PLoS ONE: Hypoxi Integration i Serologisk ProteomAnalyse afslører tumorantigener og Fosters identifikation af anti-Phospho-eEF2 antistoffer som potentielle Cancer Biomarkers

Abstrakt

Udtrykket af tumorceller af proteiner med afvigende struktur, udtryk eller distribution udgør udvikling af et humoralt immunrespons. Autoantistoffer (AAB) rettet mod tumor-associerede antigener (TAA), kan således være særligt relevant for tidlig påvisning af kræft. Serologisk proteomanalyse (SERPA) har til formål at identificere sådanne cirkulerende AAB gennem immunblotting af 2D-separerede tumor celle proteiner med kræft patient serum og den fortløbende MS identifikation af proteiner i reaktive pletter. Denne metode har den fordel at anvende posttranslationelt modificerede proteiner som en kilde til potentiel TAA. Her har vi anvendt denne strategi ved hjælp colorektale tumorceller forud eksponeret for hypoksi for at fremme ekspressionen af ​​et mønster af TAA mere tilbøjelige til at repræsentere

in vivo

betingelser. Vi brugte to humane HCT116 og HT29 kolorektal cancer cellelinjer eksponeret i 48 timer til 1% O

2. Steder positive efter immunoblotting af 2D-separerede lysater af hypoxiske celler med sera fra tumorbærende mus, blev opsamlet og analyseret ved MS til identifikation protein. Blandt de hypoksi-specifikke immunogene proteiner, der er konstateret vi en phosphoryleret form af eukaryot translation elongeringsfaktor 2 (phospho-Thr56 eEF2). Vi bekræftede den forøgede phosphorylering af dette protein i hypoksiske colorektale tumorceller samt i muse tumorer. Ved hjælp af en specifik immunassay, kunne vi påvise tilstedeværelsen af ​​tilsvarende anti-phospho-Thr56 eEF2 AAB i serum fra tumorbærende mus (

vs

sunde mus). Vi også dokumenteret, at påvisningen af ​​disse AAB forud for påvisning af en håndgribelig tumormasse i mus og valideret tilstedeværelsen af ​​anti-phospho-Thr56 eEF2 AAB i serum fra patienter med adenomatøse polypper og colorectalt carcinom. Afslutningsvis denne undersøgelse validerer et phosphoryleret form af eEF2 som en ny TAA og mere generelt, dokumenterer, at integrere hypoxi opstrøms for Serpa tilbyder en mere relevant repertoire af TAA i stand til at afsløre tilstedeværelsen af ​​cirkulerende Aab.

Henvisning : Grandjean M, Sermeus A, branders S, Defresne F, Dieu M, Dupont P, et al. (2013) Hypoxi Integration i Serologisk ProteomAnalyse afslører tumorantigener og Fosters identifikation af anti-Phospho-eEF2 antistoffer som Potentielle Cancer Biomarkører. PLoS ONE 8 (10): e76508. doi: 10,1371 /journal.pone.0076508

Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, Japan

Modtaget: Marts 24, 2013; Accepteret: August 27, 2013; Udgivet: 10. oktober 2013 |

Copyright: © 2013 Grandjean et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fonds National de la Recherche Scientifique (FRS-FNRS), Fonds de la Recherche Scientifique Médicale (FRSM), en aktion de Recherche Concertée fra Communauté française de Belgique (ARC 09 /14-020), den universitetscenter Type Pole (IUAP program P7.03), og J. Maisin Foundation. M. Grandjean er en Fria (Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture) Research Fellow. MS facilitet i URBC-NARILIS blev støttet af FNRS (Bruxelles, Belgien). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

