cokultur, blev NHDFs transficeret med siRNA til human NOTCH3 ved anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens protokol. Stealth siRNA til human NOTCH3 blev købt fra Invitrogen. Sekvensen af ​​plus-strengen af ​​dsRNA’et var 5′-UCAAUGCUGUGGAUGAGCUUGGGAA-3 ‘.

mikrokar Evaluering

mikrokar densitet (MVD) af humane OSCC prøver blev beregnet for to grupper, SMA (+) NOTCH3 (-) CAF gruppen og SMA (+) NOTCH3 (+) CAF gruppe. Ved at bruge dobbelt-immunfluorescensfarvning for SMA eller NOTCH3 og CD34, antallet af CD34-positive små fartøjer i SMA (+) fibroblastisk kræft stroma blev evalueret i den førstnævnte gruppe, og antallet af CD34-positive små fartøjer i NOTCH3 (+) fibroblastisk kræft stroma blev talt i den sidstnævnte gruppe. Forud for at tælle antallet af mikrokar, vi først undersøgt hver sektion ved lav forstørring at identificere området med højeste mikrokardensitet tæthed, og udvalgt tre felter i hvert enkelt tilfælde. Tre mikrografier ved stor forstørrelse (× 200) blev taget. Antallet af CD34-positive små fartøjer blev talt, og SMA (+) /NOTCH3 (+) fibroblastisk område blev kvantitativt analyseret ved anvendelse af et Axioskop2 plus mikroskop og AxioVsion rel 4,8 software (Zeiss). Total tællinger af CD34-positive mikrokar pr total kvantificeres SMA (+) /NOTCH3 (+) fibroblastisk areal på tre billeder blev beregnet og defineret som MVD af hver enkelt sag.

In vitro angiogenese Assay

En

in vitro

endotel-fibroblast organotypisk cokultur assay blev ændret som tidligere rapporteret [28]. Første (dag 0), blev NHDFs podet på plader med 24 brønde (5,0 x 10

4 celler /brønd) og dyrket i fibroblast vækstmedium i 48 timer. Derefter blev siRNA til human NOTCH3 transficeret i de NHDFs ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåde. Den næste dag (dag 3), HO1-N-1 eller A549 cancerceller (6,0 × 10

3 celler /brønd) og HUVEC’er (3,0 × 10

4 celler /brønd) blev dyrket sammen med siRNA behandlede NHDFs i endotelcelle-vækstmedium. Dyrkningsmediet blev udskiftet hver anden dag. På dag 9 blev cellerne fikseret og immunhistokemisk behandlet med anti-CD31-antistof (monoklonalt muse-, 1: 100, NCL-CD31-1A10, Leica Biosystems, Newcastle, UK) og alkalisk phosphatase-konjugeret sekundært antistof (WP20006, Invitrogen) og signalet blev visualiseret under anvendelse af BCIP /NBT-substrat (11-681-45-001, Roche). Fem fotografi billeder med den højeste CD31-positive kapillær netværk i hver brønd blev fanget ved anvendelse af et omvendt mikroskop (ECLIPSE TS100, Nikon, Tokyo, Japan). Den CD31-positive kapillær netområde blev kvantitativt analyseret med NIH billede J software.

Effekt af NOTCH3 om Cell Proliferation

For at undersøge effekten af ​​NOTCH3 på OSCC cellelinje spredning, HO1-N- 1 blev podet (2,0 × 10

3 celler /brønd) på en plade med 96 brønde overtrukket med et rekombinant humant NOTCH3 Fc-kimær (R siCtrl). Induktionen af ​​HEY1 og α-SMA ved cokultur blev inhiberet signifikant i NHDFs transficeret med siRNA for NOTCH3 (Sin3) sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA (siCtrl) (Fig 2D, 2F og 2G). Denne Sin3 undertrykt NOTCH3 udtryk væsentligt i forhold til siCtrl (Fig 2D og 2E). Tilsammen indikerer disse data, at OSCCs har potentiale til at inducere NOTCH aktivitet ved at stimulere ekspression af NOTCH3 i NHDFs, og at NOTCH3 ekspression regulerer α-SMA-ekspression. Ovenstående NOTCH3 induktion i NHDFs blev observeret, når HO1-N-1 og NHDFs blev dyrket sammen i et direkte kontakt system. Separation co-kultur ved hjælp af en porøs transwell inducerede ikke opregulering af

