PLoS ONE: Tumor-Targeting Salmonella typhimurium A1-R i kombination med trastuzumab Eliminerer HER-2-positive cervikal kræftceller i Patient-Afledt musemodeller

Abstrakte

Vi har tidligere udviklet musemodeller af HER-2-positive livmoderhalskræft. Tumorer i nøgne mus havde histologiske strukturer ligner den oprindelige tumor og blev farvet af anti-HER-2-antistof i det samme mønster som patientens cancer. Vi har også tidligere udviklede tumor målretning

Salmonella typhimurium

A1-R og har vist sin effektivitet mod patient-afledte tumor musemodeller, både alene og i kombination. I den aktuelle undersøgelse, vi bestemt effekten af ​​

S

.

typhimurium

A1-R i kombination med trastuzumab på en patient-cancer nøgen-musemodel af HER-2 positiv livmoderhalskræft. Musene blev randomiseret i 5 grupper og behandlet som følger: (1) ingen behandling; (2) carboplatin (30 mg /kg, ip, ugentlig, 5 uger); (3) trastuzumab (20 mg /kg, ip, ugentligt, 5 uger); (4)

S

.

typhimurium

A1-R (5 × 10

7 CFU /krop, ip, ugentligt, 5 uger); (5)

S

.

typhimurium

A1-R (5 × 10

7 CFU /krop, ip, ugentligt, 5 uger) + trastuzumab (20 mg /kg, ip, ugentligt, 5 uger). Alle regimer havde signifikant effekt sammenlignet med de ubehandlede mus. Den relative tumor volumen af ​​

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab-behandlede mus blev mindre i forhold til trastuzumab alene (p = 0,007) og

S

.

typhimurium

A1-R alene (p = 0,039). Ingen signifikant kropsvægttab blev fundet i forhold til ingen behandling gruppe bortset carboplatin-behandlede mus (p = 0,021). Ved histologisk undersøgelse blev levedygtige tumorceller ikke opdaget, og erstattet af stromale celler i tumorer behandlet med

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at

S

.

typhimurium

A1-R og trastuzumab i kombination er meget effektiv mod HER-2-udtrykkende livmoderhalskræft

Henvisning:. Hiroshima Y, Zhang Y, Zhao M, Zhang N, Murakami T, Maawy A, et al. (2015) Tumor-Målretning

Salmonella typhimurium

A1-R i kombination med trastuzumab Eliminerer HER-2-positive cervikal kræftceller i Patient-Afledt musemodeller. PLoS ONE 10 (6): e0120358. doi: 10,1371 /journal.pone.0120358

Academic Redaktør: Juri G. Gelovani, Wayne State University, USA

Modtaget: 26 september, 2014 Accepteret: Januar 20, 2015; Udgivet: 5 Juni 2015

Copyright: © 2015 Hiroshima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle data underliggende resultaterne i denne undersøgelse er frit tilgængelige i papiret. Eventuelle spørgsmål kan rettes til forfatterne ([email protected])

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet delvist af National Cancer Institute tilskud numre CA CA132971 og CA142669 og JSP’er KAKENHI tilskud numre 26.830.081 til YH, 26.462.070 til IE og 24592009 til KT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Yong Zhang Ming Zhao og Nan Zhang er medarbejdere i AntiCancer Inc. Yukihiko Hiroshima, Takashi Murakami, Mako Yamamoto, Shinji Miwa, shuya Yano, og Robert M. Hoffman er ubetalte datterselskaber af AntiCancer Inc. Sumiyuki Mii, Fuminari Uehara, Masashi Momiyama og Takashi Chishima var tidligere afdelinger af AntiCancer Inc. Robert M. Hoffman er en PLoS ONE Editorial Board medlem. AntiCancer Inc. markedsfører dyremodeller for kræft. Der er ikke andre konkurrerende interesser. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Livmoderhalskræft er den anden mest almindelige kræftform hos kvinder [1]. Der var 454,000 tilfælde og 200.000 dødsfald i 2010 på verdensplan og 11.000 nye tilfælde og 3.870 dødsfald som følge livmoderhalskræft i USA [2, 3]. Paclitaxel, carboplatin, cisplatin, bleomycin, mitomycin-C, vincristin og irinotecan anvendes til livmoderhalskræft [4]. Der er imidlertid ingen standardbehandling for cervikal cancer.