bidrag tumormikromiljøet til kræft progression er i dag velkendt [1]. Hypoxi er et af disse microenvironmental parametre som tegner sig for fænotypiske ændringer i tumorer [2] – [4]. lav oxygenkoncentration i tumorer skyldes en ubalance mellem udbud og forbrug af oxygen primært på grund af umodenhed tumorvaskulaturen og den hurtige cancercelleproliferation henholdsvis [5]. Som reaktion på tumor hypoxi, vil tumorceller bremse deres proteinsyntese maskiner ned, mens på samme tid, vil induktion af transkriptionsfaktorer såsom HIF (hypoxi-inducerbare faktor) fremmer specifik genekspression programmer [6], [7]. Hypoksiske tumorceller vil således udgøre en proteomprofilen særskilt af normoksiske tumorceller, med præferentiel ekspression af proteiner, der er nødvendige for at støtte adaptive mekanismer, herunder sådanne, der medfører angiogenese og glycolytiske kontakt [8] – [10]. Interessant, hypoxi spiller også en rolle i carcinogenese som følge af tidlig tumorcelleproliferation på epitheloverflader som er adskilt fra den underliggende blodforsyning ved en intakt basalmembran [11]. Også, foreslås forbindelsen mellem betændelse og kræft at integrere hypoxiske miljø på grund af den øgede metabolisme og celle omsætning mens mikrovaskulære netværk er (endnu) ikke er tilpasset [12]. Interessant nok i kolorektal carcinogenese blev adenom-carcinom sekvens rapporteret at være forbundet med induktion af HIF-1α i præmaligne læsioner [13] samt med dysplasi [14]; HIF-2α blev også rapporteret at fremme progression fra adenom til karcinom [15].

Selvom hypoxi er anerkendt som et adelsmærke af tumorer tegner sig for ændringer i tumor-fænotype, det har været så langt overvejende undervurderet som en kilde til modulation på det mønster af antigener tilbøjelige til at give anledning til et immunogent respons. Tumorassocierede antigener (TAA) beskrives som proteiner frigivet af tumorceller eller peptider eksponeret på overfladen af ​​tumorceller eller antigen-præsenterende celler ved MHC klasse I og II-molekyler, henholdsvis [16] – [19]. Mutation, trunkering, misfoldning, over-ekspression og ektopisk ekspression af proteiner i tumorceller foreslås at udgøre immunogeniciteten af ​​disse TAA [20] – [22]. Interessant autoantistoffer (AAB) rettet mod disse modificerede proteiner repræsentere potentielle biomarkører for tidlig påvisning af cancer eller endda prognose [23] – [26]. Specificiteten og stabilitet af antistoffer sammen med en relativ nem påvisning repræsenterer vigtige fordele i sammenligning med andre cirkulerende blodkomponenter [19]. Den SERPA (SEROLOGISK ProteomAnalyse) teknik udnytter adskillelsen af ​​protein lysater afledt af tumorceller på to-dimensionelle geler og træk immunoblotting anvendelse af sera indsamlet fra kræftpatienter [25], [27], [28].

Her af de grunde, der udsættes ovenfor, valgte vi at integrere hypoxi som en miljøparameter i SERPA arbejdsgang ved præ-inkubering kolorektal cancer celler i 1% O

2, med henblik på at afsløre TAA fraværende eller målbart i lysater af normoxisk tumorceller. Vi identificerede forskellige tumor- og hypoxi-specifikke antigener, herunder den phosphorylerede Thr56 form af den eukaryote elongeringsfaktor 2 (eEF2). En dedikeret immunassay blev udviklet og gjort det muligt for os at validere phospho-eEF2 som

bona fide

hypoxi-induceret TAA og tilsvarende AaB som potentielle kræft biomarkører i mus og mennesker.

Metoder

Etik Statement

Alle forsøg med mus og tumorceller modtaget godkendelse af

Comité d’Ethique Facultaire

af

Université Catholique de Louvain Hotel (UCL) ( godkendelse ID 2012 /UCL /MD005); mus undersøgelser blev udført i overensstemmelse med nationale dyr pleje regler.

Alle patienter blev indlagt på Universitair Ziekenhuis Brussel (Belgien) og gav skriftligt informeret samtykke enige med den politik af hospitalet. Dette omfatter anonym brug af resterende krop materiale til videnskabelig forskning formål i nøje overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og artikel 20.2 i den belgiske lov (19-12-2008) om indkøb og brug af menneskelige Kropslig Materialer til menneskelige medicinske anvendelser og for videnskabelig forskning. Denne artikel af lov fastslår, at samtykke til forskning brug af menneskelige biologiske materialer anses for at være givet, hvis donor ikke har meddelt indsigelse mod en sådan brug. Praktisk, alle patienter, der gennemgår koloskopi gennemgå en blodanalyse for at vurdere deres hæmogram og koagulering; denne procedure er obligatorisk at tillade endoskopisk resektion i tilfælde polypper er fundet. Ingen af ​​forfatterne var involveret i samlinger af prøver:. Resterende blodprøver blev indsamlet af en sygeplejerske og de-identificeret ved en datamanager før afsendelse til laboratoriet for den strenge formål med aktuelle undersøgelse