NOTCH3

udtryk i NHDFs (Fig 2H). Dette resultat indebærer, at juxtacrine signalering gennem celle-til-celle-kontakt mellem cancerceller og fibroblaster er afgørende for induktionen af ​​NOTCH3 ekspression i fibroblaster. Desuden mRNA ekspressionsniveauet af NOTCH1 eller NOTCH2 i NHDFs samdyrket i en direkte kontakt-system med HO1-N-1-celler viste ingen signifikant ændring i forhold til de NHDFs dyrket alene. NOTCH4 ekspression blev ikke påvist i dette system (fig 2I). Disse resultater antyder, at OSCCs specifikt at stimulere NOTCH3 ekspression i fibroblaster

A: NHDFs blev dyrket alene (CTL, kontrol) eller samdyrket med repræsenterede orale og maxillary SCC cellelinier.. 3 dage efter cokultur blev NHDFs isoleret fra denne cokultur ved anvendelse af anti-fibroblastmikroperler til Western blot-analyse. B og C: Immunofluorostainig hjælp cokultur med HO1-N-1 og NHDFs. Dyrkning af NHDFs alene blev anvendt som kontrol. Bundterne af NOTCH3-positive NHDFs (grøn) blev observeret omkring AE1 /AE3-positve HO1-N-1 cancer reder (rød) (B). Dobbelt NOTCH3 og α-SMA-positive NHDFs blev grebet ind mellem HO1-N-1 kræft reder. Ca, HO1-N-1 cancer reder. Stiplede linjer demonstrerer grænsefladen af ​​HO1-N-1 kræft reder og NHDFs. (C). Scale bar, 100 um. Kernerne blev modfarvet ved DAPI. D-G: NHDFs transficeret med negativ kontrol siRNA (siCtrl) eller siRNA for NOTCH3 (Sin3) blev dyrket alene eller dyrket sammen med HO1-N-1-celler. 3 dage efter cokultur blev NHDFs isoleret fra denne cokultur og underkastet western blot (D) og qPCR analyser til måling NOTCH3 (E), HEY1 (F), α-SMA (G). H: NHDFs blev dyrket alene (kontrol), eller direkte dyrket sammen med HO1-N-1-celler, eller dyrket sammen med Transwell-separeret HO1-N-1-celler. 3 dage efter dyrkning blev NHDFs isoleret og underkastet qPCR analyse. I: qPCR at måle hvert indhak mRNA-ekspression i NHDFs isoleret fra cokultur med HO1-N-1-celler. ND, ikke detekteres. *

P

0,05, **

P

0.01.

NOTCH3 Udtrykt i CAF Regulerer Angiogenese

Den immunhistokemiske undersøgelse ved hjælp af humane OSCC prøver viste, at NOTCH3 udtryk i CAF signifikant korreleret med T-stadie (tumorstørrelse). Dette resultat antydede, at NOTCH3-positive CAF fremmer tumorvækst ved stimulering tumorcelleproliferation og /eller ved en forbedring angiogenese. For at undersøge disse muligheder, vi uropført en

in vitro

celledeling under anvendelse HO1-N-1 celler, som udtrykker HAK ligand JAG1 som bestemt ved Western blotting (Fig 3A). Behandling med et rekombinant humant NOTCH3-Fc /kimære, der kan binde sig til sin ligand, JAG1, påvirkede ikke HO1-N-1 proliferation (Fig 3B)

A:. JAGGED1 udtryk i forskellige orale cancer cellelinjer blev analyseret ved Western blot. B: Effekten af ​​NOTCH3 på celleproliferation. Spredningen af ​​HO1-N-1 celler med eller uden rekombinant humant NOTCH3-Fc kimære behandling blev overvåget i 72 timer.