Forekomsten af ​​HER-2 positivitet i livmoderhalskræft blev rapporteret fra 1% til 21% [5], og overekspression af HER-2 er blevet forbundet med mere fremskredne stadier og en dårligere prognose [6, 7].

Vi har tidligere udviklet musemodeller af HER-2-positive patient livmoderhalskræft [8]. Vores laboratorium har også tidligere udviklet en genetisk modificeret bakteriestamme,

Salmonella typhimurium

A1-R, valgt til tumor målretning in vivo.

S

.

typhimurium

A1-R er auxotrof for leu og arg [9]. Stammen mål og vokser i tumorer. I modsætning hertil er normalt væv ryddet af disse bakterier, selv i immundefekte athymiske mus.

S

.

typhimurium

A1-R er effektiv mod prostatakræft [10], brystkræft [11, 12], pancreascancer [13-16], gliom [17, 18], lungecancer [19], fibrosarkom [ ,,,0],20, 21], osteosarkom [22] og ovariecancer [23].

i den foreliggende undersøgelse, demonstrerer vi effekten af ​​

S

.

typhimurium

A1-R i kombination med trastuzumab på musemodeller af patient livmoderhalskræft udtrykker HER-2.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev udført med et anticancer Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) -protokol specifikt er godkendt til denne undersøgelse, og i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er beskrevet i National Institute of Health guide for pasning og anvendelse af dyr under Assurance Number A3873 -1. For at minimere enhver lidelse af dyrene blev anvendt anvendelsen af ​​bedøvelse og analgetika for alle kirurgiske eksperimenter. Dyrene blev bedøvet ved intramuskulær injektion af en 0,02 ml opløsning af 20 mg /kg ketamin, 15,2 mg /kg xylazin og 0,48 mg /kg acepromazinmaleat. Svaret fra dyr under operationen blev overvåget for at sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi. Ibuprofen (7,5 mg /kg oralt i drikkevandet hver 24. time i 7 dage efter kirurgi) blev anvendt for at tilvejebringe analgesi postoperativt i de kirurgisk behandlede dyr. Dyrene blev observeret dagligt og humant aflives ved CO

2 inhalering, da de mødtes følgende humane endpoint kriterier: udmattelse, hudlæsioner, betydelig krop vægttab, åndedrætsbesvær, næseblod, roterende bevægelse og kropstemperatur dråbe. Anvendelsen af ​​dyr var nødvendig for at forstå den in vivo-effektivitet, især anti-metastatisk virkning af de testede midler. Dyrene blev anbragt med ikke mere end 5 pr bur. Dyrene blev anbragt i en barriere facilitet på en højeffektiv partikler luft (HEPA) -filtered rack under standardbetingelser af 12-timers lys /mørke-cykler. Dyrene blev fodret en autoklaveret laboratorium gnaver kost (Supp. Information S1).

Dyr

Kvinde athymiske (

nu /nu

) nøgne mus (AntiCancer, Inc., San Diego, CA), 4-6 uger gamle, blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev holdt i en barriere facilitet under HEPA filtrering. Mus blev fodret med autoklaveret laboratorium gnaver kost. Alle mus kirurgiske procedurer og billeddannelse blev udført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injektion af en 0,02 ml opløsning af 20 mg /kg ketamin, 15,2 mg /kg xylazin og 0,48 mg /kg acepromazinmaleat. Alle dyr blev udført med et anticancer Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) -protokol specifikt er godkendt til denne undersøgelse, og i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er beskrevet i National Institute of Health Guide for pasning og anvendelse af dyr under Assurance Number A3873-1.

Prøvetagning

patienten forudsat skriftligt informeret samtykke og tumor prøve blev indkøbt under godkendelsen af ​​Institutional Review Board fra University of California i San Diego.