Celler

Menneskelig kolorektal carcinom HCT 116 og HT29-cellelinjer blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC), lagres i henhold til leverandørens anvisninger og anvendes inden 6 måneder efter genoplivning af frosne portioner. Begge cellelinier blev rutinemæssigt dyrket i McCoy 5A-medium (Invitrogen, Paisley, UK) suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika. Celler blev holdt ved 37 ° C i normoxisk (21% O

2, 5% CO

2) betingelser udsat for hypoxi (1% O

2, 5% CO

2) i en Invivo2 500 hypoxisk kammer til 48 h (Ruskinn, Belgien).

mus

mandlige 7 uger gamle NMRI mus (nu /nu) (Elevage Janvier, Le Genest Saint-Isle, Frankrig ) blev subkutant injiceret med 2.10

6 HCT116 eller HT29-celler; tumordiametre blev ugentligt sporet med en elektronisk skydelære. Sera blev indsamlet til serologiske analyser gennem retro-orbital punktur på dag 0 og hver uge, indtil tumor diameter når 8 mm. Ved afslutningen af ​​et sæt af eksperimenter blev musene aflivet, blod blev opsamlet ved intrakardielle rute, serum blev isoleret efter centrifugering ved stuetemperatur og tumorerne blev kryopræserveret.

Patienter Salg

Sera var indsamlet fra patienter, der gennemgår koloskopi for fordøjelsesproblemer klager eller til screening. Seks personer havde normal koloskopi og blev brugt som kontrol, fjorten patienter havde adenomatøs polypose og ni havde karcinom; de gennemsnitlige alder for disse tre kategorier af patienter var 71 ± 4, 67 ± 3 og 71 ± 3 år henholdsvis. Blod blev opsamlet på neutral-type rør, og efter centrifugering blev serum alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C.

2-Dimensional Elektroforese Analyse og SERPA

I ekstraktionen af ​​proteiner, normoxisk eller hypoksiske celler blev vasket med 20 mM natriumphosphat-pufret saltvand (PBS) og skrabet med DIGE mærkning (DLA) lyseringsbuffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS og 30 mM Tris, pH 8,5). Supernatanten blev derefter udvundet efter centrifugering i 10 minutter ved 10000 rpm og 4 ° C, og koncentrationen blev bestemt ved Bradford-proteinassay.

I Serpa eksperimenter blev 25 ug protein ekstrakt minimalt mærket med 200 pmol cyaninfarvestof Cy5 (Amersham GE Healthcare) i 30 minutter i mørke på is, ifølge fabrikantens protokol. Mærkning Reaktionen blev standset ved inkubation af blandingen med 10 mM lysin (Sigma Aldrich) i 10 minutter. Ikke mærkede proteiner blev tilsat for at nå i alt 250 ug af proteiner og fortyndet i en passende påsætningsbuffer (4% 3 – [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), 7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 30 mM Tris, 30 mM dithiothreitol (DTT), 1% IPG buffer 3-11 [GE Healthcare]). Prøverne blev læsset på rehydreret første dimension strimler (Immobiline DryStrip, pH 3-11 NL, 18 cm, GE Healthcare). Prøverne blev separeret på 2 dimensional gel under anvendelse af isoelektrisk fokusering i den første dimension (300 V i 3 timer, gradient trin på 1000 V i 8 timer, 8000 V i 3 timer, og 8000 V i 45 minutter ved 20 ° C med en maksimale aktuelle indstillinger for 50 uA pr strimmel) og SDS polyarcrylamide gel (10% acrylamid) elektroforese (SDS-PAGE) i den anden dimension. Proteinerne blev endeligt overført til en lav-fluorescens PVDF-membran. Membraner blev inkuberet i 2 timer i 5% fedtfri tørmælk-indeholdende Tris-buffer saltvand med 1% Tween (TTBS) blokeringspuffer og derefter eksponeret natten over ved stuetemperatur til enten kontrol eller tumorbærende mus serum i 1% ikke- fedtholdig tørmælk-holdige TTBS (fortynding 1/100). For hvert eksperiment blev en serumpulje indsamlet fra 6 forskellige mus anvendes til at sikre robustheden af ​​screeningsmetoden. Immunodetektion blev udført under anvendelse HRP-konjugeret anti-muse IgG sekundære antistoffer og ECL Plus-reagens (GE Healthcare). Membraner blev scannet på Cy5 bølgelængde på en Typhoon FLA9500 Imager (GE Healthcare) til påvisning af proteiner og ved Cy2 bølgelængde til påvisning af antistoffer, udnytte HRP-katalyseret produktion af en fluorescerende mellemprodukt emitterer ved 503 nm fra Acridan substratet indeholdt i ECL Plus reagens. For validering af Serpa eksperimenter blev membraner inkuberet med kommerciel antistof mod eEF2 (Abcam, Cambridge, UK) og HRP-konjugerede sekundære antistoffer (1/5000, Jackson Immunoresearch, Sufolk, UK).