Næste, vi gennemførte dobbelt immunfluorescensfarvning af NOTCH3 og CD34 (en markør for endotelceller ) for at bestemme, om NOTCH3 ekspression i CAF er forbundet med tætheden af ​​blodkar i humant tungen OSCC prøver. Micro-fartøj massefylde ved tumoren invasiv området blev øget betydeligt i NOTCH3 (+) CAF gruppen sammenlignet med NOTCH3 (-) CAF gruppe (figur 4A og 4B). Dette resultat antydede, at NOTCH3 (+) CAF fremmer angiogenese. For yderligere at undersøge mekanismen for sådan angiogenese, udførte vi en organotypisk angiogenese-assay ved co-dyrkning HO1-N-1-celler, HUVEC og NHDFs at bestemme, om OSCC-induceret NOTCH3 i NHDFs letter dannelse fartøj. Immunfluorescensfarvning af denne co-kultur viste en CD31-positiv meshwork dannet af HUVEC’er og NOTCH3-positive NHDFs omkring kræftcellen reder (Fig 4C). Western blot-analyse indikerede, at NHDFs dyrket sammen med HUVEC’er alene, i fravær af HO1-N-1-celler viste NOTCH3 induktion sammenlignet med kontrol NHDFs. Meget højere niveauer af NOTCH3 ekspression blev observeret i NHDFs der blev dyrket sammen med HUVEC’er sammen med HO1-N-1-celler (Fig 4D). At evaluere dannelse rør i dette assay, vi visualiseret CD31-positive celler ved immunfarvning. Sammenlignet med kontrolgruppen, CD31-positive rør-dannelse ved HUVEC’er den i nærvær af NHDFs og kontrol siRNA blev signifikant øget ved co-dyrkning med HO1-N-1. Dette rør-dannelse blev signifikant undertrykt, når de NHDFs blev transficeret med Sin3 (Fig 4E og 4F). Disse resultater antydede, at OSCCs fremmer angiogenese ved at inducere NOTCH3 ekspression i CAF

A og B: Sammenligning af mikrokar densitet (MVD) mellem NOTCH3 (-) CAF og NOTCH3 (+) cafs tilfælde.. Immunofluorostaining for α-SMA (grøn), NOTCH3 (grøn) og CD34 (rød) under anvendelse af humant tungen OSCC prøver. Ca, cancer reder. Stiplede linjer viste grænsefladen af ​​kræft reder og stroma. Pile demonstrerede CD34-positive mikrokar. Scale bar, 50 um. Kernerne blev modfarvet ved DAPI (A). Kvantitativ evaluering af MVD mellem disse to grupper (B). C-F:

In vitro

angiogenese assay dyrket sammen med HO1-N-1 celler, HUVEC’er og siRNA transficerede NHDFs. Immunofluorostaining for NOTCH3 (grøn) og CD31 (rød). Ca, HO1-N-1 cancer reder. Stiplede linjer angiver margenen af ​​HO1-N-1 kræft reder. Scale bar, 100 um. Kernerne blev modfarvet ved DAPI (C). NHDFs isoleret fra denne cokultur blev underkastet Western blot (D). Repræsentativt billede af dannelse røret ved HUVEC’er i hver tilstand. Scale bar, 100 um (E). Kvantitativ evaluering af kanaldannelse område (CD31-positive område) i hver tilstand (F). siCtrl, negativ kontrol siRNA. Sin3, siRNA for NOTCH3. **

P

0.01.

For at undersøge om NOTCH3 induktion i fibroblaster er en unik egenskab ved OSCCs, dyrket sammen vi NHDFs med cellelinjer afledt kræft i forskellige organer, herunder livmoderhalsen, lunge, bryst, mave, tyktarm, og pancreas. Western blotting-analyse viste, at A549-celler, som er en lunge adenocarcinom cellelinie, stimulerede ekspressionen af ​​NOTCH3 i NHDFs på et niveau, der var svarende til den induceret af HO1-N-1 (fig 5A). En

in vitro

angiogenese assay viste, at A549-celler signifikant induceret dannelse rør i HUVEC’er ved samtidig dyrket med NHDFs og at denne meshwork var signifikant reduceret med NOTCH3 knockdown i NHDFs (Fig 5B og 5C). Western blot analyse af NHDFs isoleret fra angiogenese-assay viste lignende resultater som dem, der opnås, når NHDFs dyrket sammen med HUVEC’er og HO1-N-1 blev analyseret (fig 5D). Disse resultater indikerer, at andre end OSCC kræftceller kan fremkalde NOTCH3 i CAF og fremme angiogenese

A:. NHDFs blev dyrket sammen med forskellige cancer cellelinjer afledt af ikke-orale læsioner. 3 dage efter cokultur blev NHDFS isoleret fra denne cokultur og underkastet Western blot-analyse til påvisning NOTCH3 og α-SMA. B-D: In vitro angiogenese assay dyrket sammen med A549, HUVEC’er og siRNA transficerede NHDFs. Repræsentative billeder af rør dannelse (B) og den kvantitative evaluering (C) i hver tilstand.