Subkutan implantation af patient livmoderhalskræft

tumorvæv blev opnået fra HER-2-positive livmoderhalskræft patient på kirurgi og skåret i fragmenter (3-mm

3) og transplanteres subkutant i nøgne mus [ ,,,0],8].

tissue histologi

Tumor væv blev fjernet sammen med omgivende normale væv ved resektion. Vævene blev fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin før sektionering og farvning. Vævssnit (3 um) blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i en ethanol-serien. Hematoxylin og eosin (H Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) ved 4 ° C natten over. Bindingen af ​​primære antistoffer blev påvist ved anvendelse af anti-kanin sekundære antistoffer og et avidin /biotin /peberrodsperoxidasekompleks (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) i 30 minutter ved stuetemperatur. De mærkede antigener blev visualiseret med DAB kit (DAKO Cytomation). Endelig blev snittene modfarvet med hematoxylin og undersøgt med et BH-2 mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) forsynet med en INFINITY1 2,0 megapixel CMOS digitalkamera (Lumenera Corporation, Ottawa, Canada). Alle billeder blev erhvervet ved hjælp INFINITY ANALYSÉR software (Lumenera Corporation) uden post-erhvervelse forarbejdning.

Behandling af patient livmoderhalskræft vokser i nøgne mus

Seks uger efter implantation, musene blev randomiseret til 5 grupper og behandlet som følger: (1) ingen behandling; (2) carboplatin (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA, 30 mg /kg, ip, ugentlige, 5 uger); (3) trastuzumab (Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA, 20 mg /kg, ip, ugentligt, 5 uger); (4)

S

.

typhimurium

A1-R (5 × 10

7 CFU /krop, ip, ugentligt, 5 uger); og (5)

S

.

typhimurium

A1-R (5 × 10

7 CFU /krop, ip, ugentligt, 5 uger) + trastuzumab (20 mg /kg, ip, ugentligt, 5 uger) blev administreret samtidig. Hver behandling arm omfattede 6 tumor-bærende mus. Tumorstørrelse blev vurderet hver 3 eller 4 dage ved caliper-målinger samt den omtrentlige volumen af ​​tumoren blev beregnet ved anvendelse af formlen 4 /3π (d /2)

2 D /2; hvor d er mindre tumor akse og D er den største tumor akse. Legemsvægt af musene blev målt på en balance hver 3 eller 4 dage. Relativ tumorvolumen og kropsvægt blev beregnet ved sammenligning med dag-1 værdier. Tumorer blev afbildet med et Canon EOS 60D digitalkamera med et EF-S18-55 IS objektiv (Canon, Tokyo, Japan) og høstet til analyse.

Evaluering af histopatologiske svar

Histopatologisk reaktion på kemoterapi blev defineret i henhold til Evans indplacering ordningen: Grade i, lidt ( 10%) eller ingen tumor celle ødelæggelse er indlysende; Grad II a, destruktion af 10% -50% af tumorceller; Grade II b, destruktion af 51% -90% af tumorceller; Grad III, få ( 10%) levedygtige forekommende tumorceller er til stede; Grade IV, ingen brugbare tumorceller er til stede [24, 25].

Statistisk analyse

PASW Statistics 18,0 (SPSS, Inc.) blev anvendt til alle statistiske analyser. Final tumor volumen (på dag-36) i hver behandlingsgruppe blev sammenlignet med den ubehandlede kontrol ved hjælp af en 2-tailed Students

t

-test. En p-værdi på ≤ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant for alle sammenligninger.

Resultater og Diskussion

Histologi af den oprindelige tumor er bevaret i muse

Sheet-lignende vækst uden kirtel dannelse og stromale væv med fibroblastisk proliferation, som trængte ind i reder af cancerceller blev observeret i H E-farvede del af den oprindelige patient tumor. (B) Stor forstørrelse foto af (A). (C) immunfarvet snit af den oprindelige patient tumor ved anvendelse af anti-HER-2-antistof. (D) Stor forstørrelse foto af (C). (E) H (2) carboplatin: 1,02 ± 0,43; (3) trastuzumab: 1,23 ± 0,50; (4)

S

.

typhimurium

A1-R: 0,54 ± 0,40; (5)

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab: 0,08 ± 0,04 (figur 2A). Alle regimer havde signifikant effekt sammenlignet med de ubehandlede mus. Den relative tumor volumen af ​​

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab-behandlede mus var mindre end med trastuzumab behandling alene (p = 0,007) eller

S

.

typhimurium

A1-R behandling alene (p = 0,039) (fig 2A).