I Gel enzymatisk nedbrydning og massespektrometri (MS) Identifikation

For prøve opsving, umærkede proteiner blev adskilt af 2D-elektroforese. 2D-geler blev fluorescens-farvet (Krypton protein plet, Pierce, Thermo Scientific) efter fiksering i en 50% vand, 40% ethanol og 10% eddikesyre-opløsning, 1 time ved stuetemperatur. Proteinerne af interesse blev automatisk hentet fra geler ved hjælp af en Ettan Spot Picker (GE Healthcare). Efter skylning 2D gel spots blev dehydreret i acetonitril ved 37 ° C. Fordøjelse blev udført natten over ved 37 ° C med trypsin (12,5 ng /ml) i 100 mM ammoniumbicarbonat. Ekstraktionen blev udført med myresyre 5% i 15 minutter ved 37 ° C. Supernatanter blev derefter anvendt til massespektrometri identifikation af proteiner med en nano-LC-ESI-MS /MS Maxis 4G UHR-TOF (Bruker). Proteiner af interesse blev identificeret takket være Mascot software (Matrix Science, www.matrixscience.com). Så NCBI redundante protein database blev søgt med pattedyr som taksonomi. Kun væsentlige hits, som defineret af Mascot sandsynlighed analyse (p 0,001), blev accepteret og Protein scores 63 blev betragtet som statistisk signifikant

Immunoblotting og Immunhistokemi

Immunobloting og immunfarvning blev udført. med antistoffer mod eEF2 (1/1000, Abcam), eller phospho-Thr56-eEF2 (1/1000, Abcam). Gel lastning blev normaliseret med actin antistof (Sigma-Aldrich). Åbenbaring blev udført med et anti-kanin IgG antistof koblet med peberrodsperoxidase (Jackson ImmunoResearch) og ECL Plus (GE). For immunkemi blev 5 um sektioner af frosne xenotransplanterede HCT116 tumorer monteret på dias for immunfarvning. Proteinphosphatase (protein phosphatase, lambda, Calbiochem) blev anvendt ifølge producentens protokol at validere specificiteten af ​​phosphoryleret immunfarvning. Efter behandling med phosphatase, blev tumorsnit probet med anti-eEF2 (1/50) eller anti-Thr56 phosphoryleret eEF2 (1/50) antistoffer og blev immunfarvet med anti-kanin-Alexa 488 (Invitrogen).

eEF2 immunoassay

Mængden af ​​cirkulerende antistoffer rettet mod phosphoryleret Thr56 eEF2 blev bestemt i en dedikeret immunoassay. 96-brønds plader (Reacti-Bind, Thermo Scientific) blev overtrukket natten over ved stuetemperatur med 10 ug /ml af en 12 aminosyre phosphoryleret peptid ifølge eEF2. Phosphopeptidet sekvens var RAGETRFTDTRK, svarende til aminosyrerne 50 til 61 i eEF2 proteinet, med en phosphorylering på Thr56 (Eurogentec). Coating og blokering trin blev udført under anvendelse af ELISA coating buffer og ELISA ultrablock (Abd Serotec) ifølge producentens instruktioner. Fortyndede sera (1/100 for mus og 1/200 for mennesker) blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Efter vask blev specifik hybridisering målt med et peroxidase-konjugeret anti-muse-IgG-antistof (fortynding 1/10 000, Jackson ImmunoResearch) og tilsætning af 3,3 ‘, 5,5’-tetramethylbenzidin (TMB, Calbiochem). Pladerne blev aflæst ved 450 nm i en VictorX4 mikropladelæser.

Statistik Salg

Resultater udtrykkes som middelværdi ± S.E.M. Studerendes

t

test og ANOVA tests blev anvendt hvor det er relevant. * P 0,05, ** P 0,01 eller *** P 0,001 blev betragtet som statistisk signifikant i de forskellige eksperimenter. For kliniske data blev sub-populationer af patienter registreres automatisk ved at køre K-midler clustering algoritme [29]; parvise sammenligninger mellem forskellige profiler inden for hver tilstand blev vurderet i henhold til en t-test, herunder Benjamini-Hochberg FDR korrektion for mangfoldigheden af ​​testen [30].

Resultater

SERPA Identifikation af eEF2 Aab i den Serum af tumor-bærende mus

for at efterligne tumor mikromiljø, blev de menneskelige kolorektale HCT116 og HT29-celler udsat for hypoxi (1% O

2) i 48 timer, et tidsinterval, der kræves til ekspression af hypoxi-inducerbare gen program på proteinniveauet og for at nå en ny ligevægt på tumorcelleproliferation. Celler opretholdes under normoxiske betingelser (21% O

2) blev anvendt som kontroller. Vi anvendte derefter SERPA teknologi til at identificere hypoxi-specifikke tumorantigener (figur 1A). HCT116 og HT29 lysater blev først separeret på gel ved 2-dimensional elektroforese og overført til membraner. Samlede sera fra kontrol eller tumorbærende mus (6 sera pr betingelse) blev derefter anvendt til at afsløre pletter svarende til immunogene proteiner. Differentiel analyse blev udført ved at sammenligne 4 forskellige betingelser: lysater fra normoksiske og hypoxiske celler probet med sera fra kontrol og tumorbærende mus (figur 1b). Denne analyse tilladt os at skille to typer pletter: (i) dem, der svarer til proteiner, der genkendes af antistoffer fra kontrol musesera og (ii) dem, der svarer til proteiner genkendes af antistoffer fra tumorbærende mus, men ikke at blive udtrykt under hypoxi. Resterende pletter af interesse blev derefter udskåret fra præparative geler, fordøjet af trypsin og analyseret ved MS (figur 2 og 3). Ved at kombinere både HCT116 og HT29 cellelinjer, fandt vi 17 proteiner med tilfredsstillende Mascot scores (p 0,001), som blev genkendt af antistoffer fra tumor-bærende mus, 4 hypoxi-specifikke proteiner og 13 svarer til proteiner udtrykt både under hypoxiske og normoxiske betingelser (se lavere paneler i figur 2 og 3). For resten af ​​denne undersøgelse, besluttede vi at fokusere på hypoxi-specifikt antigen strengt reaktivt med serum af tumor-bærende mus og identificeret af MS med den stærkeste Mascot score, nemlig eEF2 eller eukaryote forlængelse faktor 2.

A. Arbejdsgang af SERPA processen, herunder 2DE-gel separation af lysater fra enten hypoxiske eller normoksiske tumorceller, membran overførsel, immunoblotting med serummet fra enten kontrol eller tumorbærende mus, og detektion af pletter af interesse. B. Typisk immunoblotting mønstre som følge af inkubation af 2D-løst lysater af HCT116 celler eksponeret for normoxi eller hypoksi, med den angivne museserum. I bundpanelerne, er proteiner af lysaterne mærket med Cy farvestof (rød) og detekteres faste antistoffer med et anti-muse-sekundært antistof (grøn plet); pil indikerer tilstedeværelsen af ​​et protein udelukkende påvist i lysater af hypoxiske tumorceller ved antistoffer fra serum fra tumorbærende mus.