(A) Vækst kurver af det subkutane tumor behandlet med forskellige stoffer. Værdierne er middelværdier relative tumorvolumener ± standardafvigelse (søjler) af fem forskellige tumorer. * P 0,05, ** p 0,01. (B) Kropsvægt kurver fra musene med de subkutane tumorer behandlet med de angivne lægemidler. Værdierne er middelværdi relative kropsvægte ± S.D. (søjler) af fem forskellige mus

Den relative kropsvægt på dag-36 sammenlignet med dag-1, i hver gruppe var som følger: (1) ingen behandling:. 1,13 ± 0,14; (2) carboplatin: 0,93 ± 0,06; (3) trastuzumab: 1,04 ± 0,22; (4)

S

.

typhimurium

A1-R: 1,09 ± 0,06; (5)

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab: 1,00 ± 0,08. Ingen signifikant kropsvægttab blev fundet i forhold til de ubehandlede mus, bortset carboplatin-behandlede mus (p = 0,021) (figur 2B).

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab kombinationen udrydder HER-2-positive livmoderhalskræft celler i mus som observeret i histologiske snit

Histopatologisk respons på behandlingen blev defineret i henhold til Evans indplacering ordningen. I vævssnit fra ubehandlede mus blev talrige cancerceller observeret (fig 3F). Ca. 30% af de kræftceller blev ødelagt og erstattet af stromaceller i væv sektioner fra mus behandlet med carboplatin (Fig 3G). Halvfjerds procent af cancerceller blev ødelagt i vævssnit fra mus behandlet med trastuzumab (Fig 3H). Tres procent af kræftceller blev ødelagt i vævssnit fra mus behandlet med

S

.

typhimurium

A1-R (fig 3I). I vævssnit fra mus behandlet med

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab, levedygtige kræftceller blev ikke påvist, og blev erstattet af stromale celler (Fig 3J). Den ubehandlede kontrol blev bedømt som kvalitet I; carboplatin behandling som IIa; trastuzumab behandling som IIb;

S

.

typhimurium

A1-R behandling som IIb; og

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab behandling som III-IV. Disse resultater tyder på,

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab-kombinationen kan udrydde HER-2-positive livmoderhalskræft hos mus.

(A) Ubehandlet kontrol. (B) carboplatin-behandlede mus. (C) trastuzumab-behandlede mus. (D)

S

.

typhimurium

A1-R-behandlede mus. (E)

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab-behandlede mus. Disse billeder blev opnået på dag-36. Scale barer: 10 mm. Histopatologisk respons på behandlingen blev defineret i henhold til Evans indplacering ordningen. Behandlingseffekt af ubehandlet kontrol (F) blev bedømt som grad I; carboplatin (G) som IIa; trastuzumab (H) som IIb;

S

.

typhimurium

A1-R (I) som IIb; og

S

.

typhimurium

A1-R + trastuzumab (J) som III-IV. Scale barer:. 200 um

Mekanismerne i den stærke effekt af kombinationen af ​​

S

.

typhimurium

A1-R og trastuzumab mangler at blive belyst. En medvirkende faktor kunne være mulighed for

S

.

typhimurium

A1-R til at stimulere (lokkedue) cellecyklus af hvilende, resistente celler, som derefter begynder at cykle og blive følsomme over for trastuzumab [26]. Efter at have fundet den stærke effekt af kombinationen af ​​

S

.

typhimurium

A1-R og trastuzumab i subkutane modeller, fremtidige eksperimenter vil udnytte ortotopisk modeller, ved hjælp af den kirurgiske ortotopisk implantation (SOI) metode vores laboratorium har udviklet til patientens tumorer [27-32]. Adgang for

S

.

typhimurium

A1-R til ortotopisk tumorer er tidligere blevet påvist ved os [8-24]. Adgang til trastuzumab terapi i ortotopisk modeller er allerede blevet demonstreret af os så godt [33]. De orthothopic modeller af en række HER-2 positive og blandet HER-2 udtrykker livmoderhalskræft vil tillade effektivitetsforsoegene af kombinationen af ​​

S

.

typhimurium

A1-R og trastuzumab mod primær og metastatisk sygdom og yderligere karakterisering af stromale og kræftceller før og efter behandling, samt virkningerne af leukocyt-nedbrydende regimer efter eller før behandling. SOI kræver operation, og da ketamin kan påvirke immunsystemet, vil forskellige bedøvelsesmidler blive sammenlignet for nogen effekt på behandling respons i fremtidige eksperimenter.

Tak

Dette papir er dedikeret til mindet om AR Moossa , MD