Kortlægning af pletter af interesse resultatet af den sammenligning, der er beskrevet i figur 1 og listen over identificerede proteiner (p 0,001) opnået ved brug lysater af HCT116 kolorektal kræftceller

Kortlægning af pletter af interesse resultatet af den sammenligning, der er beskrevet i figur 1 og listen over identificerede proteiner (p 0,001) opnået under anvendelse af lysater af HT29 colorectal cancerceller.

første at validere beskaffenheden af ​​eEF2 protein til stede i de 2D-geler, vi probed membranen med en kommercielt tilgængelig anti-eEF2 antistof og fundet at immunoblot signal matches lokaliseringen af ​​stedet identificeret ved SERPA analyse (figur 4A). Desuden viste dette eksperiment fordelingen af ​​proteinet ved forskellige isoelektriske punkter (figur 4A og 4B, top panel). I SERPA eksperimentet dog én plet (den tredje ifølge pI værdiområde) var immunogent (figur 4B, midterste panel), hvilket kraftigt antyder, at en post-translationel modifikation kunne give immunogenicitet.

A. Repræsentant immunblotting af 2D-separerede lysater af hypoxiske HCT116 celler med en kommerciel antistof mod eEF2. Proteiner af lysaterne er mærket med Cy farvestof (rød) og sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (grønne pletter). Positivt signal opnås for flere pletter af samme molekylvægt, men som afviger ved deres pI værdi. B. Sammenligning af eEF2 pletter detekteret med et kommercielt antistof mod total eEF2 (øverst), serum fra tumorbærende mus (i midten) og en kommerciel antistof mod phospho-Thr56 eEF2 (nederst). Spot 4 (længst til højre spot) svarer til ikke-phosphoryleret form af eEF2 mens de andre pletter svarer til multi-phosphorylerede former af proteinet; spot 3 (anden plet fra højre) svarer til den foretrukne monophosphorylated form af eEF2 (på Thr56).

Phosphorylering af Thr56 eEF2 efter Hypoxi i Human tyktarmskræft celler

Siden phosphorylering af eEF2 vides at forekomme som reaktion på hypoxi (fører til eEF2 inaktivering og arrestationen af ​​protein oversættelse) undersøgte vi omfanget af eEF2 fosforylering på Thr56 tidligere beskrevet som den første og vigtigste rest modificeret af en fosfat gruppe i eEF2 sekvens [31]. Re-probing 2D membran anvendes til SERPA bekræftede, at stedet genkendt af serum fra tumorbærende mus også blev positivt farvet med et kommercielt anti-phospho-Thr56 eEF2 antistof (figur 4B, nedre panel). Vi har også bekræftet i konventionelle vestlige blotting eksperimenter, eEF2 fosforylering på Thr56 blev forøget betydeligt i hypoxiske HCT116 celler (p 0,01), og at en lignende tendens blev observeret i HT29-celler (figur 5A og 5B). Også injektionen af ​​HCT116 celler i mus førte til udviklingen af ​​en tumor med en robust farvning af phospho-Thr56 eEF2 bekræfter forekomsten af ​​dette post-translationel modifikation

in vivo

(figur 5C, øverste panel). Behandlingen af ​​tumor sektioner med fosfatase lambda helt ophævede farvningen opnået med et kommercielt anti-phospho-eEF2 antistof (figur 5C, nederste panel).

A. Repræsentant eEF2 og phospho-Thr56 eEF2 immunoblotting af HCT116 og HT29 dyrket i 48 timer under hypoxi (Hx) eller opretholdes i normoxi (Nx). B. Normaliseret ekspression af phospho-Thr56 eEF2 i normoxisk vs hypoxisk HCT116 og HT29-celler; n = 3, ** p 0,01 C. repræsentant phospho-Thr56 eEF2 immunfarvning af sektioner af HCT116 tumorer i fravær (øverst) eller tilstedeværelsen (nederst) af phosphatase lambda; Bemærk fuldstændig forsvinden af ​​den phosphorylerede form af eEF2 ved behandling med phosphatase.

Validering af Phospho-Thr56 eEF2 som en tumor-associeret antigen og af de tilsvarende AAB som biomarkør for Mouse Tumor vækst

for yderligere at undersøge immunogeniciteten af ​​phospho-Thr56 eEF2, udviklede vi et assay til at undersøge tilstedeværelsen af ​​AAB reaktive mod et phosphopeptid af 12 aminosyrer flankerende Thr56, svarende til aminosyrerne 50 til 61, (figur 6A). Vi valideret lineariteten af ​​denne immunoassay under anvendelse af samme kommercielle anti-phospho-Thr56 eEF2 antistof som beskrevet ovenfor (figur 6B). I et første sæt eksperimenter anvendte vi en pulje af 6 sera fra mus, der bærer store tumorer (dvs. 28 dage efter implantation) og fundet en 10 gange højere signal end ved anvendelse kontrolsera (figur 6C). I et andet sæt eksperimenter, udført vi et tidsforløb undersøgelse for at bestemme de ændringer i phospho-Thr56 eEF2 signal ifølge udviklingen af ​​HCT116 tumorer. Sera blev opsamlet ved retro-orbital punktur i mus på dag 0 og efter 7, 14 og 21 dage efter injektion af HCT116 tumorceller; tumorvækst blev målt parallelt med en elektronisk skydelære (figur 6D). Som vist i figur 6E, blev phospho-Thr56 eEF2 signal allerede væsentligt forøget på dag 7 (p. 0,05

vs

dag 0), mens på dette tidspunkt, ikke tumoren endnu var påviseligt (. Fig 6D) . På dag 14 og 21, omfanget af phospho-Thr56 eEF2 signal steg yderligere parallelt med væksten af ​​HCT116 tumorer (figur 6D og 6E).

A. Humane og muse aminosyresekvenser af eEF2 i regionen Thr56. De 12 rester svarende til det syntetiske peptid (phosphoryleret på Thr56) anvendt i vores immunoassay er indikeret (rød ramme); Bemærk den perfekte identitet mellem muse og humane sekvenser. B. Påvisning af kommerciel anti-phospho-Thr56 eEF2-antistoffer under anvendelse af vores immunoassay; stiplede linjer viser 95% konfidensinterval for den lineære regression. C. Påvisning af anti-phospho-Thr56 eEF2 AAB i serum fra kontrol- eller HCT116 tumorbærende mus (n = 3). *** P 0,001. D. Tidsforløb for HCT116 tumorvækst som bestemt ved målinger af tumordiametre (n = 7 per gruppe). E. Påvisning af anti-phospho-Thr56 eEF2 AAB på det angivne tidspunkt for HCT116 tumorprogression. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 (n = 6-7 pr gruppe). Bemærk, at på dag 7 efter implantation, tumorer er ikke detekterbare (se felt D), men et positivt signal detekteres i immunoassay. F. Graph repræsenterer detektionen af ​​anti-phospho-Thr56 eEF2 AAB i serum fra kontrolindivider (n = 6) og patienter med adenomatøse polypper (n = 14) eller carcinom (n = 9). * P 0,05, ** P 0,01. Notatet K-betyder clustering identificeret to subpopulationer af patienter (se sorte og røde symboler) blandt personer diagnosticeret med adenomatøs polypose (P 0,001) og carcinoma (P 0,01); samme partition blev observeret i 100 uafhængige kørsler ved at variere den tilfældige initialisering af K-betyder algoritme.

Anti-phospho Thr56 eEF2 autoantistoffer identifiy Sub-populationer af patienter med colonadenom og Carcinoma

Vi endelig undersøgt potentialet i påvisning af anti-phospho-eEF2 antistoffer til at skelne kontrolpersoner og patienter med enten adenomatøs polypper eller kolorektal cacinoma. På grund af identiteten af ​​sekvenser mellem mus og menneske eEF2 i resterne flankerende Thr56 (se figur 6A), anvendte vi den samme immunassay til patienter som den er beskrevet ovenfor for tumorbærende mus. Vi fandt, at patienter diagnosticeret med adenomatøse polypper og carcinomer viste en stigning i phospho-Thr56 eEF2 Aab titer (P = 0,0015) sammenlignet med patienter identificeret som negative følgende koloskopi (figur 6F). Desuden ved brug af K-midler clustering algoritme (29), to sub-populationer af patienter kunne identificeres blandt de adenomatøs polypose (P 0,001) og carcinoma grupper (P 0,01). (Se røde symboler i figur 6F)

diskussion

de to vigtigste resultater af denne undersøgelse er (i) at hypoxi regnskab for ændring af immunoproteome som det fremgår af påvisning af cirkulerende AAB rettet mod TAA målbart i tumorceller dyrket under normoxisk betingelser, og (ii) at hypoxi-medierede stimulering af eEF2 phosphorylering regnskab for udviklingen af ​​en tidlig Aab reaktion på kolorektal kræft udvikling.

AaB er i dag anerkendt som potentielle kræft biomarkører og SERPA blev udviklet for at registrere dem fra serum enheder gennem blotting af 2DE-separerede tumor cellelysater. Den SERPA teknologi, i modsætning til SEREX og fagdisplay, muliggør påvisning af proteiner, der har undergået post-translationelle modifikationer. Men proteomet i lysater isoleret fra tumorceller dyrket i en konventionel inkubator under normoxi er langt fra at repræsentere proteom af tumorceller i deres

in vivo

mikromiljø. Især hypoxi er kendetegnende for mange kræftformer som følge af uligevægt mellem O

2 forbrug og O

2 ledige i dårligt vaskulariserede tumorer. Virkningen af ​​hypoxi på tumor celle transkriptomet og proteomanalyse er dobbelt: mens den globale translationelle maskineri bremses til reservedele energi, specifikke gen programmer reguleret af centrale transkriptionsfaktorer såsom HIF familien, induceres til at tillade tumorceller tilpasning [6] . Vigtigere er det, i epitel kræftformer såsom kolorektal cancer, foreslås også hypoxi at forekomme tidligt under carcinogenese. Mutant celler faktisk oprindeligt adskilt fra de underliggende blodkar ved stadig intakt basalmembran: dette fører til udvikling af præmaligne læsioner i avaskulære regioner og på vej mod det modsatte, mindre begrænsede områder [11]

I. den aktuelle undersøgelse, vi derfor brugt to analytiske filtre at vælge potentielle TAA for yderligere validering. Først, vi udelukkede pletter identificeret på 2D membraner efter immunblotting med serum opsamlet fra kontrol mus. For det andet, vi ikke overveje for at vælge de proteiner detekteret af serum af tumor-bærende mus, men kun udtrykt i normoksiske tumorceller. Denne strategi lov til at reducere antallet af falsk positive resultater, og at favorisere detektion af specifikke TAA som stødt i

in vivo

betingelser. Vi brugte to forskellige kolorektale cancer cellelinier (P53-vildtype HCT116 og P53, mutant HT29) for yderligere at øge mangfoldigheden af ​​proteom, og især af immunoproteome. Denne strategi førte til identifikation af i alt 17 formodede TAA, 13 udtrykkes under både hypoxi og normoxi og 4 er udelukkende udtrykkes under hypoksi (se figur 2 og 3). Blandt de sidstnævnte, fokuserede vi på den eukaryote oversættelse elongeringsfaktor 2 (eEF2), en væsentlig faktor for ribosomal mRNA translation. Hypoxi er kendt for at fremme eEF2 inaktivering for at blokere den høje energi-forbrugende proteinsyntese proces for at spare energi [9]. Inaktivering af eEF2 skyldes dens phosphorylering på Thr56 af den eukaryote elongeringsfaktor 2 kinase (eEF2K) gennem en række forskellige mekanismer, der involverer mTOR, AMPK og PHD2 [32] – [34]. Vi faktisk identificeret denne phosphorylerede form af eEF2 som det immunogene protein. Skønt adskillige phosphoryleringssteder er rapporteret for eEF2 som det fremgår af de fire pletter med forskellig pI detekteres af en total eEF2 antistof, placeringen af ​​den positive plet i SERPA pegede phospho-Thr56 eEF2 som seroreactive enhed. Den anden position fra højre er faktisk kompatibel med den foretrukne phosphoryleringssted tidligere rapporteret at være Thr56 i en kinetisk undersøgelse af reguleringen af ​​eEF2 [31]. Vi derefter bekræftet ved hjælp af en immunoassay med en modificeret peptid phosphoryleret på Thr56 rest, at denne region tegnede sig for immunogenicitet eEF2 som påvist i vores SERPA undersøgelse. Anvendelse af dette assay fandt vi, at anti-phospho-Thr56 eEF2 AAB var påviselige i museserum før tumorer kunne være håndgribelig. fandt også, vi at kunne påvises disse AaB i mennesker med adenomatøs polypper og tarmkræft.